אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

Summary

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

Abstract

מחקרים מקיפים אפיינו את ההתפתחות וההבחנה של תאי מורין B באיברי לימפה משניים. נוגדנים המופרשים על ידי תאי B בודדו ופותחו לטיפולים מבוססים היטב. אימות התפתחות תאי מורינה B, בהקשר של עכברים נוטים לחיסון עצמי, או בעכברים עם מערכת חיסונית שונה, הוא מרכיב חיוני בפיתוח או בדיקה של חומרים טיפוליים בעכברים והוא שימוש מתאים בציטומטריית זרימה. פרמטרים ציטומטריים של זרימת תאי B מבוססים היטב יכולים לשמש להערכת התפתחות תאי B בצפק המורין, במח העצם ובטחול, אך יש לדבוק במספר שיטות עבודה מומלצות. בנוסף, ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי B צריך גם להשלים קריאות נוספות של פיתוח תא B. נתונים הנוצרים בטכניקה זו יכולים לקדם את הבנתנו בסוג פראי, מודלים של עכבר מועד אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מולקולות דמויות נוגדנים או נוגדנים כטיפולים.

Introduction

נוגדנים חד שבטיים הפכו יותר ויותר לטיפול הבחירה במחלות אנושיות רבות כאשר הם הופכים לחלק מהרפואה המיינסטרים1,2. תיארנו בעבר עכברים מהונדסים גנטית המייצרים ביעילות נוגדנים המעניקים מחסה לאזורים משתנים אנושיים לחלוטין עם קבועי עכבר ^IgH3,4. לאחרונה, תיארנו עכברים מהונדסים גנטית המייצרים מולקולות דמויות נוגדנים שיש להן אנטיגן מחייב ^מובהק5. נוגדנים מופרשים על ידי תאי B ומהוות את הבסיס לחסינות הומוריסטית אדפטיבית. ישנם שני סוגים שונים של תאי B, B-1 ו- B-2. ביונקים, תאי B-1 מקורם בכבד העוברי ומועשרים ברקמות הרירית ובחללים הפלורליים הצפקיים לאחר הלידה, בעוד שתאי B-2 מקורם בכבד העוברי לפני הלידה ולאחר מכן במח העצם (BM). תאי B-2 מועשרים באיברי לימפה משניים כולל הטחול והדם6,7,8. ב- BM, אבות ההמטויאטי B-2 מתחילים להבדיל לתאי פרו-B עם תחילת ארגון מחדש של שרשרת כבדה Ig ^mu9,10. סידור מחדש מוצלח של שרשרת כבדה Ig והרכבתה לתוך קולטן התא טרום B (טרום BCR), יחד עם איתות והתרחבות שגשוג, מובילים לבידול לתאי טרום B. לאחר שתאי טרום-B מסדרים מחדש את שרשראות האור של Ig kappa (Igκ), או אם הם אינם יצרניים, שרשראות האור של Ig lambda (Igλ), הם משתלבים עם שרשרת μ כבדה, וכתוצאה מכך ביטוי IgM BCR משטחי. חשוב לציין כי ביטוי פני השטח של IgM ידוע להיות מופחת בתנאים של פעילות אוטומטית, ובכך תורם סובלנות עצמית בתאי B לא מגיבים פונקציונלית או ^{אלרגית11,12}. תאי B לא בוגרים נכנסים לשלב מעבר, שבו הם מתחילים לבטא IgD ולעבור מה- BM לטחול. בטחול, ביטוי IgD גדל עוד יותר והתאים מבשילים לשלב שני של תאי B מעבר, ולאחר מכן השלמת מצב ההתבגרות שלהם והתפתחות לתוך אזור שולי (MZ) או תאי זקיקים (Fol)13,14,15. בעכברים בוגרים, בסביבה שאינה חולה, מספר תאי B בוגרים נשאר קבוע למרות 10-20 מיליון תאי B לא בוגרים הנוצרים מדי יום ב- BM. מתוכם, רק שלושה אחוזים נכנסים למאגר של תאי B בוגרים. גודל תא B ההיקפי מוגבל על ידי מוות תאי, בין היתר בשל מספר גורמים כולל תגובה עצמית והתבגרות חלקית16,17,18. ניתוח ציטומטרי זרימה שימש בהרחבה כדי לאפיין ולספור תאים רבים של תאי מערכת החיסון בבני אדם ועכברים. אמנם יש כמה קווי דמיון בין תאים אנושיים מורין B, פרוטוקול זה חל רק על ניתוח של תאי מורין B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית, כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. Cytometry זרימה היה גם פופולרי מאוד ביישומים רבים נוספים, כולל במדידת הפעלת התא, פונקציה, התפשטות, ניתוח מחזור, ניתוח תוכן DNA, אפופטוזיס ומיון תאים ^19,20.

ציטומטריית זרימה היא הכלי המועדף לאפיין תאי לימפוציטים שונים בעכברים ובבני אדם, כולל באיברים מורכבים כגון הטחול, ה- BM והדם. בשל ריאגנטים נוגדנים ספציפיים לעכבר עבור ציטומטריית זרימה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור לא רק חלבונים פני התא, אלא גם פוספורוטאין תאיים וציטוקינים, כמו גם קריאות ^{פונקציונליות21}. כאן אנו מדגימים כיצד ריאגנטים ציטומטריה זרימה ניתן להשתמש כדי לזהות תת קבוצות תאי B כפי שהם בוגרים להבדיל באיברים לימפואידיים משניים. לאחר אופטימיזציה של תנאי כתמים, טיפול בדגימות, הגדרת מכשיר נכון ורכישת נתונים, ולבסוף ניתוח נתונים, פרוטוקול לניתוח ציטומטרי זרימה מקיף של תא B בעכברים ניתן להשתמש. ניתוח מקיף כזה מבוסס על המינוח בן עשרות השנים שהומצא על ידי הארדי ועמיתיו, שבו ניתן לחלק תאי BM B-2 מתפתחים לשברים שונים (Fraction) בהתאם לביטוי שלהם של B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ו- ^IgD22. הארדי ואח', הראו כי ניתן לחלק תאי BM BM B B220⁺ CD43 לארבע קבוצות משנה (שבר A-C') על בסיס ביטוי BP-1 ו- CD24 (30F1), בעוד שתאי B220⁺ CD43^{-(עמום עד שלילי)} BM B יכולים להיפתר לשלוש קבוצות משנה (שבר D-F) בהתבסס על ביטוי דיפרנציאלי של IgD ו- IgM23 פני השטח. שבר A (תאי טרום-PRO-B) מוגדרים כ- BP-1^- CD24 (30F1)^-, שבר B (תאים מוקדמים של פרו-B) מוגדרים כ- BP-1^- CD24 (30F1)⁺, שבר C (תאי Pro-B מאוחרים) מוגדרים כ- BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, ושבר C' (תאים מוקדמים לפני B) מוגדרים כ- BP-1⁺ ו- CD24high. יתר על כן, שבר D (תאים לפני B) מוגדרים כתאי B220⁺ CD43^- IgM^- B, ו- Fraction E (תאי B שנוצרו לאחרונה, שילוב של תאים לא בוגרים ומעבריים) מוגדרים כתאי B220⁺ CD43^- IgM⁺ B ו- Fraction F (תאים בוגרים, חוזרים על B) מוגדרים כתאי B220high CD43^- IgM ⁺ B. לעומת זאת, ניתן לחלק את רוב תאי B הנאיביים שנמצאו בטחול לתאי B בוגרים (B220⁺ CD93-) B ותאי מעבר (T1, T2, T3) בהתאם לביטוי של CD93, CD23 ו^- IgM. ניתן לפתור תאי B בוגרים לתוך אזור שולי ותת-קבוצות זקיקים בהתבסס על ביטוי של IgM ו- CD21/CD35, וניתן לחלק עוד יותר את תת-קבוצות המשנה של הזקיקים לסוג זקיקים בוגרים I ותת-קבוצות תאים מסוג II B מסוג II בהתאם לרמת ביטוי פני השטח IgM ו- ^IgD24. אוכלוסיות תאי B בטחול אלה מבטאות בעיקר שרשרת אור של איגה. לבסוף, אוכלוסיות תאי B-1 B, שמקורן בכבד העובר ונמצאות בעיקר בחללים הצפקיים והפלורליים של עכברים בוגרים, תוארו בספרות. תאי B צפקיים אלה ניתן להבחין בין תאי B-2 B שתוארו בעבר על ידי חוסר ביטוי CD23 שלהם. לאחר מכן הם מחולקים עוד יותר לאוכלוסיות B-1a או B-1b, כאשר הראשון מוגדר על ידי נוכחות של CD5 והאחרון על ידי ^{היעדרו25}. אבות תאי B-1 מצויים בשפע בכבד העוברי, אך אינם נמצאים ב- BM למבוגרים. בעוד תאי B-1a ו- B-1b מקורם באבות צאצא שונים, שניהם זורעים את חללי הצפק ^{והפלורל24}. בניגוד לתאי B-2, תאי B-1 מסוגלים באופן ייחודי להתחדשות עצמית ואחראים לייצור נוגדני IgM טבעיים.

פגמים בהתפתחות תאי B יכולים להתעורר במקרים רבים, כולל ליקויים ברכיבי ^BCR26,27, הפרעות של מולקולות איתות המשפיעות על עוצמת איתות BCR14,28,29, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי ^B30,31 . ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי הלימפה תרם לאפיון של בלוקי פיתוח תאי B בעכברים אלה ורבים אחרים. אחד היתרונות של ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי לימפה הוא שהוא מציע את היכולת לבצע מדידות על תאים בודדים המתקבלים רקמה מנותקת חיה. הזמינות של ריאגנטים במגוון הולך וגדל של פלואורופורים מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. יתר על כן, הספירה של תאי B על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה משלימה בדיקות אימונולוגיות אחרות כגון שיטות אימונוהיסטוכימיה המדמיינת לוקליזציה של תאים בתוך איברי לימפה, זיהוי רמות נוגדנים במחזור כמדד של חסינות הומוריסטית, כמו גם שתי מיקרוסקופיה פוטונית למדידת תגובות תאי B במרחב ובזמן ^{אמיתיים}.

Protocol

כל מחקרי העכברים נוהלו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של Regeneron (IACUC). הניסוי נערך על רקמות משלושה עכברים נקבות C57BL/6J (גיל 17 שבועות) ממעבדות ג'קסון. יש לתעד את כל הנוגדנים לפני תחילת הניסוי כדי לקבוע ריכוז אידיאלי. בעת שימוש בחרוזי פיצוי לפיצוי בצבע יחיד, ודא שהם מכתימים בהירים או בהירים יותר מהדגימות שלך. שמור את כל המאגרים, הנוגדנים והתאים על קרח או ב 4 °C (70 °F). לאחר תוספת של צבע הכדאיות, לבצע את כל השלבים ואת הדגירה ב 4°C באור נמוך או בחושך.

1. קציר תאים צפק ובידוד תא בודד

1. המתת חסד את העכבר באמצעות _CO2 או על פי פרוטוקול שאושר_.
2. הנח את העכבר על גבו, ריסס עם 70% אתנול, וחתוך עור בטן החוצה עם מספריים, נזהר לא לחתוך את צפק.
3. הזריקו 3 מ"ל של חוצץ כביסה קר כקרח (0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב- DPBS [vol/vol]) לחלל הצפק עם מזרק 3 מ"ל המצויד במחט 25 מד.
4. יש לעסות בעדינות את הצי בקצות האצבעות.
5. חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.
6. הכנס מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 18 G דרך צפק, נזהר כדי למנוע איברים ושומן.
7. לחלץ את חוצץ לשטוף, עכשיו מכיל תאים צפק, ולהעביר צינור חרוט 15 מ"ל על קרח.
8. חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.
9. חותכים חור קטן בצפק תוך כדי החזקה עם פינצטה.
10. הכנס פיפטה העברה חד פעמית לתוך החור ולאסוף את חוצץ לשטוף הנותר, שוב הימנעות שומן ואיברים.
11. העבר את התאים הניטורונים הנותרים שנאספו לצינור החרוט 15 מ"ל על קרח.
    הערה: יש להשליך דגימה אם זיהום הדם ניכר.
12. לדגור על התאים על הקרח עד הטחול ואת מיצוי העצם הושלמו.
13. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
14. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חוצץ לשטוף.
15. לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.
16. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

2. קציר טחול ובידוד תא בודד

1. הנח את העכבר על בטנו וחתוך דרך צפק על הישבן השמאלי באמצעות מספריים נקיים. חותכים את הטחול, מסירים שומן ורקמת חיבור.
2. מעבירים את הטחול לצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ כביסה על קרח.
3. לדגור את הטחול על הקרח עד מיצוי העצם הושלם.
4. העבר את הטחול לצינור דיסוציאציה אוטומטי עם 5 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים. מניחים את הצינור על מכשיר דיסוציאטור הרקמה ומנתקים למשך 60 s כדי ליצור השעיה של תא בודד.
   הערה: מותר גם להשתמש בשיטות שגרתיות אחרות של השגת מתלים טחול חד-תאי כגון ניפוץ בין שקופיות זכוכית חלבית במאגר כביסה. אם נעשה שימוש בשיטה אחרת של דיסוציאציה, בצע את הניתוק עם צנטריפוגה, שאיפה, ולאחר מכן resuspension ב 5 מ"ל של מאגר תמוגה של תאי דם אדומים לפני שתמשיך לשלב 2.5.
5. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
6. הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.
7. מעבירים לצינור חרוט נקי 15 מ"ל.
8. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
9. resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.
10. לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.
11. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

3. קציר BM ובידוד תא בודד

1. הסר את העור מהחצי התחתון של גוף העכבר. לקצץ את השריר עודף מהרגל. הסר את כל הרגל עם מספריים, נזהר לא לחתוך את עצם הירך. נקה את עצם הירך ואת השוקה על ידי הסרת השרירים, השומן והרגליים הנותרים.
2. העבר את העצמות לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ לשטוף על קרח.
3. לנקב את החלק התחתון של צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, משאיר חור קטן מספיק לעצמות הרגל לא לבלוט. הכנס את צינור 0.5 מ"ל לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי. חותכים את קצה עצם הירך והשוקה פרוקסימלי לברך ומניחים את הקצוות החתוכים עם הפנים כלפי מטה לתוך צינור 0.5 מ"ל.
4. צנטריפוגות התאים ב 6,780 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (7 °F).
5. Resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל נוספים של חיץ תמותה של תאי דם אדומים.
6. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
7. הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.
8. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
9. resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.
10. סנן תאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי 15 מ"ל על קרח.
11. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

4. כתם תאים ולהכין פיצוי

1. Aliquot ¹⁰⁶ תאים של כל סוג תא מכל חיה לצלחת תחתית 96 גם U.
   1. הקפד לכלול מספיק בארות עבור כל הדגימות והפקדים, כולל כתם מלא, פלואורסצנטיות-מינוס אחד (FMO), לא נגוע, ולבסוף את הפיצוי האופציונלי בצבע יחיד עבור כל פלואורופור בשימוש.
   2. עבור לוח ההתבגרות BM ולוח ההתבגרות הטחול, תאי aliquot לתוך 2 בארות, ¹⁰⁶ תאים לבאר, עבור כל דגימת כתם מלאה. עבור פקדי הכדאיות של פיצוי בצבע יחיד, הוסף 2 x ¹⁰⁶ תאים מכל סוג תא לבארות בודדות.
2. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
3. resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS). שלב זה חשוב להסרת חלבון לפני הכתמתו בצבע כדאיות תגובתי לאמין.
4. חזור על שלבים 4.2 ו- 4.3.
5. חזור על שלב 4.2.
6. resuspend התאים ב 100 μL צביעת הכדאיות מדולל 1:1,000 ב- DPBS.
   הערה: אם אתם משתמשים בתאים לפיצוי של צבע בודד, אל תוסיפו צבע כדאיות לבארות אלה.
   1. עבור כל ערכת כתמים, השאירו מספר בארות לא נגועות לדגימה לא מוכתמת לחלוטין ולכל פקד אחר שתצטרכו.
   2. עבור כל ערכת כתמים, להשאיר באר נוספת לא מוכתמת עבור בקרת FMO הכדאיות.
   3. עבור פקדי פיצוי הכדאיות של צבע יחיד: Resuspend 2 x ¹⁰⁶ תאים, aliquoted בשלב 4.1, ב 200 μL של צבע קיימא מדולל. העבר 100 μL של תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, תאי חום במשך 5 דקות ב 65 °C (65 °F), ולהעביר את 100 μL של תאים מוכי חום בחזרה לבאר המקורית עם 100 μL הנותרים תאים חיים.
7. תאי דגירה ב 4 °C (50 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
8. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
9. resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS).
10. חזור על שלבים 4.8 ו- 4.9.
11. חזור על שלב 4.8.
12. resuspend התאים ב 50 μL של בלוק Fc מדולל 1:50 (ריכוז סופי = 10 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר כתמים (0.5% BSA ב- DPBS [vol/vol]).
    1. עבור תאים צפק - גם להוסיף 5 μL של חוסם מונוציטים כדי להפחית כתמים לא ספציפיים.
13. לדגור על התאים ב 4 °C (55 °F), מוגן מפני אור, במשך 15 דקות.
14. הכן תערובות מאסטר כתמים מלאות ו- FMOs במאגר כתמים לנפח סופי של 100 מיקרול לכל ¹⁰⁶ תאים. עיין בטבלה 1-טבלה 4 עבור רשימות הנוגדנים.
    הערה: FMOs מיוצרים על ידי הכללת כל הנוגדנים בערכת כתמים למעט אחת. הכן FMO לכל נוגדן בערכת כתמים. כאשר ערכת כתמים מכילה צבעים מבריקים מרובים, החלף 50 μL של חיץ כתמים מבריק עבור חיץ כתמים לכל דגימה
15. מבלי להסיר בלוק Fc, הוסף 100 μL של תערובות כתמים מלאות ו- FMOs לבארות נבחרות.
16. הכן פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור כל נוגדן בערכת כתמים.
    1. אם אתם משתמשים חרוזי פיצוי, עקבו אחר הוראות הייצור לשימוש.
    2. אם אתם משתמשים בתאים, מוסיפים נוגדן ציצי ל-106 תאים, השמורים בעבר בשלב 4.6.1 ללא צבע כדאיות, במאגר כתמים של 100 μL. אם כל התאים במדגם חיוביים עבור סמן מסוים, להפריש תאים לא נגועים לשמש בעת רכישת נתוני פיצוי על cytometer הזרימה.
17. לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
18. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
19. resuspend התאים והחרוזים ב 200 μL של חוצץ כתמים.
20. חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.
21. חזור על שלב 4.18.
22. כדי לתקן את הדגימות לניתוח בתוך 48 שעות, resuspend תאים וחרוזים ב 200 μL של 2% paraformaldehyde ב- DPBS.
    זהירות: Parafomaldehyde הוא סכנה בריאותית חמורה ודליק. עיין בגליון הנתונים של Safty לפני השימוש.
23. לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
24. חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.
25. מניחים צלחת מסנן על צלחת U-תחתית נקייה 96. באמצעות ריבוי פיפטות, מעבירים כל דגימה לבאר של צלחת המסנן.
26. צנטריפוגה צלחת המסנן-96 היטב הגדרת צלחת U-התחתון ב 845 x g במשך 2 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את צלחת המסנן ואת decant supernatant על ידי היפוך מהיר והבהבה של הצלחת מעל כיור, נזהר לא לחצות לזהם בארות.
27. עבור BM ולוחות התבגרות טחול מחדש את התאים מוכתמים לחלוטין 100 μL של חוצץ כתמים. מערבבים את 2 בארות עבור כל חיה לתוך 1 היטב. תגדיל מחדש את הלוחות הנותרים, את ה- FMOs והפקדים ב- 200 מיקרו-אל של מאגר כתמים.
28. דגירה תאים קבועים וחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, לילה.

5. רכישת נתונים ציטומטריים זרימה

1. אתחל ו- QC את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן.
2. טען את התבנית הספציפית לכל חלונית.
3. לפני הקלטת נתונים, ודא שכל האירועים עבור כל מדגם הם בקנה מידה וגלויים על התוויות הנקודות.
4. הקלט בקרות פיצוי עבור כל לוח כתמים באמצעות פיצויי כתמים בודדים שהוכנו בשלב 4.16. הגדר שערים חיוביים ושליליים עבור כל מדגם. יש התוכנה לחשב את מטריצת הפיצוי.
5. התחל לרכוש את המדגם הראשון, והבטח שהשערים נקבעים כראוי.
6. הגדר את המכונה כדי להקליט לפחות 50,000 B אירועים תא עבור לוח תא B הצפק ולוח טחול Igκ ו Igλ; 150,000 אירועי תאי B עבור לוח ההבשלה BM; ו-300,000 אירועי תאי B עבור לוח ההתבגרות של הטחול.
7. עבור כל לוח כתמים, הפעל והקלט את הדגימות המוכתמות במלואן עבור כל בעל חיים, מדגם לא נגוע וה- FMOs.

6. ניתוח נתונים

1. המשך בניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה. עקבו אחר אסטרטגיות הגטינג המתוארות באיור 1, איור 2, איור 3,איור 4. 

תוצאות

כאן אנו מציגים את אסטרטגיית הגינג לאפיון התפתחות תאי B בצפק העכבר, BM והטחול. הבסיס של הניתוח נוצר סביב הרעיון של הכתמה עם צבע קיימא, ואז gating החוצה מכפילים המבוססים על אזור פיזור קדימה (FSC-A) ו קדימה-פיזור-גובה (FSC-H), ולבסוף gating פסולת על ידי בחירת תאים על פי המאפיינים FSC-A וצד-פיז?...

Discussion

ניתוח ציטומטרי זרימה של רקמות לימפה ולא לימפואידים אפשר זיהוי והספירה בו זמנית של תת-אוכלוסיות תאי B בעכברים ובני אדם מאז שנות השמונים. זה שימש כמדד של חסינות הומוריסטית והוא יכול להיות מיושם עוד יותר כדי להעריך פונקציונליות תא B. שיטה זו מנצלת את זמינות ריאגנט כדי להעריך שלבים שונים של התב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument