Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Özet

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Özet

Kapsamlı çalışmalar, ikincil lenfoid organlarda murine B hücrelerinin gelişimini ve farklılaşmasını karakterize ederek karakterizedir. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar izole edilmiş ve köklü terapötikler haline geliştirilmiştir. Murine B hücre gelişiminin, otoimmün eğilimli fareler bağlamında veya değiştirilmiş bağışıklık sistemine sahip farelerde doğrulanması, farelerde terapötik ajanlar geliştirmenin veya test etmenin önemli bir bileşenidir ve akış sitometrisinin uygun bir kullanımıdır. İyi kurulmuş B hücre akışı sitometrik parametreleri, murine periton, kemik iliği ve dalaktaki B hücre gelişimini değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bir dizi en iyi uygulamaya uyulmalıdır. Ek olarak, B hücre bölmelerinin akış sitometrik analizi de B hücre gelişiminin ek okumalarını tamamlamalıdır. Bu teknik kullanılarak üretilen veriler, vahşi tip, otoimmün eğilimli fare modelleri ve terapötik olarak antikor veya antikor benzeri moleküller üretmek için kullanılabilecek insanlaştırılmış fareler anlayışımızı daha da ileriye getirebilir.

Giriş

Monoklonal antikorlar, ana akım tıbbın bir parçası haline geldikçe birçok insan hastalığı için giderek daha fazla tercih tedavisi haline ^{gelmiştir1,2}. Daha önce, fare IgH ^sabitleri3,4 ile tamamen insan değişken bölgelerini barındıran antikorları verimli bir şekilde üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık. Son zamanlarda, farklı antijen ^{bağlayıcısı} olan antikor benzeri moleküller üreten genetik olarak tasarlanmış fareleri tanımladık5. Antikorlar B hücreleri tarafından salgılanır ve uyarlanabilir humoral bağışıklığın temelini oluşturur. B-1 ve B-2 olmak üzere iki farklı tip B hücresi vardır. Memelilerde B-1 hücreleri fetal karaciğerden kaynaklanır ve doğumdan sonra mukozal dokular ile plevral ve periton boşluklarında zenginleştirilirken, B-2 hücreleri doğumdan önce fetal karaciğerden ve daha sonra kemik iliğinde (BM) kaynaklanır. B-2 hücreleri dalak ve kan dahil sekonder lenfoid organlarda zenginleştirilir6,7,8. BM'de, B-2 hematopoetik progenitörler, Ig mu ağır zincir yeniden düzenlemesinin başlatılması üzerine B yanlısı hücrelere farklılaşmaya ^başlar9,10. Ig ağır zincirinin ve montajının B öncesi hücre reseptörüne (BCR öncesi) başarılı bir şekilde yeniden düzenlenmesi, sinyalizasyon ve proliferatif genişleme ile birlikte B öncesi hücrelere farklılaşmaya yol açar. B öncesi hücreler Ig kappalarını (Igφ) yeniden düzenledikten sonra veya verimsizse, Ig lambda (Igφ) ışık zincirleri, ağır μ zincirle eşleşerek yüzey IgM BCR ekspresyozunu elde ederler. IgM yüzey ekspresyonunun otoreaktivite koşullarında azaldığının bilindiğini, böylece fonksiyonel olarak yanıt vermeyen veya anjik B hücrelerinde kendine toleransa katkıda bulunduğunu belirtmek ^{önemlidir11,12}. Olgunlaşmamış B hücreleri daha sonra IgD'yi birlikte ifade etmeye ve BM'den dalağa göç etmeye başladıkları bir geçiş aşamasına girerler. Dalakta, IgD ekspresyasyonu daha da artar ve hücreler geçiş B hücrelerinin ikinci aşamasına olgunlaşır, ardından olgunlaşma durumlarının ve gelişimlerinin marjinal bölge (MZ) veya foliküler (Fol) hücrelere tamamlanması13,14,15. Yetişkin farelerde, hastalıklı olmayan bir ortamda, BM'de günlük 10-20 milyon olgunlaşmamış B hücresi üretilmesine rağmen olgun B hücrelerinin sayısı sabit kalır. Bunlardan sadece yüzde üçü olgun B hücrelerinin havuzuna girer. Periferik B hücre bölmesinin büyüklüğü, kısmen kendi kendine reaktivite ve eksik olgunlaşma dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle hücre ölümü ile kısıtlanır16,17,18. Akış sitometrik analizi, insanlarda ve farelerde birçok bağışıklık hücresi alt bölmesini karakterize etmek ve numaralandırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. İnsan ve murine B hücre bölmeleri arasında bazı benzerlikler olsa da, bu protokol sadece murine B hücrelerinin analizi için geçerlidir. Bu protokol, genetik manipülasyonun B hücre gelişimini değiştirip değiştirmeyeceğini belirlemek için genetik olarak tasarlanmış fareleri fenotipleme amacıyla geliştirilmiştir. Akış sitometrisi, hücre aktivasyonu, fonksiyon, çoğalma, döngü analizi, DNA içerik analizi, apoptoz ve hücre sıralama ^19,20'yi ölçmek de dahil olmak üzere birçok ek uygulamada çok popüler olmuştur.

Akış sitometrisi, dalak, BM ve kan gibi karmaşık organlar da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda çeşitli lenfosit bölmelerini karakterize etmek için tercih edilen araçtır. Akış sitometrisi için yaygın olarak bulunan fareye özgü antikor reaktifleri nedeniyle, bu teknik sadece hücre yüzey proteinlerini değil, aynı zamanda hücre içi fosfoproteinleri ve sitokinleri ve fonksiyonel okumaları araştırmak için de ^{kullanılabilir21}. Burada, akış sitometri reaktiflerinin ikincil lenfoid organlarda olgunlaştıkça ve farklılaştıkça B hücreleri alt kümelerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Boyama koşullarının optimizasyonu, numune işleme, doğru cihaz kurulumu ve veri toplama ve son olarak veri analizinden sonra, farelerdeki B hücre bölmesinin kapsamlı akış sitometrik analizi için bir protokol kullanılabilir. Bu tür kapsamlı analizler, Gelişmekte olan BM B-2 hücrelerinin B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ve ^IgD22 ifadelerine bağlı olarak farklı fraksiyonlara (Fraksiyon) ayrılabileceği Hardy ve meslektaşları tarafından tasarlanan onlarca yıllık bir isimlendirmeye dayanmaktadır. Hardy ve ark., B220⁺ CD43 BM B hücrelerinin BP-1 ve CD24 (30F1) ekspresyerine dayanarak dört alt kümeye (Fraksiyon A-C') bölünebileceğini, B220⁺ CD43^{-(sönük ila neg)} BM B hücrelerinin igd ve yüzey ^IgM23'ün farklı ifadesine dayanarak üç alt kümeye (Fraksiyon D-F) çözülebileceğini göstermiştir. Kesir A (B öncesi hücreler) BP-1^- CD24 (30F1)^-, Kesir B (erken B öncesi hücreler) BP-1^- CD24 (30F1)⁺, Fraksiyon C (geç pro-B hücreleri) BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, Fraksiyon C' (erken B öncesi hücreler) ise BP-1⁺ ve CD24high olarak tanımlanır. Ayrıca, Kesir D (B öncesi hücreler) B220⁺ CD43^- IgM^- B hücreleri, Kesir E (yeni oluşturulan B hücreleri, olgunlaşmamış ve geçiş kombinasyonu) B220⁺ CD43^- IgM⁺ B hücreleri ve Fraksiyon F (olgun, yaslanan B hücreleri) B220high CD43^- IgM⁺ B hücreleri olarak tanımlanır. Buna karşılık dalakta bulunan naif B hücrelerinin çoğunluğu CD93, CD23 ve IgM ekspresyonuna bağlı olarak olgun (B220⁺ CD93^-) B hücrelerine ve geçiş (T1, T2, T3) hücrelere ayrılabilir. Olgun B hücreleri, IgM ve CD21/CD35 ekspresyonuna göre marjinal bölge ve foliküler alt kümelere çözülebilir ve foliküler alt kümeler, IgM ve IgD yüzey ekspresyonlarının seviyesine bağlı olarak olgun foliküler tip I ve foliküler tip II B hücre alt kümelerine ^{ayrılabilir24}. Bu dalak B hücre popülasyonları ağırlıklı olarak Igφ ışık zincirini ifade eder. Son olarak, fetal karaciğerden kaynaklanan ve esas olarak yetişkin farelerin periton ve plevral boşluklarında bulunan B-1 B hücre popülasyonları literatürde tanımlanmıştır. Bu periton B hücreleri, CD23 ekspresyonu eksikliği ile daha önce tanımlanmış B-2 B hücrelerinden ayırt edilebilir. Daha sonra B-1a veya B-1b popülasyonlarına ayrılırlar, birincisi CD5'in varlığı ve ikincisi ^yokluğu25 ile tanımlanır. B-1 hücreli atalar fetal karaciğerde bol miktarda bulunur, ancak yetişkin BM'de bulunmaz. B-1a ve B-1b hücreleri farklı progenitörlerden kaynaklanırken, her ikisi de periton ve plevral boşlukları ^tohumlar24. B-2 hücrelerinin aksine, B-1 hücreleri benzersiz bir şekilde kendini yenileyebilir ve doğal IgM antikorlarının üretiminden sorumludur.

B hücre gelişimindeki kusurlar, ^BCR26,27 bileşenlerindeki eksiklikler, BCR sinyal gücünü etkileyen sinyal moleküllerinin pertürbasyonları14,28,29 veya B hücre sağkalımını modüle eden sitokinlerin bozulması dahil olmak üzere birçok durumda ortaya ^{çıkabilir30,31} . Lenfoid bölmelerin akış sitometri analizi, bu farelerde ve diğer birçok kişide B hücre gelişim bloklarının karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. Lenfoid bölmelerin akış sitometrik analizinin bir avantajı, canlı ayrışmış dokudan elde edilen tek tek hücreler üzerinde ölçüm yapma yeteneği sunmasıdır. Reaktiflerin sürekli genişleyen bir florofor aralığında bulunması, birden fazla parametrenin eşzamanlı olarak analizini sağlar ve B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, B hücrelerinin akış sitometrik analizi ile numaralandırılması, lenfoid organlarda hücre lokalizasyonunu görselleştiren immünhistokimya yöntemleri, dolaşımdaki antikor seviyelerinin humoral bağışıklık ölçüsü olarak tespiti ve B hücre yanıtlarını gerçek uzay ve zamanda ölçmek için iki foton mikroskopisi gibi diğer immünolojik tahlilleri ^tamamlar32.

Protokol

Tüm fare çalışmaları Regeneron'un Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından denetlendi ve onaylandı. Deney, Jackson Laboratuvarları'ndan üç C57BL/6J dişi fareden (17 haftalık) dokular üzerinde yapıldı. İdeal konsantrasyonu belirlemek için deneye başlamadan önce tüm antikorları titratın. Tek renk telafisi için kompanzasyon boncukları kullanırken, numunelerinizden daha parlak veya parlak lekeler aldıklarından emin olun. Tüm tamponları, antikorları ve hücreleri buzda veya 4 °C'de tutun. Canlılık boyasının eklenmesinden sonra, tüm adımları ve inkübasyonları 4°C'de düşük ışıkta veya karanlıkta gerçekleştirin.

1. Periton hücre hasadı ve tek hücre izolasyonu

1. Fareyi _CO2 kullanarak veya _{onaylanmış protokole} göre ötenazi.
2. Fareyi sırtına yatırın,% 70 etanol ile püskürtün ve peritonları kesmemeye dikkat derek dış karın derisini makasla kesin.
3. 25 kalibrelik iğne ile donatılmış 3 mL şırınga ile periton boşluğuna 3 mL buz gibi yıkama tamponu (DPBS'de %0,5 sığır serum albümini (BSA) enjekte edin.
4. Peritona parmak uçlarıyla hafifçe masaj yapın.
5. 1.3 ve 1.4.
6. Organları ve yağları önlemek için dikkatli olarak peritondan 18 G iğne ile donatılmış 3 mL şırınga yerleştirin.
7. Şimdi periton hücreleri içeren yıkama tamponu çıkarın ve buz üzerinde 15 mL konik tüpe aktarın.
8. 1.3 ve 1.4.
9. Cımbızla tutarken peritonda küçük bir delik açın.
10. Deliğe tek kullanımlık bir transfer pipet yerleştirin ve kalan yıkama tamponu toplayın, bir kez daha yağ ve organlardan kaçının.
11. Toplanan periton hücrelerini buz üzerindeki 15 mL konik tüpe aktarın.
    NOT: Kan kirlenmesi belirginse numuneyi atın.
12. Dalak ve kemik ekstraksiyonu tamamlanana kadar hücreleri buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
13. Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
14. Hücre peletini 1 mL yıkama tamponunda yeniden dirildi.
15. Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
16. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.

2. Dalak hasadı ve tek hücre izolasyonu

1. Fareyi karnına yatırın ve temiz makas kullanarak sol arka taraftaki peritonları kesin. Dalağını kesin, yağ ve bağ dokusunu çıkarın.
2. Dalağını buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. Kemik çıkarma işlemi tamamlanana kadar dalağını buzda kuluçkaya yatır.
4. Dalağını 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu ile otomatik ayrışma tüpüne taşıyın. Tüpü doku ayrıştırıcı cihazına yerleştirin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 60 sn ayrışın.
   NOT: Yıkama tamponunda buzlu cam slaytlar arasında parçalama gibi tek hücreli dalak süspansiyonları elde etmek için diğer rutin yöntemlerin kullanılmasına da izin verilir. Başka bir ayrışma yöntemi kullanılırsa, 2.5 adımına devam etmeden önce santrifüjleme, aspirasyon ve ardından 5 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda resüspensiyon ile ayrışma izleyin.
5. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
6. 2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.
7. Temiz bir 15 mL konik tüpe aktarın.
8. Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
9. Hücre peletini 5 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.
10. Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz bir 15 mL konik tüpe filtreleyin.
11. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.

3. BM hasadı ve tek hücre izolasyonu

1. Cildi fare gövdesinin alt yarısından çıkarın. Bacaktan fazla kası kesin. Uyluk kemiğini kesmemeye dikkat derek tüm bacağı makasla çıkarın. Kalan kas, yağ ve ayakları çıkararak uyluk kemiğini ve kaval kemiğini temizleyin.
2. Kemikleri buz üzerinde 1 mL yıkama tamponu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün tabanını delin ve bacak kemiklerinin çıkıntı yapmaması için yeterince küçük bir delik bırakın. 0,5 mL'lik tüpü temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Femur ve kaval kemiği proksimal ucunu dizine kesin ve kesik uçları 0,5 mL'lik tüpe bakacak şekilde yerleştirin.
4. Hücreleri 4 °C'de 2 dakika boyunca 6.780 x g'da santrifüj edin.
5. Hücre peletini 1 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponunda yeniden dirildi ve ek 3 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
6. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatır.
7. 2mM EDTA içeren 10 mL 4 °C yıkama tamponu ekleyin.
8. Hücreleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üst sıraları aspire edin.
9. Hücre peletini 3 mL 4 °C yıkama tamponunda yeniden sakla.
10. Hücreleri 70 μM hücre süzgecinden buz üzerinde temiz 15 mL konik tüpe filtreleyin.
11. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirleyin.

4. Hücreleri lekele ve telafi hazırla

1. Her hayvandan ⁹⁶ kuyu U alt plakasına kadar her hücre türünden Aliquot 106 hücresi.
   1. Tam leke, floresan eksi bir (FMO), el değmemiş ve son olarak kullanılan her florofor için isteğe bağlı tek renk telafisi de dahil olmak üzere tüm numuneler ve kontroller için yeterli kuyuları ekleyin.
   2. BM olgunlaşma paneli ve dalak olgunlaşma paneli için, her tam leke örneği için kuyu başına ¹⁰⁶ hücre olmak üzere 2 kuyuya aliquot hücreleri. Tek renk telafisi canlılık kontrolleri için, tek tek kuyulara her hücre türünden 2 x ¹⁰⁶ hücre ekleyin.
2. Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
3. Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin. Bu adım, amin reaktif canlılık boyası ile lekelemeden önce proteini çıkarmak için önemlidir.
4. 4.2 ve 4.3.
5. 4.2. adımı yineleyin.
6. DPBS'de 1:1.000 seyreltilmiş 100 μL canlılık boyasında hücreleri yeniden biriktirin.
   NOT: Hücreleri tek renk telafisi için kullanıyorsanız, bu kuyulara canlılık boyası eklemeyin.
   1. Her leke seti için, tamamen yersiz bir örnek ve ihtiyacınız olabilecek diğer kontroller için birkaç lekesiz kuyu bırakın.
   2. Her leke seti için, uygulanabilirlik FDO kontrolü için ek bir bozulmamış kuyu bırakın.
   3. Tek renkli canlılık telafisi kontrolleri için: 4.1 adımda aliquoted 2 x ¹⁰⁶ hücrelerini 200 μL seyreltilmiş canlılık boyasında yeniden biriktirin. 100 μL hücreyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne, ısı hücrelerini 65 °C'de 5 dakika ısıtın ve 100 μL ısıdan ölen hücreleri kalan 100 μL canlı hücrelerle orijinal kuyuya geri aktarın.
7. Hücreleri 4 °C'de kuluçkaya yatır, ışıktan korunarak 30 dakika boyunca.
8. Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
9. Hücreleri 200 μL DPBS'de (BSA veya FBS olmadan) yeniden biriktirin.
10. 4.8 ve 4.9.
11. 4.8. adımı yineleyin.
12. Hücreleri 50 μL Fc bloğunda 1:50 (son konsantrasyon=10 μg/mL) leke tamponunda (DPBS'de %0,5 BSA [vol/vol]) yeniden kullanın.
    1. Periton hücreleri için - ayrıca spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için 5 μL monosit bloker ekleyin.
13. Hücreleri 4 °C'de, ışıktan korunarak 15 dakika kuluçkaya yatırın.
14. ¹⁰⁶ hücre başına 100 μl'lik son hacim için leke tamponunda tam leke ana karışımları ve IPO'lar hazırlayın. Antikor listeleri için Tablo 1-Tablo 4'e bakın.
    NOT: IPO'lar, biri hariç tüm antikorlar bir leke setine dahil sunularak yapılır. Bir leke kümesindeki her antikor için bir FDO hazırlayın. Bir leke seti birden fazla parlak boya içerdiğinde, numune başına leke tamponu için 50 μL parlak leke tamponu değiştirin
15. Fc bloğunu çıkarmadan, seçilen kuyulara 100 μL tam leke karışımları ve IPO'lar ekleyin.
16. Bir leke kümesindeki her antikor için tek renk kompanzasyon kontrolleri hazırlayın.
    1. Kompanzasyon boncukları kullanılıyorsa, üretim kullanım talimatlarını izleyin.
    2. Hücreleri kullanıyorsanız, daha önce ^4.6.1 adımında canlılık boyası olmadan ayrılmış 106 hücreye 100 μL leke tamponunda titratlı antikor ekleyin. Numunedeki tüm hücreler belirli bir işaretleyici için pozitifse, akış sitometresinde kompanzasyon verileri elde edilirken kullanılacak lekesiz hücreleri bir kenara bırakın.
17. Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
18. Plakayı 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüj edin. Kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
19. Hücreleri ve boncukları 200 μL leke tamponunda yeniden biriktirin.
20. 4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.
21. 4.18.
22. Analiz için numuneleri 48 saat içinde sabitlemek için, DPBS'de %2 paraformaldehitin 200 μL'sinde hücreleri ve boncukları yeniden biriktirin.
    DİkKAT: Parafomaldehit ciddi bir sağlık tehlikesidir ve yanıcıdır. Kullanmadan önce Safty Veri Sayfası'na bakın.
23. Hücreleri ve boncukları ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
24. 4.18 ve 4.19 adımlarını iki kez yineleyin.
25. Temiz bir 96 kuyu U-alt plaka üzerine bir filtre plakası yerleştirin. Çoklu pipet kullanarak, her numuneyi filtre plakasının bir kuyusuna aktarın.
26. Filtre plakasını santrifüjleyin-96 kuyu U-alt plaka kurulumu 845 x g'da 4 °C'de 2 dakika boyunca. Filtre plakasını çıkarın ve kuyuları çapraz kirletmemeye dikkat ederek plakayı bir lavabonun üzerine hızlı bir şekilde ters çevirip sallayarak süpernatantı deşarje edin.
27. BM ve dalak olgunlaşma panelleri için tamamen lekeli hücreleri 100 μL leke tamponunda yeniden biriktirin. Her hayvan için 2 kuyuyu 1 kuyuda birleştirin. Kalan panelleri, IPO'ları ve kontrolleri 200 μL leke tamponunda yeniden dirileyin.
28. Sabit hücreleri ve boncukları 4 °C'de kuluçkaya yatırın, ışıktan bir gecede korunmaktadır.

5. Akış sitometrik veri toplama

1. Üretici talimatlarına göre akış sitometresini başlatın ve QC' ye edin.
2. Her panele özgü şablonu yükleyin.
3. Verileri kaydetmeden önce, her örnek için tüm olayların ölçek üzerinde olduğundan ve nokta çizimlerinde görünür olduğundan emin olun.
4. Adım 4.16'da hazırlanan tek leke kompanzasyonlarını kullanarak her leke paneli için telafi kontrollerini kaydedin. Her örnek için pozitif ve negatif kapılar ayarlayın. Yazılımın ücret matrisini hesaplamasını salayın.
5. İlk örneği almaya başlayın ve kapıların uygun şekilde ayarlandığından emin olun.
6. Makineyi periton B hücre paneli ve dalak Igφ ve Igφ paneli için en az 50.000 B hücre olayını kaydedecek şekilde ayarlayın; BM olgunlaşma paneli için 150.000 B hücre olayı; ve dalak olgunlaşma paneli için 300.000 B hücre olayı.
7. Her leke paneli için, her hayvan için tamamen lekeli örnekleri, lekelenmemiş bir örneği ve IPO'ları çalıştırın ve kaydedin.

6. Verileri analiz edin

1. Akış sitometri analiz yazılımını kullanarak veri analizine devam edin. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3,Şekil 4'te özetlenen gating stratejilerini izleyin. 

Sonuçlar

Burada fare periton, BM ve dalak B hücre gelişimini karakterize etmek için gating stratejisini sunuyoruz. Analizin temeli canlı boya ile boyama kavramı etrafında oluşur, daha sonra İleri-Dağılım Alanı (FSC-A) ve İleri-Dağılım Yüksekliğine (FSC-H) dayalı çiftleri dışarı çıkarmak ve son olarak hücreleri FSC-A ve Yan Dağılım Alanı (SSC-A) özelliklerine göre seçerek kalıntıların gating' i, burada göreli hücre boyutunu ve hücre ayrıntı düzeyini yansıt...

Tartışmalar

Lenfoid ve lenfoid olmayan dokuların akış sitometrik analizi, 1980'lerden beri farelerde ve insanlarda B hücre alt popülasyonlarının eşzamanlı tanımlanmasını ve numaralandırmasını sağlamıştır. Mizahi bağışıklığın bir ölçüsü olarak kullanılmıştır ve B hücre işlevselliğini değerlendirmek için daha fazla uygulanabilir. Bu yöntem, nadir popülasyonlarda bile B hücre heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlayan birden fazla parametrenin eşzamanlı analizi yoluyla farelerde ve insa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument