ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論

要約

本研究では、ひよこ豆-根支バタチコラ 相互作用の根底にある病態分子メカニズムを研究する方法論を提示する。ブロッティングペーパー法は、ひよこ豆遺伝子型応答を迅速に研究するのに有用であり、病気のポットベースの方法は、同時に干ばつと R.バタチコラ 感染を課し、寛容な遺伝子型のスクリーニングに使用することができます。

要約

乾燥した根腐れ(DRR)病は、世界中のひよこ豆栽培に対する新たな生物ストレスの脅威です。これは、土壌媒介性真菌病原体、 根支バタチコラによって引き起こされます。文献では、疾患アッセイに関する包括的かつ詳細なステップバイステップのプロトコルはまばらである。この記事では、DRRに対する耐性の遺伝子型をすばやくスクリーニングするためのブロッティングペーパー技術の設定に関する手順の詳細を提供します。ブロッティング紙の技術は簡単で安価です。病気のポットアプローチに基づくもう 1 つの方法は、自然感染の模倣であり、疾患の三角形に関与する相互作用コンポーネント(植物、病原体、および環境)を研究するために適用することができます。

さらに、自然界では、DRRは主に雨が降ったひよこ豆栽培地域で発生し、作物の成長が進むにつれて土壌水分が後退します。干ばつストレスは、DRR病にひよこ豆植物を素因とすることが知られています。干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態および分子的理解は、ひよこ豆の生殖器プールからのエリートDRR耐性品種の同定のための道を開くことができる。本稿では、病的なポットの調製とその後の疾患アッセイのための段階的な方法論を提供する。全体として、本明細書に提示された情報は、研究者が R.バタチコラ 真菌接種を準備し、この病原体を維持し、ブロッティングペーパー技術を設定し、病気の培養および病気のポットを準備し、ひよこ豆植物における病原体感染を評価するのに役立ちます。

概要

乾燥した根腐れ(DRR)は、ひよこ豆^1、2の経済的に重要な疾患の一つである。これは、根性バタチコーラ(テレオモーフ、マクロフォミナフェイショウチリーナ)によって引き起こされる根特異的疾患である。感染した植物は横根を欠き、脆いタップルートと黄色の葉^1、3を所有しています。干ばつストレス下のDRRは、ひよこ豆栽培^1、2、3に対する新たな脅威であると報告されている。さらに、DRRの発生率は、フィールド条件^1、2、3の下で干ばつストレス下で悪化すると報告されている。DRRは、灌漑されたフィールド⁴よりも雨の多い地域で一般的です。耐性品種の利用は、病気を克服し、殺菌剤の使用を回避する方法です^1,13.世界中で利用可能なひよこ豆の生殖器は、形質⁵の遺伝的変異を抱えているため、作物改善のための分子繁殖には耐性/感受性遺伝子型のスクリーニングおよび同定が重要である。

ひよこ豆のR.バタチコラ感染パターンを調査するには、堅牢で簡単で費用対効果の高い疾患アッセイが不可欠です。R.バタチコラ感染症に対するひよこ豆遺伝子型の応答を観察するために使用される主要な疾患アッセイは、ブロッティングペーパー技術^1,4である。それは簡単な技術であり、液体真菌の接種、根を持つ苗、および無菌ブロッティング紙を使用して実行することができる。しかし、この技術は、文献で利用できるステップバイステッププロトコルがないため、最大限に活用されていません。

一方、シックポット技術は、潜在的な病気の文化の準備と干ばつストレスの賦課を含みます。干ばつストレスがDRR病の発生率^を悪化させることを考えると、干ばつストレス^6、7の下で植物病原体の相互作用を研究することが不可欠である。シックポット技術は、このような同時研究のためのプラットフォームを提供し、胚芽スクリーニングのためのより良い可能性を促進し、相互作用の機械主義的基礎を理解する。DRR病に固有の根長の増加や横根数の減少などの病態変化は、シックポット手法^1、3、7を使用して対処することができる。

本明細書において、ひよこ豆と R.バタチコラ とスクリーンひよこ豆の細菌との相互作用を研究するために使用することができる紙およびシックポット技術をブロッティングするための詳細なプロトコルが提示される。研究で使用される材料の詳細は、材料表に示されています。

プロトコル

1. R. バタチコラ とストレージの分離

1. ひよこ豆遺伝子型とDRR症状の詳細
   1. 一般的に典型的なDRR症状を示すひよこ豆植物(遺伝子型、JG62)を用いて、樹皮の下およびピス^1、3の下に横根と微小動脈を持たない乾燥した脆い原根のような一般的なDRR症状を示す。
2. 収集と洗浄
   1. 乾燥したわら色の葉膜や表皮層の下に微小動脈を持つ脆い原根などの症状を示す根根植物。根こそぎにしている間、感染した根が脆くなるにつれて、根の大部分は土壌の中に残ります。根に付けられた粗い土の破片を取り除きます。根を別々に切り取り、適切なラベルを貼った紙の封筒(27.5 cm x 12 cm)に集め、サンプルの採取ボックスに入れます。
   2. サンプルを実験室に運んだ後、根を200 mLビーカーに入れ、メッシュ(直径3mmの細孔サイズのナイロンメッシュ)で覆い、根を水道水で十分に洗い流して土壌粒子を除去します。
   3. 逆浸透(RO)水を使用して、最後に一度すすきます。
3. 表面滅菌
   1. 根を2cmの長さの4つに分割し、メスの刃を持ち、清潔な200 mLビーカーに入れます。
   2. オートクレーブRO水、2%NaOCl、廃棄瓶、およびオートクレーブブロッティングペーパー(5cm²⁾を層流チャンバー内に組み立てます。
   3. 50 mLのオートクレーブRO水で根を洗い、その後50 mLの2%NaOClで10分間洗浄します。50mLのRO水で根を3回洗い、NaOClを取り除きます。
   4. ブロットは、オートクレーブブロッティング紙の上に根を置くことによって根を乾燥させ、根が乾燥するまで放置します。
4. メディアとインキュベーション
   1. 滅菌メスの刃で根の端を取り除きます。ブレードを使用して根を分割し、滅菌された鉗子を使用して、ストレプトマイシン硫酸塩(50mg^L-1)およびアンピシリン(50mg^L-1)を含むペトリプレートをポテトデキストロース寒天(PDA)培地に置く。
   2. プレートを閉じ、パラフィルムで密封し、暗闇の中で28°Cのインキュベーターで2日間インキュベートします。
5. ヒファール先端法
   1. 2日間のインキュベーションの後、プレートを層流チャンバーに持ち込みます。ヒファル成長⁸ の先端を実体顕微鏡(ライカEZ4教育用実体顕微鏡)で切り、スルフェートとアンピシリンを含む新鮮なPDAプレートに移します。
   2. 28°Cのインキュベーターで、暗闇の中で10日間インキュベーターにプレートをインキュベートします。
6. R.バタチコラ菌接種の保管とメンテナンス
   1. 試験管でPDAスラントを作り、炎殺菌接種ループを使用して10日前の培養プレートから真菌寒天プラグを移します。パラフィルムで試験管キャップを密封します。
   2. 暗闇の中で10日間、28°Cでスラントをインキュベートします。
   3. キャップをパラフィルムでシールし、4°Cで冷蔵庫に保管して、今後の使用に備えます。
   4. 真菌を維持するために6ヶ月ごとにサブカルチャー。
7. 毒性の維持
   1. 病気のポット技術³で述べたように調製純粋な真菌接種で植物に感染する。感染した植物(コッホの後述⁾⁹ から同じ真菌を分離し、さらなる実験に使用する。
      注:本研究では、真菌の単離株を用いた(GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. ブロッティング紙の技術

注:ブロッティングペーパー技術は、液体真菌接種、苗の調製、および疾患評価の調製を伴う。

1. 液体 R.バタチコラ 接種の調製
   注:液体 R.バタチコラ 真菌接種は、ミセリアとミクロクレローティアの両方が含まれています。これらの構造は両方とも一次接種として機能する。
   1. 1,000 mL フラスコに500 mLのPDB培地を用意し、121ポンドでオートクレーブして15分間準備します。
   2. メディアが冷却された後、真菌の斜めの培養から真菌類寒天プラグのループでスープを接種し、暗闇の中で180 rpmのシェーカーで28°Cで5日間インキュベートします。
   3. オートクレーブガラスまたはプラスチック漏斗(10cm)、1リットルの円錐形フラスコ、および2層のメッシュ(10 cm² サイズ)(直径3mmの細孔サイズのナイロンメッシュ)をテーブルに組み立てます。メッシュを使用して真菌菌叢とミクロクレローティアを除外します。ブロットは、オートクレーブブロッティングペーパーで真菌を乾燥させます。
   4. 50%の接種のための100グラムの菌体の重量を量り、室温で保ちます。
2. ひよこ豆植物の準備
   1. 50種の健康な種子(本研究では、DRR感受性遺伝子型JG 62を使用)、100 mLビーカーに入れ、メッシュで覆います。
   2. まず水道水で種を洗い、土壌の破片を取り除きます。
   3. 種子を付けて層流チャンバーにシーズを取り込み、洗浄ごとに1分間、50mLのRO水を殺菌して洗浄します。
   4. 2%水性NaOClの50 mLで2分間連続的に振るとともに種子を殺菌し、50mLの滅菌水を5回5回1分間洗浄します。
   5. ポリテーンバッグ(47.5 cm x 25 cm)に土壌(園芸グレード拡張パーライトの混合物) アイリッシュ泥炭苔、剥離したバーミクーライトを等比で1/3:1/3:1/3)、表面滅菌した50種を2cm深くまき、28°Cの2°C±2°Cの成長室/部屋に保管し、光強度150 μmol m^{2 -1} s^-1、相対湿度70%の湿度を有する。RO水でそれらを水にし、播種の8日後に植物を根こそぎにします。
   6. 土壌の粒子を除去するために水道水で根を洗います。根を殺菌したRO水ですすい、RO水に1000 mLビーカーで入れておきます。
3. トレイ内のブロッティング紙の準備
   1. ブロッティング紙を取り、複製を満たすのに十分な数(30cm×23cm)に切ります。
   2. シートをオートクレーブ可能なポリテーン袋に詰め、121ポンドで15分間オートクレーブし、乾燥のための熱風オーブンに保管してください。
   3. 各ブロッティング用紙を半分に折ります。
   4. 図 2i-ivに示すように、紙を清潔で精神で拭いたプラスチックトレイの上に置きます。
4. 浸漬による植物接種
   1. 200 mL のオートクレーブ RO 水に 100 gの真菌接種液を 200 mL で溶解し、50% の接種を得る。
   2. 調製した接種物に植物の根を1分間浸し、断続的な上下運動を行い、真菌内の一様な付着を確実にします。
5. ブロッティング紙に植物を配置する
   1. トレイに置かれたブロッティングペーパーの底面を滅菌RO水で濡らします。根だけが紙で覆われ、芽が取り残される方法で、植物を紙の上に置きます。
   2. ブロッティングペーパーの上面を折りたたんで閉じ、植物の成長を維持するのに十分な水を提供するために紙全体を濡らします。
   3. 1日1回トレイに水をやり、トレイを28°Cに保ちます。 壊死、根腐れ、葉の黄変などの症状を毎日観察してください。

3. シックポットテクニック

注:病気のポット技術は、有害な接種と病気のポットの調製、水分レベルの維持、および病気の症状の評価を伴います。

1. 基板の作製
   1. 市販のひよこ豆の種子を1kg摂取してください。感染した種子(真菌の増殖、感染スポット、昆虫の損傷を伴う種子)を除去する。5 Lプラスチックビーカーに入れ、水道水で3~4回徹底的に洗い、大きな破片を取り除きます。
   2. 2 LのRO水で種を洗い、5Lビーカーに1kgの種子を5倍の水で浸します。
   3. 種子が水を浸透したら、RO水で再洗浄して種子が滲出します。
   4. 水を完全に取り除き、ジャムボトル(300mL、高さ12cm、直径6cm、体重155g)で約1/4^分 の容量(ジャムボトルあたり100g)に種子を詰め、キャップでボトルを閉じます。10個のジャムボトルをオートクレーブ可能なビニール袋(48 cm x 30 cm)のオートクレーブに121ポンドで2回パックし、15分間連続してパックします。
   5. オーブンで40°Cの種子を一晩乾燥させ、ボトル内の水滴を取り除きます。
2. 病気文化の準備
   1. BSL-2レベルの層流れチャンバーをオンにします。70%エタノールで床を十分に拭き、15分間紫外線をオンにします。次に、ラミナーフローチャンバー内に種子を保管します。
   2. 10日齢の孤立した R.バタチコラ 文化を取る(パート1)。次に、滅菌ピペットチップまたはコルクボーラーを使用して3本の真菌寒天プラグ(直径4mm)を取り、無菌でジャムボトルに入れます。ボトルをキャップで覆い、パラフィルムでシールします。
   3. ボトルを振って、真菌ディスクとひよこ豆の種を均一に混ぜます。
   4. 30°Cで、暗闇の中で15日間インキュベートします。
   5. 黒い真菌の成長を持つジャムボトル(図4iii)を取り、殺菌鉗子を使用してジャムボトルからガラスペトリプレートに病気の文化(マイクロクレローティアの種子)を移します。ガラスペトリプレートで2日間室温で乾燥させます。
   6. 乳鉢と害虫を用いて菌塊を粉末化し、4°Cで保存します。
   7. 121ポンドで15分間オートクレーブソイルライトを2回行います。
   8. オートクレーブドソイルライトミックスを日よけで乾かします。
   9. 50%w/wでソイライトと真菌粉末を混合し、混合物で鍋を満たし、一日室温でそれらを維持します。
   10. 表面滅菌されたDRR感受性のひよこ豆の種子をポット(10cm丸ポット)(材料表)にまき、80%のフィールド容量(FC)の水分レベルを維持します。
   11. 発芽後に植物を根こそぎにして壊死や根腐れなどの症状を観察する。
3. 病気のポット効率の評価
   注:植物は根が完全に腐っているとき黄色の葉面症状を示します。
   1. 病変(壊死性斑点)(補足図2C)の数と根腐敗の重症度に基づいて疾患スコアを開発する。90%の植物死を示すシックポットはさらに使用することができます。
4. 遺伝子型スクリーニング
   1. 病気の文化を大量に準備し、30cmの高さの鍋で殺菌された土壌または畑の土壌(5%w/w)と混ぜます。水に水をやって表面を濡らし、7日間邪魔されずに放置します。
   2. 10 cmの丸い鍋ごとに1つの表面滅菌種子を播種し、30cmの丸い鍋ごとに3つの種子を播種し、それらを十分に水にする。
   3. 黄色の葉前葉と根腐りの症状を観察してください。
5. 干ばつと R.バタチコラ 感染症を組み合わせた
   1. Sinhaら(2019)で言及されているプロトコルに従って干ばつストレスを課す。

結果

本研究は、干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態形態および分子理解を促進するための、ブロッティング紙やシックポット技術などの技術を実証することを目的とした。これを達成するために、DRR症状^1、3、4を呈する植物をひよこ豆場から採取し、真菌を催眠先端法⁸を用いて単離した。

ディスカッション

ブロッティングペーパー技術は、実験室の条件下でひよこ豆遺伝子型をスクリーニングするための簡単なアプローチを提供します。浸出接種は、接種負荷を容易に制御して時間ベースで相互作用を調査し、インビトロスクリーニングを容易にする。さらに、若い苗も使用できます。5日前の真菌培養(図1B)は、植物に感染するのに十分な接種を生じることがで...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901