면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

요약

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

초록

면역 글로불린 A (IgA) 신 병증은 IgA의 비정상적인 침착을 특징으로하는 원발성 사구체 신염의 일종으로 말기 신부전을 유발합니다. 최근에, IgA 신병증의 발병기전에서 microRNA(miRNAs)의 관여가 보고되었다. 그러나 작은 동물 모델을 사용하여 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 확립된 방법은 없습니다. 따라서 IgA 마우스 모델(HIGA mouse)의 신장에서 miRNA를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 대조군 마우스의 신장 수준과 비교할 때 HIGA 마우스의 신장에서 miRNA의 변경된 발현 수준을 감지하는 것입니다. 간단히 말해서, 이 방법은 4개의 단계로 구성된다: 1) HIGA 마우스로부터 신장 샘플을 얻고; 2) 신장 샘플로부터 총 RNA를 정제하는 단계; 3) 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 4) miRNA의 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR). 이 방법을 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 여러 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p)의 발현 수준을 성공적으로 검출했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

서문

면역글로불린 A(IgA) 신병증은 신장 사구체 간질 영역 ^1,2에 IgA가 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원발성 사구체신염의 일종입니다. 원발성 사구체신염 중 가장 흔하며 환자의 20%-40%에서 말기 신부전을 유발한다². 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 지속적인 점막 감염이 연루되어 있다 ^1,3. 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 레닌-안지오텐신계 억제제가 치료 방법으로 제안되었으나 ^1,3 완전히 확립되지는 않았다 ³. 따라서 IgA 신증 치료의 병인 및 치료 방법을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

microRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다 ^4,5. miRNA는 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 일부는 질병 바이오마커 및 치료제로 확인되고 있다 ^4,5. 최근에, miRNA와 IgA 신병증의 발병기전 사이의 연관성이 또한 보고되었다 ^2,6,7. 예를 들어, miR-148b는 IgA 신병증^환자에서 IgA의 구조적 이상에 관여하는 것으로 나타났^으며, miR-148b 및 let-7b는 IgA 신병증을 검출하기 위한 새로운 바이오마커로 기록되었다⁷. IgA 신병증에 대한 miRNA의 효과를 이해하면 병인과 치료법을 더 명확히 하는 데 도움이 될 수 있지만², 소동물 모델을 사용하여 IgA 신증에서 miRNA를 프로파일링하는 표준 방법은 아직 확립되지 않았습니다².

본 발명자들은 본원에서 IgA 신병증 마우스 모델 (HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 HIGA 마우스는 특히 높은 수준의 혈청 IgA 및 신장 사구체에 IgA의 비정상적인 침착을 나타내는 특징적인 ddY 균주이다 8,9,10,11. 따라서, HIGA 마우스는 IgA 신증^{마우스 모델로} 8,9,10,11을 사용할 수 있다. 우리의 방법은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다 : 첫째, HIGA 마우스에서 외과 적으로 신장 샘플을 채취합니다. 둘째, 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 이용하여 시료를 균질화하고 전체 RNA를 정제하는 단계; 셋째, 역전사를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 단계; 넷째, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA의 발현 수준을 검출하는 것이다. 이 방법의 이론적 근거와 결과의 신뢰성은 이전 보고서^12,13을 기반으로합니다. 우리는 이것이 IgA 신병증 마우스 모델에서 miRNA 발현 수준을 정확하게 측정하는 데 유용한 기술이며 IgA 신병증에서 miRNA에 대한 향후 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

동물 실험은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침을 준수합니다.

1. HIGA 마우스에서 신장 샘플 채취

참고: HIGA 마우스는 생후²⁵주 후에 IgA 신병증의 안정적인 표현형을 나타낸다 ^8,9,10,11. Balb/c 마우스는 대조군 8,9,10,11로 선택해야 합니다. 25주령의 암컷 HIGA 마우스(n=10)와 25주령의 암컷 Balb/c 마우스(n=10)를 얻었다. 실험에 필요한 마우스의 수를 미리 결정할 필요가 있습니다. 이 단계는 10 마리의 HIGA 마우스와 10 마리의 Balb / c 마우스의 샘플 크기에 대해 약 7-8 시간이 필요합니다.

1. HIGA 마우스(25주령, 암컷), Balb/c 마우스(25주령, 암컷), 흡입 마취 장치, 이소플루란, 코르크 시트, 핀, 인산염 완충 식염수(PBS), 주사 주사기, 바늘, 수술용 가위 및 겸자.
2. 흡입 마취 장치와 함께 4%-5%의 이소플루란을 사용하여 HIGA 마우스를 마취하고 핀을 사용하여 코르크 시트의 등쪽 위치에 장착합니다. 마취 유도 후 유지 용량으로 이소플루란의 농도를 2%-3%로 조정합니다.
   참고: 마취 깊이는 침습적 시술과 관련된 통증이 완전히 제거되는 수준으로 유지됩니다. 특히, 이소플루란 농도는 흉부와 같은 조직을 절제할 때 4-5%로 조정되어야 합니다. 제모와 눈 연고는 필수적이지 않습니다. 절차를 신속하게 수행 할 수있는 경우 가열 패드에 마우스를 장착 할 필요가 없습니다.
3. 수술 용 가위와 집게로 마우스 복벽의 정중선을 3-4cm 절개하고 신장의 양쪽을 조심스럽게 확인하십시오.
4. 수술용 가위와 집게로 갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다(이 절차는 마우스의 전신에 PBS가 관류됨을 의미합니다).
5. 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단하고 신장을 제거하십시오. 다음 단계에서 사용하기 위해 신장을 30mg 조각으로 나눕니다.
   참고: IgA 신병증의 병리학은 주로 신장 피질(신장 바깥 부분)의 사구체를 침범합니다. 피질과 수질을 거시적으로 완전히 구별하는 것은 어렵지만 주로 신장의 바깥 부분을 수집하는 것이 바람직합니다. 이 샘플은 –80°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. 신장 샘플에서 총 RNA 정제

참고: 이 단계에서는 시중에서 판매되는 miRNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 또한, 바이오폴리머-파쇄 스핀 컬럼이 사용된다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. miRNA 분리 키트에는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.

1. 1.5 또는 2.0mL 수집 튜브, 100% 에탄올, 클로로포름, 실리콘 균질화기, 마이크로피펫, 피펫 팁, 원심분리기, 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물.
2. 실온에서 실리콘 균질화기와 700μL의 페놀/구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg 신장 샘플을 균질화합니다.
   참고: 샘플의 miRNA는 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 노출될 때까지 취약하므로 이러한 단계를 즉시 수행해야 합니다.
3. 용해물을 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 2분 동안 15,000 x g 에서 원심분리합니다.
4. 여과액에 클로로포름 140μL를 넣고 15초 동안 세게 혼합합니다. 2-3분 동안 그대로 둔 다음 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
5. 중간층을 건드리지 않고 맑은 상청액을 새 수집 튜브로 부드럽게 옮기고 결정된 부피(아래 참조)를 100% 에탄올에 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이.
   참고 : 얻은 상청액 부피의 1.5 배에서 100 % 에탄올이 필요합니다.
6. 시료(상한 700μL)를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼으로 옮기고 시료를 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.
7. 700 μL의 세척 완충액 1을 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 첨가하고 컬럼을 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.
8. 세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.
9. 세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.
10. 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 다시 원심분리하여 에탄올을 추가로 제거하고, 실온에서 1분 동안 15,000 x g 에서 별도의 에탄올을 제거한다. 원심분리 후 여과액을 버리십시오.
11. 스핀 컬럼에 부착된 튜브를 새 수집 튜브로 변경합니다.
12. 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하고 실온에서 1분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다.
    참고: 생성된 30μL 용액에는 고농도의 총 RNA가 포함되어 있습니다. 이 샘플은 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

3. 전체 RNA에서 cDNA 합성

참고: 이 단계에서는 시판되는 역전사 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물 및 완충액이 포함되어 있습니다. 이 절차는 반응의 진행을 방지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.

1. 다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 8웰 스트립 튜브, 마이크로피펫, 피펫 팁, 분광 광도계, 뉴클레아제가 없는 물, 얼음, 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물, 완충액 및 열 순환기.
2. 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물의 필요한 부피를 계산하여 12μL에 1μg의 총 RNA가 포함되도록 합니다.
3. 다음과 같은 내용으로 마스터 믹스를 준비합니다: 2.0 μL의 핵산 혼합물, 2.0 μL의 역전사효소 혼합물 및 4.0 μL의 완충액을 총 8.0 μL로 샘플당 추출합니다.
4. 8μL의 마스터 믹스를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.
5. 3.2에서 계산된 뉴클레아제가 없는 물의 부피로 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12μL(총 RNA 1μg 포함)를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.
6. 열 순환기를 사용하여 37°C에서 60분 동안 8웰 스트립 튜브에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 열 순환기를 사용하여 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
   참고: 배양 후 용액에는 고농도의 cDNA가 포함되어 있습니다.
7. 이 용액을 1.5mL 튜브에 옮기고 뉴클레아제가 없는 물 200μL를 추가합니다.
   참고: 생성된 200μL 용액은 qRT-PCR에 주형 cDNA로 사용할 수 있습니다. 이 샘플은 –80°C에서 약 1년 동안 보관할 수 있습니다.

4. miRNA의 qRT-PCR

참고: 이 단계에서는 시판되는 PCR 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 PCR 혼합물, 범용 프라이머 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 샘플은 이중으로 준비해야하며 각 경우에 결과의 정확성을 고려해야합니다. miRNA의 발현 수준은 ΔΔCT 방법에 의해 정량화된다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 4시간이 필요합니다.

1. 다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 마이크로피펫, 피펫 팁, PCR 믹스, 범용 프라이머, 뉴클레아제가 없는 물, miRNA 특이적 프라이머 및 Real-Time PCR 기기.
2. 각 웰에 대해 PCR 믹스 12.5μL, 범용 프라이머 2.5μL, 5μM miRNA 특이적 프라이머 1.25μL, 뉴클레아제가 없는 물 6.25μL의 내용물로 마스터 믹스를 준비합니다.
   참고: 이 분석에서는 miRNA[RNA, U6 Small Nuclear 2(RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p]에 특이적인 프라이머를 사용했습니다. RNU6-2는 내인성 대조군¹⁴를 사용하였다.
3. 22.5 μL의 마스터 믹스를 96 웰 반응 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
4. 단계 3.7에서 제조된 cDNA 2.5μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.
5. 96웰 반응 플레이트를 접착 필름으로 덮은 다음 1,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
6. Real-Time PCR 기기를 실행합니다. PCR 기기를 다음과 같이 프로그래밍합니다: 95°C에서 15분 동안 초기 활성화, 94°C에서 15초 동안 40회 변성, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 70°C에서 30초 동안 연장.
7. ΔΔCT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 상대적 발현 수준은 2^–ΔΔCT로 결정됩니다.
   참고: 비정상적인 PCR 증폭 곡선은 결과에서 제외하는 것을 고려해야 합니다.

결과

우리는 HIGA 마우스(n=10)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 조사했습니다. 이 결과는 설명된 프로토콜에 따라 완전히 얻어졌습니다. Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 선택했습니다(n=10). 두 그룹 모두에서 25주령을 선택했습니다. 암컷 HIGA 마우스만 공급업체에서 구입할 수 있었습니다. 3개의 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p, 및 miR-21-5p; 그림 1) IgA 신병증과 관련이 있는 것으로 이전에 보?...

토론

우리는 이 새로운 방법을 사용하여 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있었습니다. IgA 신병증은 원인 및 치료 목표를 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요한 설명할 수 없는 질병이다 ^1,3. 그러나 인간 신장 샘플을 얻는 것은 매우 침습적입니다. 이 새로운 기술은 작은 동물을 이용한 IgA 신병증의 연구를 가능하게...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer