Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Resumo

microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Resumo

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA, levando à insuficiência renal terminal. Nos últimos anos, o envolvimento de microRNAs (miRNAs) tem sido relatado na patogênese da nefropatia por IgA. No entanto, não há um método estabelecido para perfilar miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais. Portanto, desenvolvemos um método confiável para analisar miRNA no rim de um modelo de camundongo IgA (camundongo HIGA). O objetivo deste protocolo é detectar os níveis alterados de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA quando comparados com os níveis em rins de camundongos controle. Em resumo, esse método consiste em quatro etapas: 1) obtenção de amostras de rim de camundongos HIGA; 2) purificação do RNA total das amostras de rim; 3) sintetizar DNA complementar a partir de RNA total; e 4) reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos com sucesso os níveis de expressão de vários miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nos rins de camundongos HIGA. Este novo método pode ser aplicado a outros estudos de perfil de miRNAs na nefropatia por IgA.

Introdução

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA na região mesangial glomerular renal ^1,2. É a mais comum das glomerulonefrites primárias e leva à insuficiência renal terminal em 20%–40% dos pacientes². A causa ainda é desconhecida, mas infecção mucosa persistente tem sido implicada ^1,3. Corticosteroides, imunossupressores e inibidores do sistema renina−angiotensina têm sido propostos como métodos terapêuticos^1,3, mas não estão completamente estabelecidos ³. Portanto, mais pesquisas são necessárias para esclarecer a etiologia e os métodos terapêuticos do tratamento da nefropatia por IgA.

microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que desempenham um papel importante na regulação da expressão gênica ^4,5. Há relatos de que os miRNAs estão envolvidos na patogênese de várias doenças, e alguns têm sido identificados como biomarcadores e agentes terapêuticos^{da doença4,5}. Nos últimos anos, uma associação entre miRNAs e a patogênese da nefropatia por IgA também tem sido relatada ^2,6,7. Por exemplo, demonstrou-se que o miR-148b está envolvido em anormalidades estruturais da IgA em pacientes com nefropatia por IgA ^2,6,7, enquanto o miR-148b e o let-7b foram documentados como novos biomarcadores para detecção de nefropatia por IgA⁷. Embora a compreensão dos efeitos dos miRNAs na nefropatia por IgA possa ajudar a elucidar melhor a etiologia e o tratamento 2, métodos padrão para o perfil de miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais ainda não foram estabelecidos².

Desenvolvemos um método simples e confiável para medir os níveis de expressão de miRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). O camundongo HIGA é uma cepa ddY característica, apresentando um nível particularmente alto de IgA sérica e deposição anormal de IgA em glomérulos renais 8,9,10,11. Portanto, camundongos HIGA podem ser usados como modelo de nefropatia por IgA^em camundongos 8,9,10,11. Nosso método consiste em quatro etapas principais: primeiro, a obtenção cirúrgica de amostras de rim de camundongos HIGA; segundo, homogeneizar amostras e purificar o RNA total usando uma coluna de spin baseada em membrana de sílica; terceiro, sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de RNA total usando transcrição reversa; e quarto, detecção dos níveis de expressão de miRNA por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). A justificativa para esse método e a confiabilidade dos resultados são baseadas em relatos anteriores^12,13. Mostramos que esta é uma técnica útil para medir com precisão os níveis de expressão de miRNA em um modelo de nefropatia por IgA em camundongos, e que poderia ser usada para facilitar pesquisas futuras sobre miRNAs na nefropatia por IgA.

Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e estão em conformidade com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. Obtenção de amostras de rins de camundongos HIGA

NOTA: Camundongos HIGA apresentam fenótipo estável de nefropatia por IgA após 25 semanas de idade 8,9,10,11. Camundongos Balb/c devem ser selecionados como grupo controle 8,9,10,11. Camundongos HIGA fêmeas com 25 semanas de idade (n = 10) e fêmeas Balb/c de 25 semanas de idade (n = 10) foram obtidos. É necessário determinar o número de camundongos necessários para experimentos com antecedência. Esta etapa requer cerca de 7 a 8 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos Balb/c.

1. Prepare estes itens: camundongos HIGA (25 semanas, fêmea), camundongos Balb/c (25 semanas, fêmea), aparelho de anestesia inalatória, isoflurano, folha de cortiça, pino, solução salina tamponada com fosfato (PBS), seringas de injeção, agulhas, tesoura cirúrgica e pinça.
2. Anestesiar um rato HIGA utilizando 4%–5% de isoflurano com aparelho de anestesia inalatória e montá-lo na posição dorsal sobre a folha de cortiça com pinos. Ajustar a concentração de isoflurano para 2%–3% como dose de manutenção após a indução da anestesia.
   NOTA: A profundidade da anestesia é mantida em um nível no qual a dor associada ao procedimento invasivo é completamente eliminada. Em particular, a concentração de isoflurano deve ser ajustada para 4-5% ao excisar tecidos como o tórax. Depilação e pomada ocular não são essenciais. Não é necessário montar o mouse em uma almofada de aquecimento se o procedimento puder ser realizado rapidamente.
3. Faça uma incisão de 3 a 4 cm na linha média da parede abdominal do camundongo com tesoura cirúrgica e pinça e identifique cuidadosamente ambos os lados do rim.
4. Incisar as costelas e o diafragma com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de incisar o átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo até que a cor do rim mude para amarelo pálido (este procedimento significa que todo o corpo do rato é perfundido com PBS.)
5. Corte a artéria renal, a veia renal e o ureter e remova o rim. Divida o rim em pedaços de 30 mg para uso na próxima etapa.
   NOTA: A patologia da nefropatia por IgA envolve principalmente o glomérulo no córtex renal (parte externa do rim). Embora seja difícil distinguir macroscopicamente e completamente o córtex e a medula, é desejável coletar principalmente a parte externa do rim. Essas amostras podem ser armazenadas a –80 °C por vários meses.

2. Purificação do RNA total de amostras de rim

NOTA: Nesta etapa, o kit de isolamento de miRNA disponível comercialmente é usado para a extração de RNA total. Além disso, a coluna de spin de trituração de biopolímero é usada. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. O kit de isolamento de miRNA contém uma coluna de spin à base de membrana de sílica, reagentes de lise à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem de guanidina/etanol (tampão de lavagem 1), tampão de lavagem com etanol (tampão de lavagem 2) e água livre de nuclease. Esta etapa requer cerca de 3 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.

1. Preparar os seguintes itens: tubos coletores de 1,5 ou 2,0 mL, etanol 100%, clorofórmio, homogeneizador de silício, micropipetas, ponteiras de pipeta, centrífuga, coluna de spin trituradora de biopolímero, coluna de spin à base de membrana de sílica, reagentes de lise à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem guanidina/etanol (tampão de lavagem 1), tampão de lavagem com etanol (tampão de lavagem 2) e água livre de nuclease.
2. Homogeneizar amostras de 30 mg de rim utilizando um homogeneizador de silício e 700 μL do reagente de lise à base de fenol/guanidina à temperatura ambiente.
   NOTA: Os miRNAs na amostra são vulneráveis até que tenham sido expostos ao reagente de lise à base de fenol/guanidina, portanto, essas etapas devem ser executadas imediatamente.
3. Transfira o lisado para a coluna de spin trituradora de biopolímero e centrifuga-o a 15.000 x g por 2 min à temperatura ambiente.
4. Adicionar 140 μL de clorofórmio ao filtrado e misturar vigorosamente durante 15 s. Deixe por 2–3 min, depois centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 15 min.
5. Transfira suavemente o sobrenadante transparente sem tocar a camada intermediária para um novo tubo coletor e adicione o volume determinado (veja abaixo) de etanol 100%. Vórtice por 5 s.
   NOTA: É necessário etanol a 100% a 1,5x o volume do sobrenadante obtido.
6. Transferir a amostra (limite superior de 700 μL) para uma coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a amostra à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.
7. Adicionar 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a coluna à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.
8. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar-a à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.
9. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar-a à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.
10. Centrifugar novamente a coluna de spin à base de membrana de sílica sem adicionar nada para remover qualquer etanol adicional, a 15.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Deite fora o filtrado após a centrifugação.
11. Troque o tubo conectado à coluna de rotação para um novo tubo de coleta.
12. Adicionar 30 μL de água livre de nucleases à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a 8.000 x g por 1 min à temperatura ambiente.
    NOTA: A solução resultante de 30 μL contém uma alta concentração de RNA total. Esta amostra pode ser armazenada a –80 °C durante vários meses.

3. Síntese de cDNA a partir do RNA total

NOTA: Nesta etapa, um kit de transcrição reversa disponível comercialmente é usado. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. Este kit contém mistura de ácidos nucleicos, mistura de transcriptase reversa e tampão. Este procedimento deve ser realizado em gelo para evitar o progresso da reação. Esta etapa requer cerca de 3 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.

1. Preparar os seguintes itens: tubos de coleta de 1,5 mL, tubos de tira de oito poços, micropipetas, ponteiras de pipeta, espectrofotômetro, água livre de nucleases, gelo, mistura de ácidos nucleicos, mistura de transcriptase reversa, tampão e termociclador.
2. Medir a concentração de RNA total usando um espectrofotômetro. Em seguida, calcule o volume necessário de água livre de nucleases para que 12 μL contenham 1 μg de RNA total.
3. Preparar uma mistura principal com os seguintes conteúdos: 2,0 μL de mistura de ácidos nucleicos, 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa e 4,0 μL de tampão para um total de 8,0 μL por amostra.
4. Adicionar 8 μL da mistura principal a cada poço de tubos de tira de oito poços.
5. Diluir o ARN total no volume de água livre de nucleases calculado em 3.2. Em seguida, adicione 12 μL da solução de RNA total (contendo 1 μg de RNA total) a cada poço de tubos de tira de oito poços.
6. Incubar a amostra em tubos de tira de 8 poços a 37 °C durante 60 minutos utilizando o termociclador. Em seguida, incubar a 95 °C por 5 min usando o termociclador.
   NOTA: A solução após incubação contém uma alta concentração de cDNA.
7. Transfira esta solução para um tubo de 1,5 ml e adicione 200 μL de água isenta de nucleases.
   NOTA: Os 200 μL de solução resultantes podem ser usados para qRT-PCR como um modelo de cDNA. Esta amostra pode ser armazenada a –80 °C por cerca de 1 ano.

4. qRT-PCR de miRNA

NOTA: Nesta etapa, um kit de PCR disponível comercialmente é usado. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. Este kit contém mistura de PCR, primer universal e água livre de nuclease. As amostras devem ser preparadas em duplicata e a precisão dos resultados deve ser considerada em cada caso. Os níveis de expressão de miRNA são quantificados pelo método ΔΔCT. Esta etapa requer cerca de 4 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.

1. Prepare os seguintes itens: tubo de coleta de 1,5 mL, placa de reação de 96 poços, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, micropipetas, pontas de pipeta, mistura de PCR, primer universal, água livre de nuclease, primers específicos para miRNA e um instrumento de PCR em tempo real.
2. Preparar a mistura mestra com os seguintes conteúdos: 12,5 μL de mistura de PCR, 2,5 μL de primer universal, 1,25 μL de primer específico para miRNA 5 μM e 6,25 μL de água livre de nuclease para cada poço.
   NOTA: Neste ensaio foram utilizados primers específicos para miRNAs [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p]. RNU6-2 foi utilizado como controle endógeno¹⁴.
3. Adicionar 22,5 μL da mistura mestra a cada poço da placa de reação de 96 poços.
4. Adicionar 2,5 μL de cDNA preparado na etapa 3.7 ao poço individual da placa de 96 poços.
5. Cubra a placa de reação de 96 poços com filme de adesão e, em seguida, centrifugue a 1.000 x g por 30 s.
6. Execute o instrumento PCR em tempo real. Programe o instrumento de PCR da seguinte forma: ativação inicial a 95 °C por 15 min, depois 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 15 s, anelamento a 55 °C por 30 s e extensão a 70 °C por 30 s.
7. Quantificar a expressão gênica usando o método ΔΔCT. Os níveis relativos de expressão são determinados como 2^–ΔΔCT.
   NOTA: Curvas de amplificação de PCR anormais devem ser consideradas para exclusão dos resultados.

Resultados

Nós investigamos os níveis de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA (n=10). Este resultado foi obtido completamente baseado no protocolo descrito. Os rins de camundongos Balb/c foram selecionados como controle (n=10). Em ambos os grupos, foram selecionadas idades de 25 semanas. Apenas camundongos fêmeas HIGA estavam disponíveis no fornecedor. Os níveis de expressão de três miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p; Gráfico 1) foram detectados, os quais foram previamente...

Discussão

Conseguimos medir os níveis de expressão de miRNAs nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA) usando este novo método. A nefropatia por IgA é uma doença inexplicada que necessita de mais pesquisas para esclarecer sua etiologia e alvos^{terapêuticos1,3}. No entanto, a obtenção de amostras de rim humano é altamente invasiva. Essa nova técnica é vantajosa na medida em que permite o estudo da nefropatia por IgA em pequenos a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer