שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיות כדי ללמוד את המנגנונים הפתומורפולוגיים והמולקולריים הבסיסיים חומוס –אינטראקציה בטיקולה Rhizoctonia. שיטת נייר הכתמים שימושית כדי ללמוד במהירות תגובות גנוטיפ חומוס, בעוד השיטה מבוססת סיר חולה יכול לשמש בו זמנית לכפות בצורת וזיהום R. bataticola ומסנן עבור גנוטיפים סובלניים.

Abstract

מחלת ריקבון שורש יבש (DRR) היא איום לחץ ביוטי המתעוררים על גידול חומוס ברחבי העולם. היא נגרמת על ידי פתוגן פטרייתי הנישא בקרקע, ריזוקוניה באטיקולה. בספרות, פרוטוקולים מקיפים ומפורטים שלב אחר שלב על מחלות הם דלים. מאמר זה מספק פרטים מלאים על השלבים המעורבים בהגדרת טכניקת נייר משתקת להקרנה מהירה של גנוטיפים להתנגדות ל-DRR. טכניקת הנייר הנוהקת קלה ופחות יקרה. שיטה נוספת, המבוססת על גישת החשיש החולה, היא חיקוי של זיהום טבעי וניתן ליישם אותה כדי ללמוד את הרכיבים המקיימים אינטראקציה – צמח, פתוגן וסביבה – המעורבים במשולש המחלה.

יתר על כן, בטבע, DRR מתרחשת בעיקר באזורי גידול חומוס ים, שם לחות הקרקע נסוגה ככל שצמיחת היבול מתקדמת. לחץ בצורת ידוע נטייה צמחי חומוס למחלת DRR. הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה בין צמחים לפתוגן תחת לחץ בצורת יכולה לסלול את הדרך לזיהוי זנים עמידים בפני DRR מבריכת החיידקים של גרגירי החומוס. מאמר זה מספק מתודולוגיה צעד קדימה להכנת סיר חולה ואסה מחלה לאחר מכן. בסך הכל, המידע המוצג בזאת יסייע לחוקרים להכין את האנוקולום פטרייתי R. bataticola, לשמור על פתוגן זה, להגדיר את טכניקת נייר הכתמים, להכין תרבות חולה וסיר חולה, ולהעריך זיהום פתוגן בצמחי חומוס.

Introduction

ריקבון שורש יבש (DRR) היא אחת המחלות המשמעותיות מבחינה כלכלית חומוס^1,2. זוהי מחלה ספציפית שורש הנגרמת על ידי רזוקטוניה bataticola (טלומורפ, Phaseomina). צמחים נגועים חסר שורשים לחוץ ויש להם טפירים שבירים ועלווה צהובה^1,3. DRR תחת לחץ בצורת דווח להיות איום המתעוררים על גידול^{חומוס 1,2,3}. יתר על כן, שכיחות DRR מדווח להיות מחמיר תחת לחץ בצורת בתנאי שדה^1,2,3. DRR נפוץ יותר באזורי גשם מאשר בשדות שוריים⁴. ניצול זנים עמידים היא הדרך להתגבר על המחלה ולעוקף את השימוש בקוטל פטריות^1,13. מכיוון שחיידקי חומוס הזמינים ברחבי העולם מטמינים וריאציה^{גנטית עבור התכונה 5}, ההקרנה והזיהוי של גנוטיפים עמידים/רגישים הם קריטיים לרבייה מולקולרית לשיפור היבול.

תבניות מחלה חזקות, קלות וחסכונית חיוניות כדי לחקור את דפוסי הזיהום של ר. באטיקולה בגוזל. המחלה העיקרית assay משמש כדי לצפות בתגובה של גנוטיפים חומוס לזיהום R. bataticola היא טכניקת נייר^{כתמים 1,4}. זוהי טכניקה פשוטה, ניתן לבצע באמצעות אינוקולום פטרייתי נוזלי, שתילים עם שורשים, ונייר כתם סטרילי. עם זאת, טכניקה זו לא נוצלה למקסימום שלה מכיוון שאין פרוטוקול שלב אחר שלב זמין בספרות.

בינתיים, טכניקת החשיש החולה כרוכה בהכנת תרבות חולה פוטנציאלית והטלת לחץ בצורת. בהתחשב בכך שלחץ בצורת מחמיר את^שכיחותמחלת DRR 3 , זה חיוני כדי ללמוד את האינטראקציה צמח-פתוגן תחת^{לחץ בצורת 6,7}. טכניקת סיר חולה מספקת את הפלטפורמה למחקר כזה בו זמנית, קידום אפשרויות טובות יותר עבור הקרנת חיידקים והבנת הבסיס המכני של האינטראקציה. ניתן לטפל בשינויים פתומורפיים כגון עלייה באורך השורש וצמצום מספר השורשים הניגבים – הטבועים במחלת DRR – באמצעות טכניקת^{סיר חולה 1,3,7}.

בזאת, פרוטוקול מפורט עבור נייר כתמים וטכניקות סיר חולה, אשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חומוס ו R. bataticola ו germplasm חומוס מסך, מוצג. פרטי החומרים המשמשים במחקר ניתנים בטבלת החומרים.

Protocol

1. בידוד ר. באטיקולה ואחסון

1. פרטים על הגנוטיפ של גרגירי החומוס ותסמיני DRR
   1. השתמש בצמחי חומוס (גנוטיפ, JG 62) כי בדרך כלל להראות סימפטומים DRR טיפוסי, כגון יבש, שורש ראשי שביר ללא שורשים לחוץ microsclerotia מתחת לקליפה ובתוך pith^1,3.
2. איסוף ושטיפה
   1. צמחי עקורים המציגים תסמינים כגון בוליאר בצבע קש יבש ושורש ראשי שביר עם מיקרוקלרוטיה מתחת לשכבת האפידרמיס. בעוד העקרוץ, חלק גדול של השורשים יישאר בתוך האדמה כמו השורשים הנגועים הם שבירים. הסר את פסולת האדמה גסה המחוברת לשורש. חותכים את השורשים בנפרד ואספים אותם במעטפות נייר (27.5 ס"מ על 12 ס"מ) עם התווית המתאימה והיכו אותם בתיבת איסוף לדוגמה.
   2. לאחר העברת דגימות למעבדה, מניחים את השורשים בשקית של 200 מ"ל ומכסים ברשת (רשת ניילון עם גודל נקבוביות בקוטר 3 מ"מ), ושטפו את השורשים ביסודיות עם מי ברז זורמים כדי להסיר חלקיקי קרקע דבקים.
   3. השתמשו במים הפוכים של אוסמוזה (RO) כדי לשטוף פעם אחת בסוף.
3. עיקור פני השטח
   1. לשבור את השורשים לארבע חתיכות עם 2 ס"מ אורך כל אחד עם להב אזמל ולשים אותם ב 200 מ"ל נקי במקום.
   2. להרכיב מי RO autoclaved, 2% NaOCl, צנצנת השלכה, ונייר כתמים autoclaved (5^{ס"מ 2)}בתוך תא זרימת למינאר.
   3. לשטוף את השורשים עם 50 מ"ל של מי RO autoclaved שלוש פעמים ולאחר מכן עם 50 מ"ל של 2% NaOCl במשך 10 דקות. לשטוף את השורשים עם 50 מ"ל של מים RO שלוש פעמים שוב כדי להסיר את NaOCl.
   4. כתם לייבש את השורשים על ידי הנחת השורשים על נייר כתמים autoclaved ולהשאיר עד השורשים מיובשים.
4. מדיה ותרירה
   1. הסר את קצות השורשים עם להב אזמל מחטא. לפצל את השורשים באמצעות הלהב ולהשתמש מפלצות מעוטא למקם אותם על תפוח אדמה דקסטרוז אגר (PDA) צלחת פטרי מדיה המכיל סטרפטומיצין סולפט (50 מ"ג L^-1) ואמפוצילין (50 מ"ג L^-1).
   2. סוגרים את הצלחת, אוטמים עם פרפילם, ותדגירה באינקובטור ב-28 מעלות צלזיוס למשך יומיים בחושך.
5. שיטת קצה מיף
   1. לאחר יומיים של דגירה, להביא את הצלחות לתוך תא זרימת למינאר. לחתוך את קצה הצמיחה hyphal⁸ תחת stereomicroscope (Leica EZ4 סטריאומיקרוסקופ חינוכי) ולהעביר אותו לתוך צלחת מחשב כף יד טרי עם סטרפטומיצין סולפט ואאמפצילין.
   2. דגירה את הצלחות באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך עשרה ימים בחושך.
6. אחסון ותחזוקה של לאוקולום פטרייתי של ר. באטיקולה
   1. הפוך את מחשב כף יד במבחנות ולהעביר תקע אגר פטרייתי מצלחת תרבות בת עשרה ימים באמצעות לולאת חיסון עיקור להבה. אטמו את מכסה הבדיקה עם פרפילם.
   2. דגירה את המשקעים ב 28 ° C במשך עשרה ימים בחושך.
   3. אטמו שוב את המכסה עם פרפילם ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס במקרר לשימוש עתידי.
   4. תת-תרבות כל שישה חודשים כדי לשמור על הפטרייה.
7. תחזוקת הוויראליות
   1. להדביק את הצמחים עם inoculum פטרייתי טהור הוכן כאמור בטכניקה סיר חולה^3. בודדו את אותה פטריה מהצמחים הנגועים (הקוך מפרסם)⁹ והשתמשו בהם לניסויים נוספים.
      הערה: במחקר זה, זן מבודד שדה של הפטריה שימש (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. טכניקת נייר כתמים

הערה: טכניקת נייר הכתמים כרוכה בהכנת inoculum פטרייתי נוזלי, הכנת שתילים, והערכת מחלות.

1. הכנת נוזל R. באטיקולה
   הערה: אינוקולום פטרייתי נוזלי R. bataticola מכיל הן mycelia ו microsclerotia. שני המבנים האלה פועלים כאונוקולום ראשי.
   1. הכן 500 מ"ל של מדיה PDB בקבוקון 1,000 מ"ל autoclave אותו ב 121 ק ג במשך 15 דקות.
   2. לאחר שהתקשורת מתקררת, לחסן את המרק עם לולאה של תקע אגר פטרייתי מתרבות שיפוע פטרייתי דגירה ב 28 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים בשייקר ב 180 סל"ד בחושך.
   3. להרכיב זכוכית autoclaved או משפך פלסטיק (10 ס"מ), בקבוקון חרסי ליטר אחד, ושתי שכבות של רשת (10^{ס"מ 2} גודל) (ניילון רשת עם גודל הנקבוביות של 3 מ"מ קוטר) על השולחן. לסנן את המיליה פטרייתית ומיקרוקלרוטיה באמצעות הרשת. כתם לייבש את הפטרייה בנייר כתמים autoclaved.
   4. לשקול 100 גרם mycelia עבור 50% אינקולום ולשמור על טמפרטורת החדר.
2. הכנת צמח חומוס
   1. בחר 50 זרעים בריאים (במחקר זה, הגנוטיפ JG 62 רגיש DRR היה בשימוש), למקם אותם ב100 מ"ל בפיק, ולכסות עם רשת.
   2. לשטוף את הזרעים עם מי ברז הראשון כדי להסיר פסולת אדמה.
   3. קח את הבקת עם זרעים לתוך תא זרימת למינאר ולשטוף אותם עם 50 מ"ל עיקור של מים RO שלוש פעמים במשך 1 דקות לכל שטיפה.
   4. לחטא את הזרעים עם 50 מ"ל של 2% NaOCl מים במשך 2 דקות עם רעד מתמשך לשטוף את הזרעים עם 50 מ"ל של מים מחטאים חמש פעמים עבור 1 דקות כל אחד.
   5. מלאו שקית פוליאתילן (47.5 ס"מ על 25 ס"מ) ב-Soilrite (תערובת של גננות מדורגות מורחבות פרלייט, אזוב כבול אירי, ורמיקוליטיס פילינג ביחס שווה כלומר, 1/3:1/3:1/3), לזרוע את פני השטח מעוטר 50 זרעים שני ס"מ עמוק, ולשמור בתא צמיחה / חדר עם 28 °C ± 2 ° C טמפרטורה, 16 שעות photoperiod בעוצמה קלה של 150 μmol^-2 s^-1, ולחות יחסית של 70%. להשקות אותם עם מי RO ולערוק את הצמחים שמונה ימים לאחר הזורע.
   6. לשטוף את השורשים במים ברז כדי להסיר את חלקיקי Soilrite. לשטוף את השורשים עם מי RO מחטאים, ולשמור אותם במים RO ב1000 מ"ל במקום.
3. הכנת נייר כתמים במגשים
   1. קח נייר כתמים וחתוך אותם לחתיכות (30 ס"מ × 23 ס"מ) במספרים מספיקים כדי לעמוד בשכפולים.
   2. אורזים את הסדינים בשקית פוליאתילן הניתנת לעבודה אוטומטית ומקלעים אותם ב-50 ק"ג למשך 15 דקות ולשמור אותם בתנור אוויר חם לייבוש.
   3. מקפלים כל גיליון נייר מנפח לשניים.
   4. מניחים את הנייר על מגש פלסטיק נקי ומרוח, כפי המוצג באות 2i-iv.
4. חסון צמחים על ידי טבילה
   1. להמיס 100 גרם של inoculum פטרייתי ב 200 מ"ל autoclaved RO מים ב 200 מ"ל בספל כדי להשיג 50% אינקולום.
   2. טובלים את שורשי הצמח באינוקולום המוכן למשך דקה אחת עם תנועה לסירוגין למעלה למטה כדי להבטיח חיבור אחיד של אינוקולום פטרייתי.
5. הנחת הצמחים בנייר הכתמים
   1. הרטיבו את הצד התחתון של נייר הכתמים המוצבים על המגש עם מי RO סטריליים. מניחים את הצמחים על הנייר באופן שבו רק השורשים מכוסים על ידי הנייר, ויורה נשאר בחוץ.
   2. סגור אותו על ידי קיפול הצד העליון של נייר הכתמים ולהרטיב את הנייר כולו כדי לספק מספיק מים כדי לקיים את צמיחת הצמח.
   3. להשקות את המגש פעם ביום ולשמור את המגשים ב 28 מעלות צלזיוס. שים לב לתסמינים כגון נמק, ריקבון שורש, ועלה צהבהב מדי יום.

3. טכניקת סיר חולה

הערה: טכניקת סיר חולה כרוכה בהכנת inoculum ארסי סיר חולה, תחזוקה של רמת לחות, והערכה של תסמיני המחלה.

1. הכנת תכשיר
   1. קח ק"ג אחד מכל זרעי חומוס זמינים מבחינה מסחרית. הסר זרעים נגועים (זרעים עם צמיחה פטרייתית, כתמי זיהום, ונזק חרקים). מניחים אותם בשקית פלסטיק של 5 L ושטפו עם מי ברז ביסודיות 3-4 פעמים כדי להסיר פסולת גדולה.
   2. לשטוף את הזרעים עם 2 L של מים RO שלוש פעמים ולהשרות את הזרעים 1 ק"ג ב 5 L ב 11 עם שלוש יותר מים במשך חמש שעות.
   3. ברגע שהזרעים זלעו את המים, רחו אותם מחדש במי RO שלוש פעמים כדי להסיר את הזרע מפריך.
   4. מסירים את המים לחלוטין וארזים את הזרעים בבקבוקי ריבה (300 מ"ל, גובה 12 ס"מ, קוטר 6 ס"מ ו-155 גרם משקל) לקיבולת של חצי ליטר (100 גרם לבקבוק^ריבה) וסוגרים את הבקבוקים עם פקקים. ארוז עשרה בקבוקי ריבה בשקית פלסטיק הניתנת לשיעבוד אוטומטי (48 ס"מ על 30 ס"מ) אוטוקלב פעמיים ב-121 ק"ג למשך 15 דקות ברציפות.
   5. מייבשים את הזרעים ב-40 מעלות צלזיוס בתנור למשך הלילה כדי להסיר את טיפות המים בתוך הבקבוק.
2. הכנת תרבות חולה
   1. הפעל את תא זרימת ה למינאר ברמה BSL-2. מנגבים את הרצפה ביסודיות עם 70% אתנול, ומפעילים UV למשך 15 דקות. לאחר מכן, לשמור את הזרעים בתוך תא זרימת למינאר.
   2. קחו את תרבות ר. באטיקולה בת 10 ימים מבודדת (חלק 1). לאחר מכן, יש לקחת שלושה תקעי אגר פטרייתיים (קוטר 4 מ"מ) באמצעות קצה פיפטה סטרילי או בור שעם, ולשים אותם בבקבוקי ריבה באופן באותה פריסה. מכסים את הבקבוקים בפקקים וחותמים בפילם.
   3. לנער את הבקבוקים כדי לערבב את הדיסק פטרייתי עם זרעי חומוס באופן אחיד.
   4. דגירה את הבקבוקים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים בחושך.
   5. קח בקבוקי ריבה עם צמיחה פטריית שחורה (איור 4iii) ולהעביר את התרבות החולה (זרעים עם microsclerotia) מבקבוקי ריבה לצלחת פטרי זכוכית באמצעות מלקות סטריליות. לייבש אותם בטמפרטורת החדר במשך יומיים בצלחת פטרי זכוכית.
   6. אבקת מסה פטרייתית באמצעות מרגמה ועלי, ולאחסן את האבקה ב 4 מעלות צלזיוס.
   7. Autoclave Soilrite פעמיים ב 121 ק"ג במשך 15 דקות.
   8. ייבשו את תערובת האדמה המשובכת תחת שמש.
   9. מערבבים את האבקה הפטריתית עם Soilrite ב-50% w/w, ממלאים את הסירים בתערובת, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר למשך יום.
   10. לזרוע זרעי חומוס רגישים ל-DRR לכל סיר (10 ס"מסיריםעגולים) ולשמור על רמת לחות של 80% קיבולת שדה (FC).
   11. צפה בסימפטומים כגון נמק ודהיב שורש על ידי עקרו את הצמחים לאחר נביטה.
3. הערכת יעילות סיר חולה
   הערה: צמחים מראים תסמיני פליאר צהוב כאשר השורשים רקובים לחלוטין.
   1. לפתח ציון מחלה המבוסס על הנגע (נקודות נמק) (דמות משלימה 2C) מספרים וחומרת ריקבון שורש. סירים חולים מראה 90% מוות צמח יכול לשמש עוד יותר.
4. הקרנת גנוטיפ
   1. הכינו את התרבות החולה בכמויות גדולות ומערבבו אותה עם Soilrite מעוטר או אדמת שדה (5% w/w) בסירים בגובה 30 ס"מ. להשקות את הסירים כדי להרטיב את פני השטח ולהשאיר אותם ללא הפרעה במשך שבעה ימים.
   2. לזרוע זרע אחד מעוטר פני השטח לכל סיר עגול 10 ס"מ ושלושה זרעים לכל סירים עגולים 30 ס"מ להשקות אותם כראוי.
   3. שימו לב לתסמיני הפוליאר הצהובים והריקבון של השורש.
5. בצורת משולבת וזיהום ר. באטיקולה
   1. לכפות לחץ בצורת על ידי ביצוע הפרוטוקולים המוזכרים בSineha ואח '. (2019).

תוצאות

מחקר זה נועד להפגין טכניקות כגון נייר כתמים וטכניקות סיר חולה כדי להקל על הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה צמח-פתוגן תחת לחץ בצורת. כדי להשיג זאת, צמחים המציגים תסמיני DRR^1,3,4 נאספו^מתוך שדה חומוס, והפטרייה הייתה מבודדת באמצעות ש?...

Discussion

טכניקת הנייר הנוהקת מספקת גישה פשוטה לגנוטיפים של חומוס על המסך בתנאי מעבדה. מחיסון מטבל מאפשר חקירה של אינטראקציה על בסיס זמני עם שליטה קלה על עומס inoculum (דמות משלימה 1) ומאפשר בהקרנה חוץית. יתר על כן, אפילו שתילים צעירים יכולים לשמש. תרבות פטרייתית בת חמישה ימים(איור 1B)

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901