Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Zusammenfassung

Umfangreiche Studien haben die Entwicklung und Differenzierung von murinen B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen charakterisiert. Antikörper, die von B-Zellen sezerniert werden, wurden isoliert und zu etablierten Therapeutika weiterentwickelt. Die Validierung der Entwicklung von murinen B-Zellen im Zusammenhang mit autoimmunanfälligen Mäusen oder bei Mäusen mit verändertem Immunsystem ist ein entscheidender Bestandteil der Entwicklung oder Erprobung von Therapeutika bei Mäusen und eine geeignete Anwendung der Durchflusszytometrie. Gut etablierte zytometrische Parameter des B-Zell-Flusses können verwendet werden, um die B-Zell-Entwicklung im murinen Peritoneum, Knochenmark und Milz zu bewerten, aber eine Reihe von Best Practices müssen eingehalten werden. Darüber hinaus sollte die durchflusszytometrische Analyse von B-Zell-Kompartimenten auch zusätzliche Ablesungen der B-Zell-Entwicklung ergänzen. Daten, die mit dieser Technik generiert werden, können unser Verständnis von wildtypischen, autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen verbessern, die zur Erzeugung von Antikörpern oder antikörperähnlichen Molekülen als Therapeutika verwendet werden können.

Einleitung

Monoklonale Antikörper sind zunehmend zur bevorzugten Therapie für viele menschliche Krankheiten geworden, da sie Teil der Schulmedizin ^werden1,2. Wir haben zuvor gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die effizient Antikörper produzieren, die vollständig menschliche variable Regionen mit Maus-IgH-Konstanten ^{beherbergen3,4}. Zuletzt haben wir gentechnisch veränderte Mäuse beschrieben, die antikörperähnliche Moleküle produzieren, die eine ausgeprägte Antigenbindung ^aufweisen5. Antikörper werden von B-Zellen sezerniert und bilden die Grundlage der adaptiven humoralen Immunität. Es gibt zwei verschiedene Arten von B-Zellen, B-1 und B-2. Bei Säugetieren stammen B-1-Zellen aus der fetalen Leber und sind nach der Geburt im Schleimhautgewebe und in der Pleura- und Peritonealhöhle angereichert, während B-2-Zellen vor der Geburt in der fetalen Leber und danach im Knochenmark (BM) entstehen. B-2-Zellen sind in sekundären lymphatischen Organen einschließlich Milz und Blut ^{angereichert6,7,8}. In der BM beginnen B-2 hämatopoetische Vorläuferzellen mit der Initiierung der Ig mu schweren Kettenumlagerung zu Pro-B-Zellen zu ^{differenzieren9,10}. Die erfolgreiche Umlagerung der schweren Ig-Kette und ihre Montage in den Prä-B-Zell-Rezeptor (Pre-BCR) führt zusammen mit der Signalgebung und proliferativen Expansion zu einer Differenzierung zu Prä-B-Zellen. Nachdem Prä-B-Zellen ihre Ig kappa (Igκ) oder, wenn unproduktiv, Ig lambda (Igλ) leichten Ketten neu angeordnet haben, paaren sie sich mit μ schweren Kette, was zu einer Oberflächen-IgM-BCR-Expression führt. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass bekannt ist, dass die IgM-Oberflächenexpression unter Bedingungen der Autoreaktivität reduziert wird, was zur Selbsttoleranz in funktionell nicht reagierenden oder anergen B-Zellen ^{beiträgt11,12}. Unreife B-Zellen treten dann in ein Übergangsstadium ein, in dem sie beginnen, IgD mitzuexprimieren und vom BM in die Milz zu wandern. In der Milz nimmt die IgD-Expression weiter zu und die Zellen reifen zu einem zweiten Stadium von Übergangs-B-Zellen heran, gefolgt von der Vollendung ihres Reifungsstatus und der Entwicklung zu entweder marginalen Zonen( MZ) oder follikulären (Fol) Zellen13,14,15. Bei erwachsenen Mäusen bleibt die Anzahl der reifen B-Zellen in einer nicht erkrankten Umgebung konstant, obwohl täglich 10-20 Millionen unreife B-Zellen im BM erzeugt werden. Davon gelangen nur drei Prozent in den Pool der reifen B-Zellen. Die Größe des peripheren B-Zell-Kompartiments wird durch den Zelltod eingeschränkt, was zum Teil auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter Selbstreaktivität und unvollständige Reifung16,17,18. Die durchflusszytometrische Analyse wurde umfassend eingesetzt, um viele Immunzellunterkompartimente bei Menschen und Mäusen zu charakterisieren und aufzuzählen. Während es einige Ähnlichkeiten zwischen menschlichen und murinen B-Zell-Kompartimenten gibt, gilt dieses Protokoll nur für die Analyse von murinen B-Zellen. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren, um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zellentwicklung verändern würde. Die Durchflusszytometrie ist auch in vielen weiteren Anwendungen sehr beliebt, darunter bei der Messung von Zellaktivierung, Funktion, Proliferation, Zyklusanalyse, DNA-Gehaltsanalyse, Apoptose und Zellsortierung ^19,20.

Die Durchflusszytometrie ist das Werkzeug der Wahl, um verschiedene Lymphozytenkompartimente bei Mäusen und Menschen zu charakterisieren, einschließlich komplexer Organe wie Milz, BM und Blut. Aufgrund der weit verbreiteten mausspezifischen Antikörperreagenzien für die Durchflusszytometrie kann mit dieser Technik nicht nur Zelloberflächenproteine, sondern auch intrazelluläre Phosphoproteine und Zytokine sowie funktionelle Auslesungen untersucht ^werden21. Hierin zeigen wir, wie Durchflusszytometrie-Reagenzien verwendet werden können, um B-Zell-Untergruppen zu identifizieren, wenn sie in sekundären lymphatischen Organen reifen und differenzieren. Nach der Optimierung der Färbebedingungen, der Probenhandhabung, der korrekten Geräteeinrichtung und Datenerfassung und schließlich der Datenanalyse kann ein Protokoll für die umfassende durchflusszytometrische Analyse des B-Zell-Kompartiments bei Mäusen verwendet werden. Eine solche umfassende Analyse basiert auf einer jahrzehntealten Nomenklatur, die von Hardy und Kollegen entwickelt wurde, wobei sich entwickelnde BM B-2-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Expression von B220, CD43, BP-1, CD24, IgM und ^IgD22 in verschiedene Fraktionen (Fraction) unterteilt werden können. Hardy et al. zeigten, dass B220⁺ CD43 BM B-Zellen auf der Grundlage der BP-1- und CD24(30F1)-Expression in vier Untergruppen (Fraction A-C') unterteilt werden können, während B220⁺ CD43^{-(dim to neg) BM B-Zellen} basierend auf der differentiellen Expression von IgD und Oberflächen-IgM23 in drei Untergruppen (Fraction D-F') aufgelöst werden können. Fraktion A (Prä-Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1^- CD24 (30F1)^-, Fraktion B (frühe Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1^- CD24 (30F1)⁺, Fraktion C (späte Pro-B-Zellen) sind definiert als BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺ und Fraktion C' (frühe Prä-B-Zellen) sind als BP-1⁺ und CD24high definiert. Darüber hinaus sind Fraktion D (Prä-B-Zellen) definiert als B220 ⁺ CD43^- IgM^{- B-Zellen}, und Fraktion E (neu erzeugte B-Zellen, Kombination von unreifen und Übergangszellen) sind definiert als B220 ⁺ CD43^- IgM ⁺ B-Zellen und Fraktion F (reife, rezirkulierende B-Zellen) sind definiert als B220high CD43^- IgM ⁺ B-Zellen. Im Gegensatz dazu kann die Mehrheit der naiven B-Zellen in der Milz in reife (B220⁺ CD93^{-) B-Zellen} und Übergangszellen (T1, T2, T3) unterteilt werden, abhängig von der Expression von CD93, CD23 und IgM. Reife B-Zellen können basierend auf der Expression von IgM und CD21/CD35 in Marginalzonen und follikuläre Untergruppen aufgelöst werden, und follikuläre Untergruppen können weiter in reife follikuläre Typ I und follikuläre Typ II B-Zelluntergruppen unterteilt werden, abhängig von der Ebene ihrer IgM- und IgD-Oberflächenexpression24. Diese Milz-B-Zell-Populationen exprimieren überwiegend Igκ-Leichtketten. Schließlich wurden B-1 B-Zellpopulationen, die aus der fetalen Leber stammen und hauptsächlich in den Peritoneal- und Pleurahöhlen erwachsener Mäuse vorkommen, in der Literatur beschrieben. Diese peritonealen B-Zellen können von den zuvor beschriebenen B-2 B-Zellen durch ihre fehlende CD23-Expression unterschieden werden. Sie werden dann weiter in B-1a- oder B-1b-Populationen unterteilt, wobei erstere durch das Vorhandensein von CD5 und letztere durch sein Fehlen ^{definiert werden25}. B-1-Zell-Vorläufer sind in der fetalen Leber reichlich vorhanden, werden aber nicht in erwachsenen BM gefunden. Während B-1a- und B-1b-Zellen von verschiedenen Vorläuferzellen stammen, säen beide die Peritoneal- und ^{Pleurahöhle24}. Im Gegensatz zu B-2-Zellen sind B-1-Zellen einzigartig in der Lage, sich selbst zu erneuern und sind für die Produktion natürlicher IgM-Antikörper verantwortlich.

Defekte in der B-Zell-Entwicklung können in vielen Fällen auftreten, einschließlich Mängel in den Komponenten des ^BCR26,27, Störungen von Signalmolekülen, die die BCR-Signalstärke beeinflussen14,28,29, oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen ^{modulieren30,31} . Die durchflusszytometrische Analyse der lymphatischen Kompartimente hat zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklungsblöcke bei diesen Mäusen und vielen anderen beigetragen. Ein Vorteil der durchflusszytometrischen Analyse von lymphatischen Kompartimenten besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, Messungen an einzelnen Zellen durchzuführen, die aus lebendem dissoziiertem Gewebe gewonnen werden. Die Verfügbarkeit von Reagenzien in einem ständig wachsenden Spektrum von Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Darüber hinaus ergänzt die Aufzählung von B-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse andere immunologische Assays wie immunhistochemische Methoden, die die Zelllokalisierung in lymphatischen Organen visualisieren, den Nachweis zirkulierender Antikörperspiegel als Maß für die humorale Immunität sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Messung von B-Zell-Antworten in realem Raum und ^Zeit32.

Protokoll

Alle Mausstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Regeneron überwacht und genehmigt. Das Experiment wurde an Geweben von drei weiblichen C57BL/6J-Mäusen (17 Wochen) der Jackson Laboratories durchgeführt. Titrieren Sie alle Antikörper vor Beginn des Experiments, um die ideale Konzentration zu bestimmen. Wenn Sie Kompensationsperlen für die einfarbige Kompensation verwenden, stellen Sie sicher, dass sie so hell oder heller färben als Ihre Proben. Bewahren Sie alle Puffer, Antikörper und Zellen auf Eis oder bei 4 °C auf. Führen Sie nach Zugabe von Lebensfähigkeitsfarbstoff alle Schritte und Inkubationen bei 4 ° C entweder bei schwachem Licht oder im Dunkeln durch.

1. Peritoneale Zellernte und Einzelzellisolierung

1. Die Maus wird mit _CO2 oder nach zugelassenem Protokoll eingeschläfert_.
2. Legen Sie die Maus auf den Rücken, sprühen Sie mit 70% Ethanol und schneiden Sie die äußere Bauchhaut mit einer Schere ab, wobei Sie darauf achten, das Peritoneum nicht zu schneiden.
3. 3 ml eisgekühlter Waschpuffer (0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS [vol/vol]) werden mit einer 3 ml Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel versehen ist, in die Peritonealhöhle injiziert.
4. Massieren Sie das Peritoneum sanft mit den Fingerspitzen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4.
6. Führen Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 18-G-Nadel durch das Peritoneum ein und achten Sie darauf, Organe und Fett zu vermeiden.
7. Extrahieren Sie den Waschpuffer, der jetzt Peritonealzellen enthält, und übertragen Sie ihn auf 15 ml konisches Rohr auf Eis.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4.
9. Schneiden Sie ein kleines Loch in das Peritoneum, während Sie mit einer Pinzette halten.
10. Führen Sie eine Einweg-Transferpipette in das Loch ein und sammeln Sie den verbleibenden Waschpuffer ein, wobei Sie erneut Fett und Organe vermeiden.
11. Übertragen Sie die gesammelten verbleibenden Peritonealzellen in das 15 ml lange konische Rohr auf Eis.
    HINWEIS: Verwerfen Sie die Probe, wenn eine Blutkontamination offensichtlich ist.
12. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis, bis die Milz- und Knochenextraktion abgeschlossen ist.
13. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
14. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Waschpuffer.
15. Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
16. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.

2. Milzernte und Einzelzellisolierung

1. Legen Sie die Maus auf den Bauch und schneiden Sie das Peritoneum auf der linken Rückseite mit einer sauberen Schere durch. Schneiden Sie die Milz aus und entfernen Sie Fett und Bindegewebe.
2. Geben Sie die Milz in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Waschpuffer auf Eis.
3. Inkubieren Sie die Milz auf Eis, bis die Knochenextraktion abgeschlossen ist.
4. Bewegen Sie die Milz in einen automatisierten Dissoziationsschlauch mit 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen. Legen Sie den Schlauch auf das Gewebedissoziatorinstrument und dissoziieren Sie für 60 s, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen.
   HINWEIS: Es ist auch zulässig, andere Routinemethoden zur Gewinnung einzelliger Milzsuspensionen anzuwenden, z. B. das Zertrümmern zwischen Milchglasobjektträgern im Waschpuffer. Wenn eine andere Methode der Dissoziation verwendet wird, folgen Sie der Dissoziation mit Zentrifugation, Aspiration und dann Resuspension in 5 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen, bevor Sie mit Schritt 2.5 fortfahren.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 3 min.
6. Fügen Sie 10 ml 4 °C Waschpuffer mit 2 mM EDTA hinzu.
7. In ein sauberes konisches 15-ml-Rohr geben.
8. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL 4 °C Waschpuffer.
10. Filtern Sie die Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
11. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.

3. BM-Ernte und Einzelzellisolierung

1. Entfernen Sie die Haut von der unteren Hälfte des Mauskörpers. Schneiden Sie den überschüssigen Muskel vom Bein ab. Entfernen Sie das gesamte Bein mit einer Schere und achten Sie darauf, den Oberschenkelknochen nicht zu schneiden. Reinigen Sie den Femur und die Tibia, indem Sie die verbleibenden Muskeln, Fett und Füße entfernen.
2. Übertragen Sie die Knochen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml Waschpuffer auf Eis.
3. Perforieren Sie den Boden eines 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens und lassen Sie ein Loch zurück, das klein genug ist, damit die Beinknochen nicht hervorstehen. Führen Sie das 0,5 ml Röhrchen in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen ein. Schneiden Sie das Ende des Femurs und der Tibia proximal zum Knie ab und legen Sie die geschnittenen Enden nach unten in die 0,5 ml Röhre.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.780 x g für 2 min bei 4 °C.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen und übertragen Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das zusätzliche 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen enthält.
6. Bei Raumtemperatur 3 Min. inkubieren.
7. Fügen Sie 10 ml 4 °C Waschpuffer mit 2 mM EDTA hinzu.
8. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 8 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand.
9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml 4 °C Waschpuffer.
10. Filtern Sie Zellen durch ein 70 μM Zellsieb in ein sauberes 15 ml konisches Rohr auf Eis.
11. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzählerinstrument oder Hämozytometer.

4. Färben Sie Zellen und bereiten Sie den Ausgleich vor

1. Aliquot ¹⁰⁶ Zellen jedes Zelltyps von jedem Tier zu einer 96 Well U Bodenplatte.
   1. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Vertiefungen für alle Proben und Kontrollen enthalten, einschließlich Vollfärbung, Fluoreszenz-Minus-Eins (FMO), ungefärbt und schließlich die optionale einfarbige Kompensation für jeden verwendeten Fluorophor.
   2. Für das BM-Reifungspanel und das Milzreifungspanel aliquote Zellen in 2 Vertiefungen, ¹⁰⁶ Zellen pro Vertiefung, für jede vollständige Färbeprobe. Für die einfarbigen Kompensationsfähigkeitssteuerungen fügen Sie 2 x ¹⁰⁶ Zellen jedes Zelltyps zu einzelnen Vertiefungen hinzu.
2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL DPBS (ohne BSA oder FBS). Dieser Schritt ist wichtig, um Protein vor der Färbung mit aminreaktivem Lebensfähigkeitsfarbstoff zu entfernen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3.
5. Wiederholen Sie Schritt 4.2.
6. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL Lebensfähigkeitsfarbstoff verdünnt 1:1.000 in DPBS.
   HINWEIS: Wenn Sie Zellen für die einfarbige Kompensation verwenden, fügen Sie diesen Vertiefungen keinen Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu.
   1. Lassen Sie für jedes Fleckenset mehrere ungefärbte Vertiefungen für eine vollständig ungefärbte Probe und alle anderen Kontrollen, die Sie möglicherweise benötigen.
   2. Lassen Sie für jedes Fleckenset eine zusätzliche unbefleckte Vertiefung für die FMO-Kontrolle der Lebensfähigkeit.
   3. Für die einfarbigen Lebensfähigkeitskompensationskontrollen: Resuspendieren Sie die 2 x ¹⁰⁶ Zellen, aliquoted in Schritt 4.1, in 200 μL verdünntem Lebensfähigkeitsfarbstoff. Übertragen Sie 100 μL Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, erwärmen Sie die Zellen für 5 minuten bei 65 ° C und übertragen Sie die 100 μL wärmegetöteten Zellen zurück in den ursprünglichen Brunnen mit den verbleibenden 100 μL lebenden Zellen.
7. Inkubieren Sie Zellen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
8. Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL DPBS (ohne BSA oder FBS).
10. Wiederholen Sie die Schritte 4.8 und 4.9.
11. Wiederholen Sie Schritt 4.8.
12. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL Fc-Block verdünnt 1:50 (Endkonzentration = 10 μg / ml) in Fleckenpuffer (0,5% BSA in DPBS [vol / vol]).
    1. Für Peritonealzellen - fügen Sie auch 5 μL Monozytenblocker hinzu, um unspezifische Färbungen zu reduzieren.
13. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 15 min.
14. Bereiten Sie vollständige Flecken-Master-Mischungen und FMOs im Fleckenpuffer für ein Endvolumen von 100 μl pro ¹⁰⁶ Zellen vor. Die Antikörperlisten finden Sie in Tabelle 1-Tabelle 4 .
    HINWEIS: FMOs werden hergestellt, indem alle Antikörper bis auf einen in ein Fleckenset aufgenommen werden. Bereiten Sie für jeden Antikörper in einem Fleckenset eine FMO vor. Wenn ein Fleckenset mehrere Brillantefarbstoffe enthält, ersetzen Sie 50 μL Brillantfleckenpuffer durch Fleckenpuffer pro Probe
15. Ohne den Fc-Block zu entfernen, fügen Sie 100 μL vollständige Fleckenmischungen und FMOs zu ausgewählten Vertiefungen hinzu.
16. Bereiten Sie einfarbige Kompensationskontrollen für jeden Antikörper in einem Fleckenset vor.
    1. Wenn Sie Kompensationsperlen verwenden, befolgen Sie die Gebrauchsanweisung des Herstellers.
    2. Wenn Sie Zellen verwenden, geben Sie titrierten Antikörper zu ¹⁰⁶ Zellen, die zuvor in Schritt 4.6.1 ohne Lebensfähigkeitsfarbstoff reserviert waren, in 100 μL Fleckenpuffer. Wenn alle Zellen in der Probe positiv für einen bestimmten Marker sind, legen Sie nicht gefärbte Zellen beiseite, die bei der Erfassung von Kompensationsdaten auf dem Durchflusszytometer verwendet werden sollen.
17. Inkubieren Sie die Zellen und Kügelchen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
18. Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Brunnen nicht kreuzkontaminiert werden.
19. Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 μL Fleckenpuffer.
20. Wiederholen Sie die Schritte 4.18 und 4.19 zweimal.
21. Wiederholen Sie Schritt 4.18.
22. Um die Proben für die Analyse innerhalb von 48 h zu fixieren, resuspend Zellen und Kügelchen in 200 μL 2% Paraformaldehyd in DPBS.
    VORSICHT: Parafomaldehyd ist ein ernstes Gesundheitsrisiko und brennbar. Lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt.
23. Inkubieren Sie die Zellen und Kügelchen bei 4 °C, vor Licht geschützt, für 30 min.
24. Wiederholen Sie die Schritte 4.18 und 4.19 zweimal.
25. Legen Sie eine Filterplatte über eine saubere 96-Well-U-Bodenplatte. Mit einer Multipipette wird jede Probe in eine Vertiefung der Filterplatte gegeben.
26. Zentrifugieren Sie die Filterplatte-96 Well U-Bodenplatte bei 845 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie die Filterplatte und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen, wobei Sie darauf achten, dass die Vertiefungen nicht kreuzkontaminiert werden.
27. Für die BM- und Milzreifungsplatten resuspen die vollständig gefärbten Zellen in 100 μL Fleckenpuffer. Kombinieren Sie die 2 Vertiefungen für jedes Tier zu 1 Vertiefung. Resuspendieren Sie die verbleibenden Panels, FMOs und Kontrollen in 200 μL Fleckenpuffer.
28. Fixierte Zellen und Kügelchen bei 4 °C, lichtgeschützt, über Nacht inkubieren.

5. Durchflusszytometrische Datenerfassung

1. Initialisieren und QC des Durchflusszytometers gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Laden Sie die für jeden Bereich spezifische Vorlage.
3. Stellen Sie vor dem Aufzeichnen der Daten sicher, dass alle Ereignisse für jede Stichprobe maßstabsgetreu und auf den Punktdiagrammen sichtbar sind.
4. Zeichnen Sie die Kompensationskontrollen für jedes Fleckenpanel mit einzelnen Fleckenkompensationen auf, die in Schritt 4.16 vorbereitet wurden. Legen Sie positive und negative Gatter für jede Probe fest. Lassen Sie die Software die Vergütungsmatrix berechnen.
5. Beginnen Sie mit der Erfassung der ersten Probe und stellen Sie sicher, dass die Gates entsprechend festgelegt sind.
6. Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie mindestens 50.000 B-Zellereignisse für das peritoneale B-Zellpanel und das Milz-Igκ- und Igλ-Panel aufzeichnet. 150.000 B-Zell-Events für das BM-Reifungspanel; und 300.000 B-Zellereignisse für das Milzreifungspanel.
7. Führen Sie für jede Fleckenplatte die vollständig gefärbten Proben für jedes Tier, eine nicht gefärbte Probe und die FMOs aus und zeichnen Sie sie auf.

6. Daten analysieren

1. Fahren Sie mit der Datenanalyse mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware fort. Befolgen Sie die in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 beschriebenen Gating-Strategien. 

Ergebnisse

Hier stellen wir die Gating-Strategie zur Charakterisierung der B-Zell-Entwicklung in Mausperitoneum, BM und Milz vor. Die Grundlage der Analyse bildet das Konzept der Färbung mit Lebensfähigkeitsfarbstoff, dann das Ausstecken von Dubletten basierend auf der Forward-Scatter-Area (FSC-A) und Forward-Scatter-Height (FSC-H) und schließlich das Ausgleiten von Trümmern durch Auswahl von Zellen nach ihren FSC-A- und Side-Scatter-Area (SSC-A) -Eigenschaften, hier als Größengatter bezeichne...

Diskussion

Die durchflusszytometrische Analyse von lymphatischem und nicht-lymphatischem Gewebe ermöglicht seit den 1980er Jahren die gleichzeitige Identifizierung und Zählung von B-Zell-Subpopulationen bei Mäusen und Menschen. Es wurde als Maß für die humorale Immunität verwendet und kann weiter angewendet werden, um die B-Zell-Funktionalität zu bewerten. Diese Methode nutzt die Verfügbarkeit von Reagenzien, um verschiedene Stadien der B-Zell-Reifung bei Mäusen und Menschen durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Paramet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument