İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Özet

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

Özet

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, IgA'nın anormal birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğine yol açar. Son yıllarda IgA nefropatisinin patogenezinde mikroRNA'ların (miRNA'lar) tutulumu bildirilmiştir. Bununla birlikte, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkarmak için belirlenmiş bir yöntem yoktur. Bu nedenle, bir IgA fare modelinin (HIGA fare) böbreğindeki miRNA'yı analiz etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün amacı, HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA'ların değişmiş ekspresyon seviyelerini, kontrol farelerinin böbreklerindeki seviyelerle karşılaştırıldığında tespit etmektir. Kısacası, bu yöntem dört adımdan oluşur: 1) HIGA farelerinden böbrek örnekleri almak; 2) böbrek örneklerinden toplam RNA'nın saflaştırılması; 3) toplam RNA'dan tamamlayıcı DNA'nın sentezlenmesi; ve 4) miRNA'ların kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR). Bu yöntemi kullanarak, HIGA farelerinin böbreklerindeki birkaç miRNA'nın (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p) ekspresyon seviyelerini başarıyla tespit ettik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkaran diğer çalışmalara uygulanabilir.

Giriş

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, renal glomerüler mezangial bölgede anormal IgA birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür ^1,2. Primer glomerülonefritin en sık görülenidir ve hastaların% 20-40'ında son dönem böbrek yetmezliğine yol açar². Nedeni hala bilinmemekle birlikte kalıcı mukozal enfeksiyon ^1,3 ile ilişkilendirilmiştir. Kortikosteroidler, immünsüpresanlar ve renin-anjiyotensin sistemi inhibitörleri terapötik yöntemler olarak önerilmiştir^1,3, ancak tam olarak belirlenememiştir³. Bu nedenle, IgA nefropatisinin etiyolojisini ve tedavi yöntemlerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

mikroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan küçük, kodlamayan RNA'lardır ^4,5. miRNA'ların çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığı bildirilmiştir ve bazıları hastalık biyobelirteçleri ve terapötik ajanlar olarak tanımlanmıştır ^4,5. Son yıllarda miRNA'lar ile IgA nefropatisinin patogenezi arasında bir ilişki olduğu da bildirilmiştir ^2,6,7. Örneğin, miR-148b'nin IgA nefropatisi ^2,6,7 olan hastalarda IgA'nın yapısal anormalliklerine dahil olduğu gösterilirken, miR-148b ve let-7b^, IgA nefropatisi ^7'yi saptamak için yeni biyobelirteçler olarak belgelenmiştir. MiRNA'ların IgA nefropatisi üzerindeki etkilerini anlamak, etiyolojiyi ve tedaviyi daha fazla aydınlatmaya yardımcı olabilir², küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkarmak için standart yöntemler henüz oluşturulmamıştır².

Burada, bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için basit ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. HIGA faresi, özellikle yüksek serum IgA seviyesini ve böbrek glomerüllerinde anormal IgA birikimini gösteren karakteristik bir ddY suşudur 8,9,10,11. Bu nedenle, HIGA fareleri bir IgA nefropati fare modeli 8,9,10,11 olarak kullanılabilir. Yöntemimiz dört ana adımdan oluşmaktadır: Birincisi, HIGA farelerinden cerrahi olarak böbrek örnekleri elde etmek; ikincisi, numunelerin homojenleştirilmesi ve silika membran bazlı bir spin sütunu kullanılarak toplam RNA'nın saflaştırılması; üçüncüsü, ters transkripsiyon kullanarak toplam RNA'dan tamamlayıcı DNA'nın (cDNA) sentezlenmesi; ve dördüncüsü, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile miRNA'nın ekspresyon seviyelerinin saptanması. Bu yöntemin gerekçesi ve sonuçların güvenilirliği önceki raporlara dayanmaktadır^12,13. Bunun bir IgA nefropatisi fare modelinde miRNA ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için yararlı bir teknik olduğunu ve IgA nefropatisindeki miRNA'lara yönelik gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deneyleri, Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygundur.

1. HIGA farelerinden böbrek örnekleri alınması

NOT: HIGA fareleri, ^8,9,10,11 yaşından sonra 25 haftalıktan sonra stabil bir IgA nefropatisi fenotipi gösterir. Balb/c fareler kontrol grubu 8,9,10,11 olarak seçilmelidir. 25 haftalık dişi HIGA fareleri (n = 10) ve 25 haftalık dişi Balb / c fareleri (n = 10) elde edildi. Deneyler için gerekli olan fare sayısını önceden belirlemek gerekir. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 Balb / c fareden oluşan bir örneklem büyüklüğü için yaklaşık 7-8 saat gerektirir.

1. Şu öğeleri hazırlayın: HIGA fareleri (25 haftalık, dişi), Balb / c fareleri (25 haftalık, dişi), inhalasyon anestezi aparatı, izofluran, mantar tabakası, pim, fosfat tamponlu salin (PBS), enjeksiyon şırıngaları, iğneler, cerrahi makas ve forseps.
2. Bir HIGA faresini inhalasyon anestezi aparatı ile izofluran% 4-5 oranında kullanarak uyuşturun ve pimleri kullanarak mantar tabakası üzerine sırt pozisyonunda monte edin. İzofluran konsantrasyonunu, anestezi indüksiyonundan sonra idame dozu olarak% 2-3'e ayarlayın.
   NOT: Anestezinin derinliği, invaziv prosedürle ilişkili ağrının tamamen ortadan kaldırıldığı bir seviyede tutulur. Özellikle, toraks gibi dokuları eksize ederken izofluran konsantrasyonu% 4-5'e ayarlanmalıdır. Epilasyon ve göz merhemi gerekli değildir. İşlem hızlı bir şekilde gerçekleştirilebiliyorsa, fareyi bir ısıtma yastığına monte etmek gerekli değildir.
3. Cerrahi makas ve forseps ile fare karın duvarının 3-4 cm'lik bir orta hat insizyonunu yapın ve böbreğin her iki tarafını dikkatlice tanımlayın.
4. Kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları ve diyaframı cerrahi makas ve forseps ile kesin. Sağ atriyumu kestikten sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönüşene kadar PBS'yi sol ventriküle enjekte edin (bu prosedür, farenin tüm vücudunun PBS ile perfüze edildiği anlamına gelir.)
5. Renal arteri, böbrek damarını ve üreteri kesin ve böbreği çıkarın. Bir sonraki adımda kullanmak için böbreği 30 mg'lık parçalara bölün.
   NOT: IgA nefropatisinin patolojisi esas olarak renal korteksteki (böbreğin dış kısmı) glomerulusu içerir. Korteks ve medullayı makroskopik olarak ve tamamen ayırt etmek zor olsa da, esas olarak böbreğin dış kısmının toplanması arzu edilir. Bu numuneler birkaç ay boyunca –80 °C'de saklanabilir.

2. Toplam RNA'nın böbrek örneklerinden arındırılması

NOT: Bu adımda, toplam RNA'nın ekstraksiyonu için ticari olarak temin edilebilen miRNA izolasyon kiti kullanılmaktadır. Ek olarak, biyopolimer parçalama spin sütunu kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. miRNA izolasyon kiti, silika membran bazlı spin kolonu, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifleri, guanidin/etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 1), etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 2) ve nükleaz içermeyen su içerir. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örnek boyutu için yaklaşık 3 saat gerektirir.

1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 veya 2,0 mL toplama tüpleri, %100 etanol, kloroform, silikon homojenizatör, mikropipetler, pipet uçları, santrifüj, biyopolimer parçalama spin kolonu, silika membran bazlı spin kolonu, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifleri, guanidin/etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 1), etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 2) ve nükleaz içermeyen su.
2. Oda sıcaklığında bir silikon homojenizatör ve 700 μL fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi kullanarak 30 mg böbrek numunelerini homojenize edin.
   NOT: Numunedeki miRNA'lar, fenol / guanidin bazlı lizis reaktifine maruz kalana kadar savunmasızdır, bu nedenle bu adımlar derhal gerçekleştirilmelidir.
3. Lizatı biyopolimer parçalama spin kolonuna aktarın ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüjleyin.
4. Filtrelemeye 140 μL kloroform ekleyin ve 15 s boyunca kuvvetlice karıştırın. 2-3 dakika bekletin, ardından 15 dakika boyunca 4 ° C'de 12.000 x g'de santrifüj yapın.
5. Orta tabakaya dokunmadan şeffaf süpernatantı nazikçe yeni bir toplama tüpüne aktarın ve% 100 etanolün belirlenen hacmini (aşağıya bakınız) ekleyin. 5 s için vorteks.
   NOT: Elde edilen süpernatantın hacminin 1.5 katında% 100 etanol gereklidir.
6. Numuneyi (üst sınır 700 μL) silika membran bazlı bir spin kolonuna aktarın ve numuneyi oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.
7. Silika membran bazlı sıkma kolonuna 700 μL yıkama tamponu 1 ekleyin ve kolonu oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.
8. Silika membran bazlı sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.
9. Silika membran bazlı sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.
10. Silika membran bazlı spin kolonunu, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 15.000 x g'de herhangi bir ek etanol çıkarmak için hiçbir şey eklemeden tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.
11. Sıkma sütununa bağlı tüpü yeni bir toplama tüpüne değiştirin.
12. Silika membran bazlı spin kolonuna 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj edin.
    NOT: Elde edilen 30 μL çözelti, yüksek konsantrasyonda toplam RNA içerir. Bu numune birkaç ay boyunca –80 °C'de saklanabilir.

3. Toplam RNA'dan cDNA sentezi

NOT: Bu adımda, piyasada satılan bir ters transkripsiyon kiti kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu kit nükleik asit karışımı, ters transkriptaz karışımı ve tampon içerir. Bu prosedür, reaksiyonun ilerlemesini önlemek için buz üzerinde yapılmalıdır. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örnek boyutu için yaklaşık 3 saat gerektirir.

1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 mL toplama tüpleri, sekiz delikli şerit tüpler, mikropipetler, pipet uçları, spektrofotometre, nükleaz içermeyen su, buz, nükleik asit karışımı, ters transkriptaz karışımı, tampon ve termal döngüleyici.
2. Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ölçün. Ardından, 12 μL'nin 1 μg toplam RNA içermesi için gerekli nükleaz içermeyen su hacmini hesaplayın.
3. Aşağıdaki içeriklere sahip bir ana karışım hazırlayın: 2,0 μL nükleik asit karışımı, 2,0 μL ters transkriptaz karışımı ve 4,0 μL tampon, numune başına toplam 8,0 μL.
4. Sekiz delikli şerit tüplerin her bir kuyucuğuna 8 μL ana karışım ekleyin.
5. Toplam RNA'yı, 3.2'de hesaplanan nükleaz içermeyen su hacminde seyreltin. Daha sonra, sekiz delikli şerit tüplerin her bir kuyucuğuna toplam RNA çözeltisinin 12 μL'sini (toplam RNA'nın 1 μg'sini içeren) ekleyin.
6. Termal döngüleyiciyi kullanarak numuneyi 37 ° C'de 8 kuyucuklu şerit tüplerde 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, termal döngüleyiciyi kullanarak 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
   NOT: İnkübasyondan sonraki çözelti yüksek konsantrasyonda cDNA içerir.
7. Bu çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 200 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
   NOT: Elde edilen 200 μL çözelti, qRT-PCR için şablon cDNA olarak kullanılabilir. Bu numune –80 °C'de yaklaşık 1 yıl saklanabilir.

4. miRNA'nın qRT-PCR'si

NOT: Bu adımda, piyasada satılan bir PCR kiti kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu kit PCR karışımı, üniversal astar ve nükleaz içermeyen su içerir. Numuneler çift olarak hazırlanmalı ve sonuçların doğruluğu her durumda dikkate alınmalıdır. MiRNA'nın ekspresyon seviyeleri ΔΔCT yöntemi ile ölçülür. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örneklem büyüklüğü için yaklaşık 4 saat gerektirir.

1. Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 mL toplama tüpü, 96 delikli reaksiyon plakası, 96 delikli reaksiyon plakası için yapışkan film, mikropipetler, pipet uçları, PCR karışımı, üniversal astar, nükleaz içermeyen su, miRNA'ya özgü primerler ve gerçek zamanlı PCR cihazı.
2. Ana karışımı aşağıdaki içeriklerle hazırlayın: 12,5 μL PCR karışımı, 2,5 μL üniversal astar, 1,25 μL 5 μM miRNA'ya özgü astar ve her bir kuyucuk için 6,25 μL nükleaz içermeyen su.
   NOT: Bu tahlilde miRNA'lara özgü primerler [RNA, U6 Küçük Nükleer 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p] kullanılmıştır. RNU6-2 endojen kontrol¹⁴ olarak kullanıldı.
3. 96 kuyucuklu reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna 22,5 μL ana karışım ekleyin.
4. Adım 3.7'de hazırlanan 2.5 μL cDNA'yı 96 kuyucuk plakasının bireysel kuyucuğuna ekleyin.
5. 96 kuyucuklu reaksiyon plakasını yapışma filmi ile örtün, ardından 30 sn boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.
6. Gerçek zamanlı PCR cihazını çalıştırın. PCR cihazını şu şekilde programlayın: 15 dakika boyunca 95 ° C'de ilk aktivasyon, daha sonra 15 s için 94 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 s için 55 ° C'de tavlama ve 30 s için 70 ° C'de uzatma.
7. ΔΔCT yöntemini kullanarak gen ekspresyonunu sayısallaştırın. Göreli ekspresyon seviyeleri 2^–ΔΔCT olarak belirlenir.
   NOT: Sonuçlardan dışlamak için anormal PCR amplifikasyon eğrileri dikkate alınmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA'ların ekspresyon düzeyleri araştırıldı (n=10). Bu sonuç tamamen tarif edilen protokole dayanarak elde edildi. Kontrol olarak Balb/c farelerin böbrekleri seçildi (n=10). Her iki grupta da 25 haftalık yaş seçildi. Tedarikçiden sadece dişi HIGA fareleri temin edilebiliyordu. Üç miRNA'nın ekspresyon seviyeleri (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p; Şekil 1) daha önce IgA nefropatisi ile ilişkili olduğu bildirilen^15,16...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yeni yöntemi kullanarak bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA'ların ekspresyon seviyelerini ölçebildik. IgA nefropatisi, etiyolojisini ve terapötik hedeflerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan açıklanamayan bir hastalıktır ^1,3. Bununla birlikte, insan böbrek örneklerinin elde edilmesi oldukça invazivdir. Bu yeni teknik, küçük hayvanlar kullanılarak IgA nefropatisinin incel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer