ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論

要約

本研究では、ひよこ豆-根支バタチコラ 相互作用の根底にある病態分子メカニズムを研究する方法論を提示する。ブロッティングペーパー法は、ひよこ豆遺伝子型応答を迅速に研究するのに有用であり、病気のポットベースの方法は、同時に干ばつと R.バタチコラ 感染を課し、寛容な遺伝子型のスクリーニングに使用することができます。

要約

乾燥した根腐れ(DRR)病は、世界中のひよこ豆栽培に対する新たな生物ストレスの脅威です。これは、土壌媒介性真菌病原体、 根支バタチコラによって引き起こされます。文献では、疾患アッセイに関する包括的かつ詳細なステップバイステップのプロトコルはまばらである。この記事では、DRRに対する耐性の遺伝子型をすばやくスクリーニングするためのブロッティングペーパー技術の設定に関する手順の詳細を提供します。ブロッティング紙の技術は簡単で安価です。病気のポットアプローチに基づくもう 1 つの方法は、自然感染の模倣であり、疾患の三角形に関与する相互作用コンポーネント(植物、病原体、および環境)を研究するために適用することができます。

さらに、自然界では、DRRは主に雨が降ったひよこ豆栽培地域で発生し、作物の成長が進むにつれて土壌水分が後退します。干ばつストレスは、DRR病にひよこ豆植物を素因とすることが知られています。干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態および分子的理解は、ひよこ豆の生殖器プールからのエリートDRR耐性品種の同定のための道を開くことができる。本稿では、病的なポットの調製とその後の疾患アッセイのための段階的な方法論を提供する。全体として、本明細書に提示された情報は、研究者が R.バタチコラ 真菌接種を準備し、この病原体を維持し、ブロッティングペーパー技術を設定し、病気の培養および病気のポットを準備し、ひよこ豆植物における病原体感染を評価するのに役立ちます。

概要

乾燥した根腐れ(DRR)は、ひよこ豆^1、2の経済的に重要な疾患の一つである。これは、根性バタチコーラ(テレオモーフ、マクロフォミナフェイショウチリーナ)によって引き起こされる根特異的疾患である。感染した植物は横根を欠き、脆いタップルートと黄色の葉^1、3を所有しています。干ばつストレス下のDRRは、ひよこ豆栽培^1、2、3に対する新たな脅威であると報告されている。さらに、DRRの発生率は、フィールド条件^1、2、3の下で干ばつストレス下で悪化すると報告されている。DRRは、灌漑されたフィールド⁴よりも雨の多い地域で一般的です。耐性品種の利用は、病気を克服し、殺菌剤の使用を回避する方法です^1,13<....

プロトコル

1. R. バタチコラ とストレージの分離

1. ひよこ豆遺伝子型とDRR症状の詳細
   1. 一般的に典型的なDRR症状を示すひよこ豆植物(遺伝子型、JG62)を用いて、樹皮の下およびピス^1、3の下に横根と微小動脈を持たない乾燥した脆い原根のような一般的なDRR症状を示す。
2. 収集と洗浄
   1. 乾燥したわら色の葉膜や表皮層の下に微小動脈を持つ脆い原根などの症状を示す根根植物。根こそぎにしている間、感染した根が脆くなるにつれて、根の大部分は土壌の中に残ります。根に付けられた粗い土の破片を取り除きます。根を別々に切り取り、適切なラベルを貼った紙の封筒(27.5 cm x 12 cm)に集め、サンプルの採取ボックスに入れます。
   2. サンプルを実験室に運んだ後、根を200 mLビーカーに入れ、メッシュ(直径3mmの細孔サイズのナイロンメッシュ)で覆い、根を水道水で十分に洗い流して土壌粒子を除去します。
   3. 逆浸透(RO)水を使用して、最後に一度すすきます。
3. 表面滅菌
   1. 根を2cmの長さの4つに分割し、メスの刃を持ち、清潔な200 mLビーカーに入れます。
   2. オートクレーブRO水、2%NaOCl、廃棄瓶、およびオートク....

結果

本研究は、干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態形態および分子理解を促進するための、ブロッティング紙やシックポット技術などの技術を実証することを目的とした。これを達成するために、DRR症状^1、3、4を呈する植物をひよこ豆場から採取し、真菌を催眠先端法⁸を用いて単離した。

ディスカッション

ブロッティングペーパー技術は、実験室の条件下でひよこ豆遺伝子型をスクリーニングするための簡単なアプローチを提供します。浸出接種は、接種負荷を容易に制御して時間ベースで相互作用を調査し、インビトロスクリーニングを容易にする。さらに、若い苗も使用できます。5日前の真菌培養(図1B)は、植物に感染するのに十分な接種を生じることがで.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901