Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Resumo

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Resumo

Estudos extensivos caracterizaram o desenvolvimento e diferenciação de células murinas B em órgãos linfoides secundários. Anticorpos secretados por células B foram isolados e desenvolvidos em terapêutica bem estabelecida. A validação do desenvolvimento de células murinas B, no contexto de camundongos propensos a autoimunes, ou em camundongos com sistemas imunológicos modificados, é um componente crucial para desenvolver ou testar agentes terapêuticos em camundongos e é um uso apropriado da citometria de fluxo. Parâmetros citométricos de fluxo celular B bem estabelecidos podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de células B no peritônio murina, medula óssea e baço, mas uma série de melhores práticas devem ser aderidas. Além disso, a análise citométrica de fluxo dos compartimentos de células B também deve complementar leituras adicionais do desenvolvimento de células B. Os dados gerados usando essa técnica podem promover nossa compreensão de modelos de camundongos propensos a doenças, autoimunes, bem como camundongos humanizados que podem ser usados para gerar anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos como terapêuticas.

Introdução

Os anticorpos monoclonais têm se tornado cada vez mais a terapia de escolha para muitas doenças humanas à medida que se tornam parte da medicina ^{convencional1,2}. Descrevemos anteriormente camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos de forma eficiente abrigando regiões variáveis totalmente humanas com constantes de IgH de ^{camundongos3,4}. Mais recentemente, descrevemos camundongos geneticamente modificados que produzem moléculas semelhantes a anticorpos que têm antígeno-vinculativos ^distintos5. Anticorpos são secretados por células B e formam a base da imunidade humorativa adaptativa. Existem dois tipos distintos de células B, B-1 e B-2. Em mamíferos, as células B-1 originam-se no fígado fetal e são enriquecidas em tecidos mucosas e nas cavidades pleural e peritoneal após o nascimento, enquanto as células B-2 se originam no fígado fetal antes do nascimento e posteriormente na medula óssea (MMO). As células B-2 são enriquecidas em órgãos linfoides secundários, incluindo o baço e o sangue ^6,7,8. No BM, progenitores hematopoiéticos B-2 começam a se diferenciar para células pró-B após o início do rearranjo da cadeia pesada Ig ^mu9,10. O rearranjo bem sucedido da cadeia pesada de Ig e sua montagem no receptor de células pré-B (pré-BCR), juntamente com sinalização e expansão proliferativa, leva à diferenciação das células pré-B. Depois que as células pré-B reorganizam suas cadeias leves Ig kappa (Igκ), ou se improdutivas, Ig lambda (Igλ), elas combinam com μ corrente pesada, resultando na expressão IgM BCR superficial. É importante ressaltar que a expressão superficial IgM é conhecida por ser reduzida em condições de autoreatividade, contribuindo assim para a auto tolerância em células B funcionalmente não respondidas ou ^{argicasas11,12}. As células B imaturas então entram em um estágio de transição, onde começam a co-expressar IgD e migram do BM para o baço. No baço, a expressão igD aumenta ainda mais e as células amadurecem em um segundo estágio de células B transitórias, seguidas pela conclusão de seu status de maturação e desenvolvimento em células de zona marginal (MZ) ou folicular (Fol)13,14,15. Em camundongos adultos, em um ambiente não doente, o número de células B maduras permanece constante, apesar de 10-20 milhões de células B imaturas serem geradas diariamente no BM. Destes, apenas 3% entram no pool de células B maduras. O tamanho do compartimento celular B periférico é limitado pela morte celular, devido em parte a vários fatores, incluindo auto-reatividade e maturação incompleta16,17,18. A análise citométrica de fluxo tem sido amplamente usada para caracterizar e enumerar muitos subcompartimentais de células imunes em humanos e camundongos. Embora existam algumas semelhanças entre compartimentos de células B humanas e murinas, este protocolo se aplica apenas à análise de células murinas B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados, para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. A citometria de fluxo também tem sido extremamente popular em muitas aplicações adicionais, incluindo na medição da ativação celular, função, proliferação, análise de ciclo, análise de conteúdo de DNA, apoptose e classificação celular ^19,20.

A citometria de fluxo é a ferramenta escolhida para caracterizar vários compartimentos de linfócitos em camundongos e humanos, inclusive em órgãos complexos como o baço, BM e sangue. Devido a reagentes de anticorpos específicos do rato amplamente disponíveis para citometria de fluxo, esta técnica pode ser usada para investigar não apenas proteínas da superfície celular, mas também fosfoproteínas intracelulares e citocinas, bem como leituras ^funcionais21. Aqui demonstramos como reagentes de citometria de fluxo podem ser usados para identificar subconjuntos de células B à medida que amadurecem e diferenciam em órgãos linfoides secundários. Após a otimização das condições de coloração, manuseio de amostras, configuração correta do instrumento e aquisição de dados e, finalmente, análise de dados, um protocolo para análise citométrica de fluxo abrangente do compartimento celular B em camundongos pode ser utilizado. Tal análise abrangente baseia-se em uma nomenclatura de décadas concebida por Hardy e colegas, onde o desenvolvimento de células BM B-2 pode ser dividido em diferentes frações (Fração) dependendo de sua expressão de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e ^IgD22. Hardy et al., mostraram que as células B220⁺ CD43 BM B podem ser subdivididas em quatro subconjuntos (Fração A-C') com base na expressão BP-1 e CD24 (30F1), enquanto as células B220⁺ CD43^{-(dim to neg)} BM B podem ser resolvidas em três subconjuntos (Fração D-F) com base na expressão diferencial de IgD e IgM23 de superfície. A fração A (células pré-pró-B) são definidas como BP-1^- CD24 (30F1)^-, A fração B (células pro-B precoces) são definidas como BP-1^- CD24 (30F1)⁺, Fração C (células pro-B tardias) são definidas como BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, e Fração C' (células pré-B precoces) são definidas como BP-1⁺ e CD24nenta. Além disso, as células Fração D (pré-B) são definidas como células B220⁺ CD43-IgM-B e Fração E (células B recém-geradas, combinação de imaturo e transitório) são definidas como células B220⁺ CD43^- IgM⁺ B e Fraction F (células B maduras e recircuturas) são definidas como células B220high CD43^- IgM⁺ B. Em contraste, a maioria das células B ingênuas encontradas no baço pode ser dividida em células B maduras (B220⁺ CD93^-) e células transitórias (T1, T2, T3) dependendo da expressão de CÉLULAS CD93, CD23 e IgM. Células B maduras podem ser resolvidas em subconjuntos marginais e foliculares baseados na expressão de IgM e CD21/CD35, e subconjuntos foliculares podem ser ainda divididos em subconjuntos de células foliculares maduras tipo I e folicular tipo II B, dependendo do nível de sua expressão de superfície IgM e ^IgD24. Essas populações de células B esplênicas expressam predominantemente cadeia de luz Igκ. Finalmente, as populações de células B-1 B, que se originam no fígado fetal e são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural de camundongos adultos, foram descritas na literatura. Estas células B peritoneal podem ser distinguidas das células B-2 B descritas anteriormente pela falta de expressão CD23. Eles são então subdivididos em populações B-1a ou B-1b, com o primeiro definido pela presença de CD5 e o segundo por sua ^ausência25. Progenitores de células B-1 são abundantes no fígado fetal, mas não são encontrados em BM adulto. Enquanto as células B-1a e B-1b são originárias de diferentes progenitores, ambas semearam as cavidades peritoneal e ^pleural24. Em contraste com as células B-2, as células B-1 são exclusivamente capazes de auto-renovação e são responsáveis pela produção de anticorpos IgM naturais.

Defeitos no desenvolvimento celular B podem surgir em muitos casos, incluindo deficiências nos componentes do ^BCR26,27, perturbações de moléculas de sinalização que impactam a força de sinalização BCR14,28,29, ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular ^B30,31 . A análise da citometria de fluxo dos compartimentos linfoides contribuiu para a caracterização dos blocos de desenvolvimento de células B nesses camundongos e muitos outros. Uma vantagem da análise citométrica de fluxo dos compartimentos linfoides é que ele oferece a capacidade de fazer medições em células individuais obtidas a partir de tecido dissociado vivo. A disponibilidade de reagentes em uma gama cada vez maior de fluoroforos permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Além disso, a enumeração das células B por análise citométrica de fluxo complementa outros ensaios imunológicos, como métodos imunohistoquímicos que visualizam a localização celular dentro de órgãos linfoides, detecção de níveis de anticorpos circulantes como medida de imunidade humoral, bem como duas microscopia fótons para medir as respostas das células B no espaço real e no ^tempo32.

Protocolo

Todos os estudos sobre camundongos foram supervisionados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Regeneron. O experimento foi realizado em tecidos de três camundongos C57BL/6J femininos (17 semanas de idade) dos Laboratórios Jackson. Titular todos os anticorpos antes de iniciar o experimento para determinar a concentração ideal. Ao usar contas de compensação para compensação de cor única, certifique-se de que elas colorem tão brilhantes ou brilhantes do que suas amostras. Mantenha todos os buffers, anticorpos e células no gelo ou a 4 °C. Após a adição de corante de viabilidade, realize todas as etapas e incubações a 4°C em luz baixa ou no escuro.

1. Colheita de células peritoneais e isolamento celular único

1. Eutanize o mouse usando _CO2 ou de acordo com o protocolo aprovado_.
2. Coloque o rato nas costas, pulverize com 70% de etanol, e corte a pele abdominal externa com uma tesoura, tomando cuidado para não cortar o peritônio.
3. Injete 3 mL de tampão de lavagem gelada (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS [vol/vol]) na cavidade peritoneal com uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de calibre 25.
4. Massageie suavemente o peritônio com as pontas dos dedos.
5. Repita as etapas 1.3 e 1.4.
6. Insira uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de 18 G através do peritônio, tomando cuidado para evitar órgãos e gordura.
7. Extrair o tampão de lavagem, agora contendo células peritoneais, e transferir para tubo cônico de 15 mL no gelo.
8. Repita as etapas 1.3 e 1.4.
9. Faça um pequeno buraco no peritônio enquanto segura com pinças.
10. Insira uma pipeta de transferência descartável no orifício e colete o tampão de lavagem restante, mais uma vez evitando gordura e órgãos.
11. Transfira as células peritoneais remanescentes coletadas para o tubo cônico de 15 mL no gelo.
    NOTA: Descarte a amostra se a contaminação sanguínea for evidente.
12. Incubar as células no gelo até que o baço e a extração óssea estejam completos.
13. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
14. Resuspense a pelota da célula em 1 mL de tampão de lavagem.
15. Filtre as células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
16. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

2. Colheita de baço e isolamento de célula única

1. Coloque o rato em sua barriga e corte o peritônio na parte traseira esquerda usando uma tesoura limpa. Corte o baço, removendo gordura e tecido conjuntivo.
2. Transfira o baço para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de lavagem no gelo.
3. Incubar o baço no gelo até que a extração óssea esteja completa.
4. Mova o baço para o tubo de dissociação automatizado com 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Coloque o tubo no instrumento dissociador do tecido e dissociar por 60 s para criar uma única suspensão celular.
   NOTA: Também é permitido usar outros métodos de rotina para obter suspensões de baço de célula única, como quebrar entre lâminas de vidro fosco no tampão de lavagem. Se for utilizado outro método de dissociação, siga a dissociação com centrifugação, aspiração e, em seguida, resuspensão em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos antes de continuar a etapa 2.5.
5. Incubar as células à temperatura ambiente por 3 minutos.
6. Adicione 10 mL de tampão de lavagem de 4 °C contendo 2mM EDTA.
7. Transfira para um tubo cônico limpo de 15 mL.
8. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
9. Resuspenda a pelota da célula em 5 mL de tampão de lavagem de 4 °C.
10. Filtre as células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
11. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

3. Colheita de BM e isolamento de célula única

1. Remova a pele da metade inferior do corpo do rato. Corte o excesso de músculo da perna. Retire toda a perna com uma tesoura, tomando cuidado para não cortar o fêmur. Limpe o fêmur e a tíbia removendo o músculo, gordura e pés restantes.
2. Transfira os ossos para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de lavagem no gelo.
3. Perfure o fundo de um tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL, deixando um orifício pequeno o suficiente para os ossos das pernas não se projetarem. Insira o tubo de 0,5 mL em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL limpo. Corte a extremidade do fêmur e da tíbia proximal até o joelho e coloque as extremidades de corte voltadas para baixo no tubo de 0,5 mL.
4. Centrifugar as células a 6.780 x g por 2 min a 4 °C.
5. Resuspenha a pelota celular em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo um adicional de 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
6. Incubar em temperatura ambiente por 3 minutos.
7. Adicione 10 mL de tampão de lavagem de 4 °C contendo 2mM EDTA.
8. Centrifugar as células a 300 x g por 8 min a 4 °C. Aspire o supernatante.
9. Resuspenda a pelota da célula em 3 mL de tampão de lavagem de 4 °C.
10. Filtrar células através de um coador de células de 70 μM em um tubo cônico limpo de 15 mL no gelo.
11. Determine a concentração celular usando um instrumento de contador celular ou hemócito.

4. Colori manchas de células e prepare compensação

1. Alíquota ¹⁰⁶ células de cada tipo de célula de cada animal para uma placa inferior 96 bem U.
   1. Certifique-se de incluir poços suficientes para todas as amostras e controles, incluindo mancha completa, fluorescência-menos-um (FMO), não manchada, e finalmente a compensação opcional de cor única para cada fluoróforo usado.
   2. Para o painel de maturação BM e o painel de maturação do baço, as células de alíquota em 2 poços, ¹⁰⁶ células por poço, para cada amostra completa de manchas. Para os controles de viabilidade de compensação de uma cor única, adicione 2 x ¹⁰⁶ células de cada tipo de célula a poços individuais.
2. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
3. Resuspensar as células em 200 μL de DPBS (sem BSA ou FBS). Este passo é importante para remover a proteína antes de colorir com corante de viabilidade amina-reativa.
4. Repita as etapas 4.2 e 4.3.
5. Repita o passo 4.2.
6. Resuspend as células em 100 μL de diluição de corante de viabilidade diluído 1:1.000 em DPBS.
   NOTA: Se usar células para compensação de cor única, não adicione corante de viabilidade a esses poços.
   1. Para cada conjunto de manchas, deixe vários poços não manchados para uma amostra completamente inconteídia e quaisquer outros controles que você possa precisar.
   2. Para cada conjunto de manchas, deixe um poço adicional não manchado para o controle FMO de viabilidade.
   3. Para os controles de compensação de viabilidade de cor única: Resuspend as células 2 x ¹⁰⁶ , aliquos na etapa 4.1, em 200 μL de corante diluído de viabilidade. Transfira 100 μL de células para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, células de calor por 5 min a 65 °C e transfira os 100 μL de células mortas pelo calor de volta ao poço original com as células vivas restantes de 100 μL.
7. Incubar células a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
8. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
9. Resuspensar as células em 200 μL de DPBS (sem BSA ou FBS).
10. Repita as etapas 4.8 e 4.9.
11. Repita o passo 4.8.
12. Resuspense as células em 50 μL de bloco Fc diluído 1:50 (concentração final=10 μg/mL) no tampão de manchas (0,5% BSA em DPBS [vol/vol]).
    1. Para células peritoneais - adicione também 5 μL de bloqueador de monócitos para reduzir a coloração não específica.
13. Incubar as células a 4 °C, protegidas da luz, por 15 minutos.
14. Prepare misturas completas de mestre de manchas e FMOs no tampão de manchas para um volume final de 100 μl por ¹⁰⁶ células. Consulte a Tabela 1-Tabela 4 para as listas de anticorpos.
    NOTA: Os FMOs são feitos por incluir todos os anticorpos em um conjunto de manchas, exceto um. Prepare um FMO para cada anticorpo em um conjunto de manchas. Quando um conjunto de manchas contém vários corantes brilhantes, substitua 50 μL de tampão de manchas brilhante para tampão de manchas por amostra
15. Sem remover o bloco Fc, adicione 100 μL de misturas de manchas completas e FMOs aos poços selecionados.
16. Prepare controles de compensação de cores únicas para cada anticorpo em um conjunto de manchas.
    1. Se usar contas de compensação siga as instruções do fabricante para uso.
    2. Se usar células, adicione anticorpos titutados a ¹⁰⁶ células, reservada anteriormente na etapa 4.6.1 sem corante de viabilidade, em tampão de manchas de 100 μL. Se todas as células da amostra forem positivas para um marcador específico, reserve células não manchadas para serem usadas ao adquirir dados de compensação no citómetro de fluxo.
17. Incubar as células e as contas a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
18. Centrifugar a placa a 845 x g por 2 min a 4 °C. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar cruzmente os poços.
19. Resuspense as células e contas em 200 μL de tampão de manchas.
20. Repita as etapas 4.18 e 4.19 duas vezes.
21. Repita o passo 4.18.
22. Para fixar as amostras para análise dentro de 48 h, resuspend células e contas em 200 μL de 2% paraformaldeído em DPBS.
    ATENÇÃO: O parafomaldeído é um sério risco à saúde e inflamável. Consulte a Folha de Dados Safty antes de usar.
23. Incubar as células e as contas a 4 °C, protegidas da luz, por 30 minutos.
24. Repita as etapas 4.18 e 4.19 duas vezes.
25. Coloque uma placa de filtro sobre uma placa de fundo U limpa de 96 poços. Usando uma multi-pipeta, transfira cada amostra para um poço da placa do filtro.
26. Centrifugar a placa do filtro-96 bem configuração de placa de fundo U a 845 x g para 2 min a 4 °C. Remova a placa do filtro e decante o supernatante invertendo rapidamente e movendo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar os poços.
27. Para os painéis de maturação de BM e baço, resuspenja as células totalmente manchadas em 100 μL de tampão de manchas. Misture os 2 poços para cada animal em 1 bem. Resuspenque os painéis restantes, FMOs e controles em 200 μL de tampão de manchas.
28. Incubar células fixas e contas a 4 °C, protegidas da luz, durante a noite.

5. Aquisição de dados citométricos de fluxo

1. Inicialize e QC o citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante.
2. Carregue o modelo específico para cada painel.
3. Antes de registrar dados, certifique-se de que todos os eventos para cada amostra estejam em escala e visíveis nas parcelas de pontos.
4. Controle de compensação recorde para cada painel de manchas utilizando compensações de manchas únicas preparadas na etapa 4.16. Estabeleça portões positivos e negativos para cada amostra. Que o software calcule a matriz de compensação.
5. Comece a adquirir a primeira amostra e certifique-se de que os portões sejam definidos adequadamente.
6. Defina a máquina para gravar pelo menos 50.000 eventos de células B para o painel de células B peritoneal e o painel de baço Igκ e Igλ; Eventos de células B de 150.000 para o painel de maturação BM; e 300.000 eventos de células B para o painel de maturação do baço.
7. Para cada painel de manchas, execute e regise as amostras totalmente manchadas para cada animal, uma amostra não manchada e as FMOs.

6. Analisar dados

1. Prossiga com a análise de dados usando o software de análise de citometria de fluxo. Siga as estratégias de gating descritas na Figura 1, Figura 2, Figura 3,Figura 4. 

Resultados

Aqui apresentamos a estratégia de gating para caracterizar o desenvolvimento de células B no peritônio do rato, BM e baço. A base da análise é formada em torno do conceito de coloração com corante viável, em seguida, gating out doublets com base nas características de Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e finalmente gating out detritos selecionando células de acordo com suas características FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), referidos aqui como o por...

Discussão

A análise citométrica do fluxo de tecidos linfoides e não linfoides permitiu a identificação e enumeração simultânea de sub-populações de células B em camundongos e humanos desde a década de 1980. Tem sido usado como uma medida de imunidade humoral e pode ser aplicado ainda mais para avaliar a funcionalidade de células B. Este método aproveita a disponibilidade de reagentes para avaliar diferentes estágios de maturação celular B em camundongos e humanos, por meio da análise simultânea de múltiplos par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument