Сухой корень Rot болезни анализы в Chickpea: Подробная методология

Резюме

В этом исследовании представлены методологии для изучения патоморфологических и молекулярных механизмов, лежащих в основенут-Ризоктония бататикола взаимодействия. Метод blotting бумаги полезн для того чтобы быстро изучить реакции генотипа нута, пока больной бак-основанный метод можно использовать для того чтобы одновременно навести засуху и инфекцию R. bataticola и экран для толерантных генотипов.

Аннотация

Сухая корневая гниль (DRR) болезнь представляет собой возникающие биотические угрозы стресса для выращивания нута во всем мире. Это вызвано почвенным грибкового патогена, Rhizoctonia bataticola. В литературе всеобъемлющие и подробные пошаговие протоколы по анализу заболеваний являются редкими. В этой статье приводится полная информация о шагах, связанных с созданием метода блоттинг бумаги для быстрого скрининга генотипов на устойчивость к DRR. Техника blotting бумаги легка и более менее дорогая. Другой метод, основанный на подходе больной горшок, является имитацией естественной инфекции и может быть применен для изучения взаимодействующих компонентов- растений, патогенов и окружающей среды, участвующих в треугольнике болезни.

Кроме того, в природе, DRR происходит в основном в дождевых районах выращивания нута, где влажность почвы отступает по мере роста урожая. Засуха стресс, как известно, предрасполагают растения нута к drR болезни. Патоморфологическое и молекулярное понимание взаимодействия растений и патогенов в условиях засухоустойчивого стресса может проложить путь для выявления элитных сортов, устойчивых к ДРР, из бассейна зародышевой плазмы нута. В этой статье приводится пошаговая методология подготовки больного горшка и последующего анализа заболеваний. В целом, информация, представленная в настоящем документе поможет исследователям подготовить R. bataticola грибковый инокулум, поддерживать этот патоген, создать технику blotting бумаги, подготовить больную культуру и больной горшок, и оценить патогенной инфекции в растениях нута.

Введение

Сухая корневая гниль (DRR) является одним из экономически значимых заболеваний в^{нуте 1,2}. Это корень конкретных заболеваний, вызванных Rhizoctonia bataticola (телеоморф, Макрофомина phaseolina). Зараженные растения не имеют бокового корня и обладают хрупкими тапрутами и желтой^{листвой 1,3.} DRR под засухой стресс, как сообщается, возникающие угрозы для выращивания^{нута 1,2,3}. Кроме того, заболеваемость ДРР, как сообщается, усугубляется в условиях засухи^{в полевых условиях 1,2,3.} DRR более распространен в дождевых районах, чем на орошаемых полях^4. Использование устойчивых сортов является способом преодоления болезни и обойти фунгицид использования^1,13. Поскольку зародышевая плазма нута, доступная по всему миру, имеет^{генетические вариации для черты 5,}скрининг и выявление устойчивых/восприимчивых генотипов имеют решающее значение для молекулярного разведения для улучшения урожая.

Надежные, легкие и экономически эффективные анализы заболеваний имеют важное значение для исследования R. bataticola инфекции моделей в нуте. Первичное заболевание анализ используется для наблюдения за реакцией генотипов нута на R. bataticola инфекции является blotting бумаги^{техники 1,4}. Это простой метод и может быть выполнена с помощью жидких грибковых инокулов, саженцы с корнями, и стерильные blotting бумаги. Однако этот метод не был использован по максимуму, поскольку в литературе нет пошагового протокола.

Между тем, больной горшок техника включает в себя подготовку потенциальной больной культуры и введение засухи стресса. Учитывая, что засуха стресс усугубляет заболеваемость DRR^{заболеваемости 3}, важно изучить растительно-патогенного взаимодействия в условиях^{засухи стресс 6,7}. Техника больного горшка обеспечивает платформу для такого одновременного исследования, способствуя лучшим возможностям для скрининга зародышевой плазмы и понимания механистической основы взаимодействия. Патоморфологические изменения, такие как увеличение длины корня и уменьшение бокового числа корней, присущих болезни DRR, могут быть решены с помощью метода^{больной горшок 1,3,7}.

В этом документе представлен подробный протокол для blotting бумаги и больных горшок методы, которые могут быть использованы для изучения взаимодействия между нута и R. bataticola и экран нута зародышевой плазмы, представлен. Подробная информация о материалах, используемых в исследовании, представлена в таблице материалов.

протокол

1. Изоляция R. bataticola и хранение

1. Подробная информация о генотипе нута и симптомах DRR
   1. Используйте нут растений (генотип, JG 62), которые обычно показывают типичные симптомы DRR, такие как сухой, хрупкий первичный корень без бокового корня и микросклероции под корой и внутри^{сердцевины 1,3}.
2. Сбор и стирка
   1. Выкорчевывание растений, проявляя такие симптомы, как сухой соломенный цвет флоры и хрупкий первичный корень с микросклеротия под слоем эпидермиса. При выкорчевывании большая часть корней останется внутри почвы, так как зараженные корни хрупкие. Удалите грубый почвенный мусор, прикрепленный к корню. Вырезать корни отдельно и собирать их в бумажные конверты (27,5 см х 12 см) с надлежащей этикеткой и поместить их в коробку для сбора образцов.
   2. После транспортировки образцов в лабораторию поместите корни в стакан 200 мл и накройте сеткой (нейлоновая сетка диаметром 3 мм) и тщательно промыть корни проточной водопроводной водой, чтобы удалить прилипающие частицы почвы.
   3. Используйте обратный осмос (RO) воды для полоскания один раз в конце.
3. Поверхностная стерилизация
   1. Разбейте корни на четыре части длиной 2 см каждый скальпелем и положите их в чистый стакан 200 мл.
   2. Соберите автоматическую воду RO, 2% NaOCl, отбрасывая банку, и автоклавную бумагу (5^{см 2}) внутри ламинарный поток камеры.
   3. Вымойте корни с 50 мл автоматической воды RO трижды, а затем с 50 мл 2% NaOCl в течение 10 мин. Вымойте корни с 50 мл воды RO три раза снова, чтобы удалить NaOCl.
   4. Пятно высушить корни, поместив корни на автоклавной бумаги и оставить до тех пор, пока корни высушиваются.
4. Средства массовой информации и инкубация
   1. Удалите края корней с стерилизованным лезвием скальпеля. Разделите корни с помощью лезвия и использовать стерилизованные типсы, чтобы поместить их на картофель декстроза агар (PDA) СМИ Петри пластины, содержащие стрептомицин сульфат (50 мг L^-1) и ампициллин (50 мг L^-1).
   2. Закройте пластину, запечатате парафильмом и инкубировать в инкубаторе при 28 градусов по Цельсию в течение двух дней в темноте.
5. Метод наконечника Hyphal
   1. После двух дней инкубации, принести пластины в камеру ламинарного потока. Вырежьте кончик гипхаля^{роста 8} под стереомикроскопом (Leica E-4 образовательный стереомикроскоп) и передать его в свежей пластины КПК со стрептомицином сульфатом и ампициллином.
   2. Инкубировать пластины в инкубаторе при 28 градусов по Цельсию в течение десяти дней в темноте.
6. Хранение и техническое обслуживание грибкового инокулума R. bataticola
   1. Сделать КПК наклоны в пробирках и передачи грибковых агар штепсельная вилка из десятидневной пластины культуры с помощью пламени стерилизованной цикл прививки. Печать крышки пробирки с парафильмом.
   2. Инкубировать наклоны при 28 градусов по Цельсию в течение десяти дней в темноте.
   3. Печать крышку с парафильмом снова и хранить его при 4 градусов по Цельсию в холодильнике для использования в будущем.
   4. Субкультура каждые шесть месяцев для поддержания грибка.
7. Поддержание вирулентности
   1. Заразить растения с чистой грибковой инокулума подготовлены, как уже упоминалось в больной горшок^{техники 3}. Изолировать тот же грибок от инфицированных растений (постулаты Коха)^{9 и} использовать для дальнейших экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался полевой изолированный штамм гриба (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Техника blotting бумаги

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод blotting бумаги влечет за собой подготовку жидких грибковых инокулов, рассады подготовки, а также оценки заболеваний.

1. Приготовление жидкого инокулума R. bataticola
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий R. bataticola грибковый inoculum содержит как мицелия и микроклеротия. Обе эти структуры выступают в качестве основного инокулума.
   1. Подготовь 500 мл PDB-медиа в колбе 1000 мл и автоклав в 121 фунт за 15 минут.
   2. После того, как средства массовой информации охлаждается, привить бульон с loopful грибковых агар штепсельная вилка из грибковых наклонной культуры и инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение пяти дней в шейкере при 180 об / мин в темноте.
   3. Соберите на столе автоклавное стекло или пластиковую воронку (10 см), однолитровую коническую колбу и^{два слоя сетки (размер 10 см 2)} (нейлоновая сетка диаметром 3 мм). Отфильтруйте грибковую мицелию и микросклероцию с помощью сетки. Пятно высушить грибок в автоклавной бумаге.
   4. Взвесить 100 г мизелии на 50% инокулума и держать при комнатной температуре.
2. Приготовление растения нута
   1. Выберите 50 здоровых семян (в данном исследовании использовался генотип JG 62, подверженный DRR, поместите их в стакан 100 мл и накройте сеткой.
   2. Вымойте семена водопроводной водой, чтобы удалить почвенный мусор.
   3. Возьмите стакан с семенами в камеру ламинарного потока и мыть их стерилизованными 50 мл воды RO трижды в течение 1 мин за стирку.
   4. Стерилизовать семена с 50 мл 2% aqueous NaOCl в течение 2 мин с непрерывной встряхивания и мыть семена с 50 мл стерилизованной воды пять раз в течение 1 мин каждый.
   5. Заполните полиэтиленовый пакет (47,5 см х 25 см) с Soilrite (смесь садоводства класса расширена перлит, ирландский торфяной мох, и отшелушивается вермикулит в равном соотношении т.е., 1/3:1/3:1/3), сеять поверхностно стерилизованные 50 семян на глубину два см, и держать в камере роста / комнате с 28 градусов по Цельсию ± 2 градусов по Цельсию температуры, 16 ч фотопериод с интенсивностью света 150 мм^{м 2 с 1}, и относительная влажность 70%. Поливайте их водой RO и выкорчевывать растения через восемь дней после посева.
   6. Вымойте корни в водопроводной воде, чтобы удалить частицы Soilrite. Промыть корни стерилизованной водой RO, и держать их в воде RO в стакане 1000 мл.
3. Приготовление бумаги в лотках
   1. Возьмите бумагу и разрежьте их на кусочки (30 см × 23 см) в достаточном количестве, чтобы удовлетворить репликации.
   2. Упакуйте листы в автоклавируемый полиэтиленовый пакет и автоклав их на 121 фунтов в течение 15 минут и держать его в духовке горячего воздуха для сушки.
   3. Сложите каждый лист бумаги пополам.
   4. Поместите бумагу на чистый, вытертый духом пластиковый лоток, как показано на рисунке 2i-iv.
4. Прививка растений путем погружения
   1. Растворите 100 г грибкового инокулума в 200 мл автоматической воды RO в стакане 200 мл, чтобы получить 50% инокулум.
   2. Dip корни растений в подготовленном inoculum в течение 1 мин с прерывистым вверх-вниз движения для обеспечения равномерного крепления грибковых инокулум.
5. Размещение растений в бумаге для помарки
   1. Влажная нижняя сторона бумаги, помещенной на поднос со стерильной водой RO. Поместите растения на бумагу таким образом, чтобы только корни были покрыты бумагой, а побеги остались в стороне.
   2. Закройте его, сложив верхнюю сторону бумаги и мокрой всей бумаги, чтобы обеспечить достаточно воды для поддержания роста растений.
   3. Поливать лоток один раз в день и держать лотки при 28 градусов по Цельсию. Наблюдайте такие симптомы, как некроз, корневая гниль и пожелтения листьев ежедневно.

3. Больной горшок техники

ПРИМЕЧАНИЕ: Больной горшок техника влечет за собой подготовку вирулентного инокулума и больной горшок, поддержание уровня влаги, а также оценка симптомов заболевания.

1. Подготовка субстрата
   1. Возьмите один кг любых коммерчески доступных семян нута. Удалите зараженные семена (семена с грибкового роста, инфекции пятна, и повреждения насекомых). Поместите их в 5 Л пластиковый стакан и мыть с водопроводной водой тщательно 3-4 раза, чтобы удалить крупный мусор.
   2. Вымойте семена с 2 л воды RO трижды и замочить 1 кг семян в стакане 5 л с трехкратным больше воды в течение пяти часов.
   3. После того, как семена впитал воду, перемойте их ro воды трижды, чтобы удалить семена экссудатов.
   4. Полностью удалите воду и упакуйте семена в бутылки с вареньем (300 мл, рост 12 см, диаметр 6 см и вес 155 г) примерно до 1/4^тыс. (100 г на бутылку варенья) и закройте бутылки крышками. Упакуйте десять бутылок варенья в автоматический полиэтиленовый пакет (48 см х 30 см) автоклав дважды при 121 фунте в течение 15 мин непрерывно.
   5. Высушите семена при температуре 40 градусов по Цельсию в духовке на ночь, чтобы удалить капли воды внутри бутылки.
2. Подготовка больной культуры
   1. Включите камеру ламинарного потока уровня BSL-2. Протрите пол тщательно с 70% этанола, и включите УФ в течение 15 мин. Затем держите семена внутри камеры ламинарного потока.
   2. Возьмите 10-дневную недавно изолированную культуру R. bataticola (часть 1). Затем возьмите три грибковых агара пробки (диаметр 4 мм) с помощью стерильной наконечник пипетки или пробки борер, и положить их в варенье бутылки асептически. Обложка бутылки с крышками и печать с парафильмом.
   3. Встряхните бутылки, чтобы смешать грибковый диск с семенами нута равномерно.
   4. Инкубировать бутылки при 30 градусов по Цельсию в течение 15 дней в темноте.
   5. Возьмите бутылки варенья с черным грибковым ростом(рисунок 4iii) и перенесите больную культуру (семена с микросклероцией) из бутылок варенья в стеклянную тарелку Петри с помощью стерильных типсов. Высушите их при комнатной температуре в течение двух дней в стеклянной тарелке Петри.
   6. Порошок грибковой массы с помощью раствора и пестика, и хранить порошок при 4 градусов по Цельсию.
   7. Автоклав Soilrite дважды на 121 фунтов в течение 15 мин.
   8. Высушите автоклавную смесь Soilrite под шезлонгом.
   9. Смешайте грибковый порошок с Soilrite на 50% ж / в, заполнить горшки со смесью, и держать их при комнатной температуре в течение дня.
   10. Посеять поверхностно стерилизованных DRR-восприимчивых семян нута на горшок (10 см круглые горшки) (Таблица материалов) и поддерживать уровень влаги 80% полевой мощности (FC).
   11. Наблюдайте за такими симптомами, как некроз и корневая гниль, выкорчевывание растений после прорастания.
3. Оценка эффективности больного горшка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растения показывают желтые симптомы флоры, когда корни полностью гнилые.
   1. Разработка оценки заболевания на основе поражения (некротические пятна) (Дополнительный рисунок 2C) номера и тяжесть корневой гнили. Больные горшки, показывающие 90% смерти растений могут быть использованы далее.
4. Генотипный скрининг
   1. Подготовьте больную культуру в больших количествах и смешайте ее либо с стерилизованным soilrite, либо с полевой почвой (5% ж/у) в горшках высотой 30 см. Вода горшки, чтобы мокрой поверхности и оставить их спокойно в течение семи дней.
   2. Посеять одно поверхностно-стерилизованное семя на 10 см круглый горшок и три семена на 30 см круглые горшки и поливать их адекватно.
   3. Наблюдайте желтые foliar и симптомы гнили корня.
5. Комбинированная засуха и инфекция R. bataticola
   1. Навязать засуху стресс, следуя протоколам, упомянутым в Sinha et al. (2019).

Результаты

Это исследование было направлено на демонстрацию таких методов, как blotting бумаги и больных горшок методы для облегчения патоморфологических и молекулярных понимание растительно-патогенного взаимодействия в условиях засухи стресса. Для достижения этой цели, растения, выставленные сим...

Обсуждение

Техника blotting бумаги обеспечивает простой подход к экрану генотипов нута в лабораторных условиях. Прививка от погружения позволяет исследование взаимодействия на временной основе с легким контролем над инокулум нагрузки(Дополнительная цифра 1) и облегчает in vitro скрининга. Кро...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901