Ensaios da doença de podridão de raízes secas no grão-de-bico: uma metodologia detalhada

Resumo

Este estudo apresenta metodologias para estudar os mecanismos pathomorfológicos e moleculares subjacentes à interação grão-de-bico-Rhizoctonia bataticola. O método de papel manchador é útil para estudar rapidamente as respostas do genótipo do grão-de-bico, enquanto o método adoecido à base de maconha pode ser usado para impor simultaneamente a seca e a infecção por R. bataticola e a tela para genótipos tolerantes.

Resumo

A doença da podridão de raízes secas (DRR) é uma ameaça emergente de estresse biótico ao cultivo de grão-de-bico em todo o mundo. É causada por um patógeno fúngico transportado pelo solo, Rhizoctonia bataticola. Na literatura, protocolos passo a passo abrangentes e detalhados sobre ensaios sobre doenças são escassos. Este artigo fornece detalhes completos sobre as etapas envolvidas na criação de uma técnica de papel manchador para triagem rápida de genótipos para resistência ao DRR. A técnica de papel manchador é fácil e menos cara. Outro método, baseado na abordagem do vaso doente, é uma imitação de infecção natural e pode ser aplicado para estudar os componentes que interagem — planta, patógeno e ambiente — envolvidos no triângulo da doença.

Além disso, na natureza, a DRR ocorre principalmente em áreas de cultivo de grão-de-bico-de-bico-de-chuva, onde a umidade do solo recua à medida que o crescimento das culturas avança. O estresse da seca é conhecido por predispor plantas de grão-de-bico à doença drr. A compreensão patomorfológica e molecular da interação planta-patógeno sob o estresse da seca pode abrir caminho para a identificação de variedades resistentes à DRR de elite da piscina de germoplasma de grão-de-bico. Este artigo fornece uma metodologia stepwise para a preparação de um pote doente e ensaio subsequente da doença. No geral, as informações aqui apresentadas ajudarão os pesquisadores a preparar o inóculo fúngico R. bataticola, manter esse patógeno, configurar a técnica de papel manchador, preparar a cultura doente e o pote doente e avaliar a infecção por patógenos em plantas de grão-de-bico.

Introdução

A podridão de raízes secas (DRR) é uma das doenças economicamente significativas no grão-de-bico^1,2. É uma doença específica da raiz causada pela Rizoctonia bataticola (teleomorfo, macrofomina phaseolina). As plantas infectadas não possuem raízes laterais e possuem raízes de torneiras frágeis e folhagens amarelas^1,3. DrR sob estresse de seca tem sido relatado como uma ameaça emergente ao cultivo de grão-de-bico^1,2,3. Além disso, a incidência de DRR é relatada como agravada sob o estresse da seca sob as condições de campo^1,2,3. DrR é mais prevalente em áreas de chuva do que em campos irrigados⁴. A utilização de variedades resistentes é a forma de superar a doença e contornar o uso de fungicidas^1,13. Como o germoplasma do grão-de-bico disponível em todo o mundo abriga variação genética para o traço^5,a triagem e identificação de genótipos resistentes/suscetíveis são fundamentais para a reprodução molecular para melhoria da cultura.

Ensaios robustos, fáceis e econômicos para doenças são essenciais para investigar padrões de infecção por R. bataticola no grão-de-bico. O ensaio da doença primária utilizado para observar a resposta dos genótipos de grão-de-bico à infecção por R. bataticola é a técnica de papel manchador^1,4. É uma técnica simples e pode ser executada usando inóculo fúngico líquido, mudas com raízes e papel estéril. No entanto, essa técnica não foi utilizada ao máximo porque não há protocolo passo a passo disponível na literatura.

Enquanto isso, a técnica de maconha doente envolve a preparação de uma cultura doentia potencial e a imposição do estresse da seca. Dado que o estresse da seca agrava a incidência da doença^{de DRR 3,}é essencial estudar a interação planta-patógeno sob o estresse da seca^6,7. A técnica de vaso doente fornece a plataforma para um estudo tão simultâneo, promovendo melhores possibilidades de triagem de germoplasma e compreensão da base mecanicista da interação. Alterações pathomorfológicas, como aumento do comprimento da raiz e redução do número de raízes laterais — inerentes à doença drr — podem ser tratadas usando a técnica de vaso doente^1,3,7.

Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para o papel manchador e técnicas de maconha doente, que podem ser utilizados para estudar a interação entre grão-de-bico e R. bataticola e germoplasma de grão-de-bico de tela. Os detalhes dos materiais utilizados no estudo são dados na Tabela de Materiais.

Protocolo

1. Isolamento de R. bataticola e armazenamento

1. Detalhes dos sintomas do genótipo do grão-de-bico e drr
   1. Use plantas de grão-de-bico (genótipo, JG 62) que geralmente apresentam sintomas típicos de DRR, como raiz primária seca e frágil, sem raízes laterais e microclerocia sob a casca e dentro do pith^1,3.
2. Coleta e lavagem
   1. Plantas de arrancada que apresentam sintomas como foliar cor de palha seca e raiz primária frágil com microclerotia sob a camada de epiderme. Enquanto se desenraiza, grande parte das raízes permanecerá dentro do solo, pois as raízes infectadas são frágeis. Remova os detritos grosseiros do solo presos à raiz. Corte as raízes separadamente e colete-as em envelopes de papel (27,5 cm x 12 cm) com o rótulo adequado e coloque-as em uma caixa de coleta de amostras.
   2. Depois de transportar amostras para o laboratório, coloque as raízes em um béquer de 200 mL e cubra com malha (malha de nylon com o tamanho dos poros de 3 mm de diâmetro), e lave as raízes completamente com água da torneira corrente para remover partículas de solo aderindo.
   3. Use água de osmose reversa (RO) para enxaguar uma vez no final.
3. Esterilização de superfície
   1. Quebre as raízes em quatro pedaços com 2 cm de comprimento cada com uma lâmina de bisturi e coloque-as em um béquer limpo de 200 mL.
   2. Montar água RO autoclavada, 2% NaOCl, jarra de descarte e papel de mancha autoclaved (5 cm²) dentro da câmara de fluxo laminar.
   3. Lave as raízes com 50 mL de água RO autoclavada três vezes e depois com 50 mL de 2% de NaOCl por 10 min. Lave as raízes com 50 mL de água RO três vezes novamente para remover o NaOCl.
   4. Enxugar as raízes colocando as raízes em papel de mancha autoclaved e deixar até que as raízes estejam secas.
4. Mídia e incubação
   1. Remova as bordas das raízes com uma lâmina de bisturi esterilizada. Divida as raízes usando a lâmina e use as fórceps esterilizadas para colocá-las em uma placa de petri de dextrose de batata (PDA) contendo sulfato de estreptomicina (50 mg L^-1) e ampicillina (50 mg L^-1).
   2. Feche a placa, lacre com parafilme e incuba em uma incubadora a 28 °C por dois dias no escuro.
5. Método de ponta hiphal
   1. Após dois dias de incubação, leve as placas para a câmara de fluxo laminar. Corte a ponta do crescimento hifál⁸ sob um estereóquio (Estereóquio educacional Leica EZ4) e transfira-a para uma placa PDA fresca com sulfato de estreptomicina e ampicillina.
   2. Incubar as placas na incubadora a 28 °C durante dez dias no escuro.
6. Armazenamento e manutenção do inóculo fúngico R. bataticola
   1. Faça inclinações PDA em tubos de ensaio e transfira um plugue de ágar fúngico de uma placa de cultura de dez dias de idade usando o laço de inoculação esterilizado pela chama. Sele a tampa do tubo de ensaio com parafilme.
   2. Incubar as inclinações a 28 °C por dez dias no escuro.
   3. Sele novamente a tampa com parafilm e armazene-a a 4 °C na geladeira para o uso futuro.
   4. Subcultura a cada seis meses para manter o fungo.
7. Manutenção da virulência
   1. Infecte as plantas com inóculo fúngico puro preparado como mencionado na técnica de vaso doente³. Isole o mesmo fungo das plantas infectadas (postulados de Koch)⁹ e use para outros experimentos.
      NOTA: Neste estudo, foi utilizada uma cepa isolada de campo do fungo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Técnica de papel de mancha

NOTA: A técnica de papel de mancha envolve a preparação do inóculo fúngico líquido, preparação de mudas e avaliação da doença.

1. Preparação do líquido R. bataticola inóculo
   NOTA: O inóculo fúngico líquido R. bataticola contém múcia e microclerotia. Ambas as estruturas agem como inóculo primário.
   1. Prepare 500 mL de mídia PDB em um frasco de 1.000 mL e autoclave-o a 121 lbs por 15 min.
   2. Depois que a mídia é resfriada, inocular o caldo com um loopful de plugue de ágar fúngico de uma cultura fúngica inclinada e incubar a 28 °C por cinco dias em um shaker a 180 rpm no escuro.
   3. Monte um vidro autoclavado ou funil plástico (10 cm), frasco cônico de um litro e duas camadas de malha (tamanho 10 cm²⁾ (malha de nylon com o tamanho dos poros de 3 mm de diâmetro) na mesa. Filtrar a micélia fúngica e a microclerotia usando a malha. Borrifa o fungo em papel de mancha autoclaved.
   4. Pesar 100 g de micéria por 50% de inóculo e manter a temperatura ambiente.
2. Preparação de planta de grão-de-bico
   1. Selecione 50 sementes saudáveis (neste estudo, foi utilizado o genótipo DRR-suscetível JG 62), coloque-as em um béquer de 100 mL e cubra com uma malha.
   2. Lave as sementes com água da torneira primeiro para remover detritos do solo.
   3. Leve o béquer com sementes para a câmara de fluxo laminar e lave-as com 50 mL de água de RO esterilizadas três vezes por 1 min por lavagem.
   4. Esterilize as sementes com 50 mL de NaOCl 2% aquoso por 2 min com agitação contínua e lave as sementes com 50 mL de água esterilizada cinco vezes por 1 min cada.
   5. Encha um saco de polietileno (47,5 cm x 25 cm) com Soilrite (uma mistura de perlite expandida de grau de horticultura, musgo de turfa irlandesa e vermiculite esfoliada em proporção igual, ou seja, 1/3:1/3:1/3), semear as 50 sementes esterilizadas pela superfície com dois cm de profundidade, e manter em uma câmara/sala de crescimento com 28 °C ± temperatura de 2 °C, fotoperíodo de 16 h com uma intensidade leve de 150 μmol m⁻² s⁻¹, e umidade relativa de 70%. Regar com água de RO e arrancar as plantas oito dias após a semeadura.
   6. Lave as raízes na água da torneira para remover as partículas de Solorita. Enxágüe as raízes com água ro esterilizada e mantenha-as na água RO em um béquer de 1000 mL.
3. Preparação de papel manchado em bandejas
   1. Pegue um papel manchador e corte-os em pedaços (30 cm × 23 cm) em números suficientes para atender às réplicas.
   2. Embale as folhas em saco de polietileno autoclavável e autoclave-as a 121 libras por 15 minutos e mantenha-as em um forno de ar quente para secar.
   3. Dobre cada folha de papel ao meio.
   4. Coloque o papel em uma bandeja de plástico limpa e limpa, como mostrado na Figura 2i-iv.
4. Inoculação vegetal mergulhando
   1. Dissolva 100 g de inóculo fúngico em 200 mL de água RO autoclaved em um béquer de 200 mL para obter 50% de inóculo.
   2. Mergulhe as raízes da planta no inóculo preparado por 1 min com movimento intermitente para cima e para baixo para garantir a fixação uniforme do inóculo fúngico.
5. Colocando as plantas no papel de mancha
   1. Molhe o lado inferior do papel de mancha colocado na bandeja com água RO estéril. Coloque as plantas no papel de uma forma onde apenas as raízes são cobertas pelo papel, e os brotos são deixados de fora.
   2. Feche-o dobrando o lado superior do papel manchador e molhe todo o papel para fornecer água suficiente para sustentar o crescimento da planta.
   3. Rega a bandeja uma vez por dia e mantenha as bandejas a 28 °C. Observe os sintomas como necrose, podridão radicular e amarelamento de folhas diariamente.

3. Técnica de maconha doente

NOTA: A técnica do vaso doente implica a preparação de inóculo virulento e um vaso doente, manutenção do nível de umidade e avaliação dos sintomas da doença.

1. Preparação do substrato
   1. Pegue um kg de qualquer semente de grão-de-bico disponível comercialmente. Remova as sementes infectadas (sementes com crescimento fúngico, manchas de infecção e danos causados por insetos). Coloque-os em 5 L de béquer plástico e lave com água da torneira completamente 3-4 vezes para remover detritos principais.
   2. Lave as sementes com 2 L de água de RO três vezes e mergulhe as sementes de 1 kg em um béquer de 5 L com três vezes mais água por cinco h.
   3. Uma vez que as sementes absorvessem a água, recue-as com água RO três vezes para remover as exsudatas de sementes.
   4. Retire a água completamente e embale as sementes em garrafas de geleia (300 mL, 12 cm de altura, 6 cm de diâmetro e 155 g de peso) até cerca de 1/4^de capacidade (100 g por garrafa de geleia) e feche as garrafas com tampas. Embalar dez garrafas de geleia em um saco plástico autoclavável (48 cm x 30 cm) autoclave duas vezes a 121 lbs por 15 min continuamente.
   5. Seque as sementes a 40 °C em um forno durante a noite para remover as gotículas de água dentro da garrafa.
2. Preparação da cultura doentia
   1. Ligue a câmara de fluxo laminar de nível BSL-2. Limpe bem o chão com 70% de etanol e ligue o UV por 15 min. Então, mantenha as sementes dentro da câmara de fluxo laminar.
   2. Tome a cultura R. bataticola recém-isolada de 10 dias (parte 1). Em seguida, pegue três tampões de ágar fúngicos (4 mm de diâmetro) usando uma ponta de pipeta estéril ou borer de cortiça, e coloque-os em garrafas de geleia asepticamente. Cubra as garrafas com tampas e selo com parafilme.
   3. Agite as garrafas para misturar o disco fúngico com as sementes de grão-de-bico uniformemente.
   4. Incubar as garrafas a 30 °C durante 15 dias no escuro.
   5. Pegue garrafas de geleia com crescimento fúngico preto(Figura 4iii) e transfira a cultura doentia (sementes com microclerotia) de garrafas de geleia para uma placa de vidro de Petri usando fórceps estéreis. Seque-os à temperatura ambiente por dois dias em uma placa de vidro Petri.
   6. Em pó a massa fúngica usando uma argamassa e pilão, e armazene o pó a 4 °C.
   7. Autoclave Soilrite duas vezes a 121 lbs por 15 min.
   8. Seque a mistura de soilrita autoclavada sob um protetor solar.
   9. Misture o pó fúngico com o Solorite a 50% c/w, encha as panelas com a mistura e mantenha-as em temperatura ambiente por um dia.
   10. Semear uma semente de grão-de-bico resistente à droga por pote (potes redondos de 10 cm)(Tabela de Materiais) e manter um nível de umidade de 80% da capacidade de campo (FC).
   11. Observe os sintomas como necrose e podridão radicular arrancando as plantas após a germinação.
3. Avaliação da eficiência do pote doente
   NOTA: As plantas apresentam sintomas foliar amarelos quando as raízes estão completamente podres.
   1. Desenvolver um escore da doença com base nos números da lesão (manchas necróticas) (Figura Suplementar 2C) e gravidade da podridão radicular. Vasos doentes que mostram 90% da morte vegetal podem ser usados ainda mais.
4. Triagem de genótipo
   1. Prepare a cultura doentia em grandes quantidades e misture-a com solo esterilizado ou solo de campo (5% w/w) em potes de 30 cm de altura. Rega os potes para molhar a superfície e deixá-los imperturbáveis por sete dias.
   2. Poreie uma semente esterilizada pela superfície por pote redondo de 10 cm e três sementes por potes redondos de 30 cm e rega-as adequadamente.
   3. Observe os sintomas de foliar amarelo e apodrecimento da raiz.
5. Seca combinada e infecção por R. bataticola
   1. Impor o estresse da seca seguindo os protocolos mencionados na Sinha et al. (2019).

Resultados

Este estudo teve como objetivo demonstrar técnicas como papel manchador e técnicas de vasos doentes para facilitar a compreensão patomorfológica e molecular da interação planta-patógeno sob estresse de seca. Para isso, as plantas que apresentaram sintomas drr^1,3,4 foram coletadas de um campo de grão-de-bico, e o fungo foi isolado utilizando o método de ponta hiphal⁸. A cultura fúngica R. bat...

Discussão

A técnica de papel manchador fornece uma abordagem simples para tela genótipos de grão-de-bico em condições laboratoriais. A inoculação de mergulho permite a investigação da interação em uma base temporal com fácil controle sobre a carga inóculo(Figura Suplementar 1) e facilita a triagem in vitro. Além disso, até mesmo mudas jovens podem ser usadas. A cultura fúngica de cinco dias de idade(Figura 1B) pode produzir inóculo suficiente para infectar as plantas....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901