פרופיל חילוף חומרים כדי לקבוע את ההשפעות Bactericidal או Bacteriostatic של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מיקרוקלורימטריה איזותרמית

Summary

ההברה של מצב הפעולה של אנטיביוטיקה חדשנית היא משימה מאתגרת בתהליך גילוי התרופה. מטרת השיטה המתוארת כאן היא היישום של מיקרוקלורימטריה isothermal באמצעות calScreener בפרופיל אנטיבקטריאלי כדי לספק תובנה נוספת על אינטראקציות סמים-חיידקים.

Abstract

בשל האיום העולמי של עמידות מיקרוביאלית עולה, אנטיביוטיקה רומן נחוצים בדחיפות. אנו חוקרים מוצרים טבעיים מ Myxobacteria כמקור חדשני של תרכובות חדשות כאלה. צוואר בקבוק אחד בתהליך הוא בדרך כלל ההברה של מצב הפעולה שלהם. לאחרונה הקמנו מיקרוקלורימטריה isothermal כחלק צינור פרופיל שגרתי. טכנולוגיה זו מאפשרת לחקור את ההשפעה של חשיפה לאנטיביוטיקה על התגובה המטבולית החיידקית הכוללת, כולל תהליכים המפוענחים מהיווצרות ביומסה. חשוב לציין, אפקטים bacteriostatic ו bactericidal ניתן להבחין בקלות ללא כל התערבות המשתמש במהלך המדידות. עם זאת, מיקרוקלורימטריה isothermal היא גישה חדשה למדי ויישום שיטה זו על מינים חיידקיים שונים בדרך כלל דורש הערכה מראש של תנאי מדידה מתאימים. ישנם כמה תרמוגרם התייחסות זמין של חיידקים מסוימים, מאוד להקל על פרשנות של תוצאות. ככל שבריכת נתוני ההתייחסות גדלה בהתמדה, אנו מצפים שלמתודולוגיה תהיה השפעה גוברת בעתיד ומצפים שהיא תאפשר ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים המאפשרים בידול של שיעורי אנטיביוטיקה.

Introduction

מטרת שיטה זו היא להחיל מיקרוקלורימטריה isothermal (IMC) כמו תפוקה בינונית assay במצב של פעולה (MoA) פרופיל של תרכובות אנטיבקטריאליות חדשות. שיטה זו חושפת נתונים לגבי הפעילות של תרכובות על מינים חיידקיים ומספקת מידע על האופי bactericidal או bacteriostatic של המתחם עצמו.

עלייתה של עמידות מיקרוביאלית המתעוררים (AMR) היא בעיה גלובלית וזה מוביל טיפולים פחות יעילים של זיהומים נפוצים עם אנטיביוטיקה^{ידועה 1}. עם זאת, החיפוש אחר תרכובות ותרופות חדשות שיכולות להחליף או לעבוד בשילוב עם אנטיביוטיקה ידועה נמשכות וזה בנוי על גישות מגוונות. מוצרים טבעיים הם שחקן מפתח בקמפיינים הנוכחיים גילוי סמים ובמיוחד בגילוי תרופות נגד^{זיהומים 2}. עם זאת, זיהוי מבני עופרת חדשים לפיתוח אנטיביוטיקה הוא תהליך ארוך ותובעני מבחינה כלכלית³. לכן, השלבים המוקדמים של הגילוי חשובים מאוד על מנת לסנן על הפיגומים המבטיחים ביותר כבר בשלב מוקדם. צעדים ראשוניים בגילוי תרופות מוצר טבעי כוללים השגת מבנה של מתחם, קביעת הפעילות במבחנה יחד עם MoA וזיהוי היעד. רוב התרכובות המוצלחות להיות זכאי לפיתוח נוסף צריך להציג ספקטרום חיובי של פעילות (כלומר, פעילות ספקטרום רחב במקרה של אנטיבקטריאליים) רומן MoA שבו AMR קיים מראש ניתן להתגבר. פיגומים מבטיחים מוקרנים בדרך כלל בהנאות משנית, הכוללים זמינות ביולוגית vivo, רעילות, וחילוף חומרים⁴. מלבד החששות הכספיים, גילוי תרופות מוצר טבעי עומד בפני אתגרים נוספים לגבי העלויות וקשיים טכניים הקשורים בידוד מורכב טיהור, אשר, בתורו, יכול לעשות את זה קשה להשיג כמויות מרובות מיליגרם או אפילו גרם בשלבים המוקדמים של^{תהליך הגילוי 5,6}. לכן, יש חשיבות עליונה במחקר המוצר הטבעי כדי להיות מסוגל לבצע ההקרנה העיקרית המדינה-of-the-art עם כמויות מורכבות מינימליות על מנת לקחת החלטה מושכלת על השקעות נוספות כדי להפוך מוצר טבעי חדשני נגיש לפיתוח פרה-קליני. עם השימוש IMC עבור פרופיל אנטיבקטריאלי, כמות המתחם הדרוש מופחת באופן משמעותי בהשוואה לשיטות סטנדרטיות. הטכניקה מספקת גם מידע מעמיק יותר לגבי האינטראקציה של תרופות חדשות עם הקהילה המיקרוביאלית⁷.

IMC היא שיטה מבוססת למדידת אנרגיה כוללת כתוצאה מכל התהליכים הביולוגיים, הפיזיים והביוכימיים והתגובות במערכת ביולוגית. שחרור אנרגיה חיידקית הוא פרופורציונלי לתגובות חילוף החומרים הכולל⁸. בתוך מערכת סגורה, כגון מיקרוקלורימטר בשימוש, ניתן למדוד את רמות החום בטווח microwatt כדי ללמוד את הקינטיות חילוף החומרים של^{חיידקים 9,10,11,12}. החום (אנרגיה) המשתחרר על ידי חיידקים מקושר לפונקציות תאיות כי בבסיס חילוף החומרים שלהם, כי הם לא בהכרח פרופורציונליים ביומסה התא.

בתחילה, הישימות של קלורימטריה isothermal עבור בדיקות מיקרוביולוגיות הוגבלה בשל התפוקה הנמוכה שלה ונפחי בדיקה גבוהים. עם זאת, microcalorimeter בשימוש הוא ייחודי כפי שהוא משלב את היתרונות של קלורימטריה איזותרמית עם תפוקה מוגברת ודרישות מורכבות נמוכות יותר, מה שהופך אותו לכלי בעל ערך עבור^{יישומי גילוי סמים 10}. יתר על כן, המכשיר מספק יתרונות נוספים על פני שיטות חלופיות למדידת קינטיקה צמיחה חיידקית, כגון שיטת המערבולת הסטנדרטית, אשר מבוסס על מדידה של צפיפות אופטית ב 600 טנ"מ (OD<₆₀₀). מדידת OD₆₀₀ מבוססת על ההנחה כי צפיפות אופטית מוגברת שווה לצמיחה מיקרוביאלית, ובכך מזניחה את הנוכחות של תאים שאינם קיימא. שיטה זו גם זכתה לביקורת מכך שהיא אינה כוללת משתני מושבה קטנים ותאים Persister¹¹. לעומת זאת, IMC מאפשר תצפית בזמן אמת של כל סוג של תאים קיימא. אם התאים רדומים, הם עדיין מפגינים פעילות מטבולית ולכן הם יכולים להתגלות על ידי IMC, בעוד תופעות כאלה אינן ניתנות לזיהוי על ידי שיטת המערבולת^{הסטנדרטית 11}. יתרונות אחרים של IMC כוללים זמן בדיקה קצר יותר של רגישות מיקרוביאלית, מדידת אינטראקציות סמים בקהילה מורכבת ושיטות ניתוח סטנדרטיות מבלי להרוס את^{המדגם 7}.

טכנולוגיית IMC יושמה במגוון רחב של מחקרים, החל ממיקרוביולוגיה ועד תרמוגנזה^{וביולוגיה של סרטן 13,,14,,15,,16,,17}. היישומים המיקרוביאליים כוללים את הקביעה של ריכוזים מעכבים מינימליים (MIC) של תרכובות נגד זנים חיידקיים שונים. מספר מחקרים נעשו והוסכם כי נתוני מיקרופון מקלורימטריה isothermal עבור רוב המינים חיידקים ניתן להשיג מהר יותר והתוצאות דומות בהשוואה לשיטות אחרות (סטנדרטיות) לקביעת מיקרופון^12,18,19. יישומים נוספים של IMC כוללים התבוננות באינטראקציה של תרופות ושילוב של טיפולים תרופתיים עם קהילות חיידקים מורכבים כגון biofilms¹¹. מחקר המתמקד בפרופיל MoA הראה כי מיקרוקלורימטר יכול לזהות הבדל צפלוספורינים הדור הראשון והשני, בעוד אנטיביוטיקה שונה עם אותו MoA להפגין עקומת זרימת חום דומה בהשוואה^{זה לזה 18}.

כאן, אנו מתארים את השימוש IMC עבור פרופיל MoA של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מכשיר מיקרוקלורימטריה isothermal החדש. השיטה משמשת כדי לקבוע ריכוזים אנטיביוטיים יעילים ולתאר מאפיינים של אנטיביוטיקה במונחים של מנגנוני bactericidal או bacteriostatic. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב בפרופיל MoA של תרכובות וזה עשוי להחליף או לפחות להשלים שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. מחקרים עתידיים יכללו ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים שיאפשרו בידול של מחלקות אנטיביוטיות בהתבסס על מנגנוני היעד.

Protocol

הערה: יש להגדיר את טמפרטורת המכשיר בהתאם לחיידק המשמש לפחות יום מראש כדי להבטיח את יציבות המערכת. כאן, דגימות Acinetobacter baumannii DSM30008 פועלות ב-30 מעלות צלזיוס.

1. הכנת תרבות

1. פס החוצה המתח תחת חקירה (כאן: A. baumannii)על לוח אגר CASO דגירה לילה באינקובטור סטטי ב 30 מעלות צלזיוס.
2. הכינו תרבות לילה על ידי לחסן מושבה אחת ב-MHB (מרק מולר-הינטון) ותדגירה על אינקובטור רועד ב-180 סל"ד ב-30 מעלות צלזיוס.

2. הכנת מדגם

1. השתמש 1.5 מ"ל צינורות כדי להכין את טווח הריכוז של תרופה או תרכובת שנבחרו (למשל, על ידי הוספת 1.5 μL של פתרונות מניות 100x ב DMSO; ראה שלב 2.3).
2. לדלל את תרבות הלילה במדיום MHB.
   1. למדוד את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 מיליאמפר.
   2. לדלל את התרבות כדי לקבל 5 x 10^{5 מושבה} יוצרים יחידות (CFU)/ מ"ל במדיום MHB טרי. OD₆₀₀ של אחד שווה כ 5 x 10⁸ CFU / מ"ל (למשל, Escherichia קולי, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      הערה: חשוב לכייל את גורם ההמרה OD₆₀₀ ל- CFU/mL עבור כל זן חיידקי בודד תחת תנאי ההתבולה החלים.
3. להוסיף 150 μL של התאים למבחנות שהוכנו בשלב 2.1, הבטחת ריכוז סופי נכון של תרופה נבדקה או תרכובת וריכוז התא הסופי הנכון.
4. מערבבים את המתחם עם התאים על ידי מערבולת.
   הערה: לוח המדגם (ראה טבלת חומרים)כולל שש שורות, שכל אחת מהן מכילה שמונה בארות, בסך הכל 48 בארות; שורה א' ושורה F הן ההפניה התרמודינמית. לכן, אין דוגמאות ניתן לטעון לתוך בארות אלה, מדיה מתאימה נטען לתוך בארות אלה. ניתן למדוד 32 דגימות בדיקה בכל הפעלה, באמצעות בארות בשורות B-E. יש להפעיל דגימת בדיקה בודדת לכל הפחות בכפילויות (כאן: כל הדגימות נוהלו כשלי 3licates). יש לכלול בקרות צמיחה.

3. הוסף הכנה

1. מעבירים 120 μL מהתערובת שהוכנה בשלב 2.4 לתוססות הפלסטיק.
   הערה: השתמש בצנרת הפוכה בשלב 3.1 כדי למנוע ריסוס נוזלים בצידי תוספות הפלסטיק, דבר שיכול להוביל להפרעה לקריאות אותות נכונות.
2. מניחים את כל בקבוקוני הטיטניום במחזיקים (ראו טבלתחומרים) עם פינצטה.
3. מעבירים בעדינות את התוסיפים לתוך בקבוקוני הטיטניום בצלחת המחזיק.
4. מניחים באופן רופף מכסי טיטניום על כל בקבוקוני הטיטניום.

4. הוסף טעינה

1. מעבירים את המחזיק עם כוסות טיטניום לתחנת הדגימה ומעבירים על האזור המיועד.
2. השתמש במפתח הברגים מומנט, להגדיר כוח 40 cNm, כדי להדק את כל העפעפיים.

5. הפעלת דגימות

1. בתוכנה calView, להתחיל ניסוי חדש(דמות משלימה 1).
2. משוך את זרוע הכניסה לדוגמה מהמכשיר.
3. מניחים את מחזיק הספל על "הגשר", עמודה 8 מול פתח הכניסה לדוגמה ודוחפים בעדינות את מחזיק הספל לכלי ב"עמדה 1" הייעודית. המתן 10 דקות עד שהמערכת תתייצב. תייג את בארות הניסוי.
4. לחץ על זרוע הכניסה לדוגמה עד מחזיק הספל הוא ב"מיקום 2" המיועד. המתן 20 דקות עד שהמערכת תתייצב.
5. דחפו את זרוע הכניסה לדוגמה ל"מיקום 3" ומשוך את זרוע הכניסה לדוגמה עד שהיא נמצאת ב"תנוח הריצה". סמן את כל הבארים בתוכנה ובחר תגובה להתחיל (איור משלים 4).
6. הפעל את הניסוי עד פליטת החום קורא הם בחזרה בייצבות באפס.
   הערה: ודא שכל הבארים מתנהגות דומות בשלבים אלה. איור משלים 5 ממחיש מה יש לצפות אם הבארים נטענים כראוי. אם נטען באופן שגוי, חזור על שלבים 5.2-5.4.

6. הסר את מחזיק הספל

1. בתוכנה, בחר עצור (איור משלים 6). לאחר מכן התוכנה תשאל אם "אתה בטוח", בחר כן (איור משלים 7) ולשמוראת הניסוי על כונן או שולחן עבודה לניתוח נתונים(דמות משלימה 8).
2. הכנס את זרוע הכניסה לדוגמה לחלוטין לתוך המכשיר ולהפעיל את המגנטים כדי לאחזר את מחזיק הספל.
3. שחררו את המכסים, הסירו את התוספות והניחתו בקבוקונים ומכסים במחזיקי זכוכית והניחתם למשך 4 שעות ב-180 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הניחו את הבקבוקונים והמכסים במתייבש כדי להבטיח שהמכסים והבקבוקונים יבשים.

7. ניתוח נתונים

1. פתח את התוכנה(איור משלים 9), בחר פתח ניסוי בפינה השמאלית העליונה(איור משלים 10). בחלון המוקפץ בחר את הניסוי של עניין ולחץ על פתח (איור משלים 11). היישום יפתח את הניסוי בתצוגת בארות ברירת מחדל(איור משלים 12).
2. לחץ על בחר את כל או Ctrl+A (איור משלים 13).
3. לחץ על הגדרתוכנית בסיסית , פרמטר זה מנרמל את הנתונים בכל מיקום(איור משלים 14). בחלון המוקפץ בחר פרק זמן של >30 דקות הממוקם בשלב ההשהיה (זרימת החום צריכה להיות נמוכה, בין אפס לעשרה μW; דמות משלימה 15). לאחר בחירת פרק זמן של קו בסיס, התוכנית הבסיסית שנבחרה תופיע בירוק בתרמוגרמה. סגור את החלון הגדרת מקטע בסיסי.
4. לחץ על שמור או Ctrl+S וסגור את התוכנה(איור משלים 16).
5. פתח יישום ניתוח סימצ'ל קלורימטריה מבוסס אינטרנט (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
6. כדי להעלות את הקובץ ליישום ניתוח Calorimetry, לחץ עיון (איור משלים 17),בחר את הניסוי ולחץ על פתח (איור משלים 18). הפרמטרים חילוף החומרים יחושבו באופן אוטומטי עבור 32 דגימות ביישום האינטרנט (איור משלים 19).
7. על מנת להתאים את נתוני זרימת החום ל-Gompertz ו/או למודלים של ריצ'רד, לחץ על פונקציית צמיחה. מודלי צמיחה מתאימים יוצגו בסעיף "מצטבר", בהשוואה גם לנתונים הגולמיים בסעיף "זרימה" (איור משלים 20).
8. כדי להוריד את כל הפרמטרים המחושבים, לחץ על אמצעי הורדה. בחר את מיקום הקובץ ולחץ על שמור(איור משלים 21). הקובץ ייוצא גיליון אלקטרוני לחישובים נוספים.

תוצאות

מספר מספיק של חיידקים המייצרים חום נדרש עבור המכשיר כדי להקליט אות חום. אם יש עיכוב בזמן עד זרימת חום ניתנת לזיהוי זה אומר כי החיידקים עדיין לא לייצר אות חום מעל מגבלת הזיהוי. הגילוי של חום שוחרר מהדגימה החיידקית קשורה ולכן ישירות להגדלת פעילות חיידקים, כולל צמיחה חיידקית. צמיחה חיידקית ופעילויות מטבוליות אחרות ידועות להיות מושפעים מאוד על ידי תוספת של תרופה אנטיבקטריאלית. כדי לקבוע אם מוצר טבעי חדש תחת חקירה מפעיל אפקטים bactericidal או bacteriostatic או שילוב של שני MoAs, בחרנו קבוצה קטנה של תרופות התייחסות והקלטנו תרמוגרמות שאליו השווינו נתונים מניסויים עם המוצר הטבעי. בהתבסס על העוצמה של אנטיביוטיקה שנבחרה מגוון של ריכוזים נבחר להיות קרוב הריכוז המעכב המינימלי (MIC) כפי שנקבע על ידי דילול microbroth.

ציפרופלוקסאצין מטרות ג'ירס DNA חיידקי ו topoisomerase IV וכתוצאה מכך, הוא מציג MoA bactericidal. עם זאת, הרג חיידקי המושרה על ידי ציפרופלוקסאצין הוא תלוי ריכוז, כאשר הוא מינון בריכוזים מספיקים זה יכול להיות גם אפקט bacteriostatic²¹. טטרציקלין וכלוראמפניקול מתמקדים בריבוזום ב-30S ו-50S subunit, בהתאמה, והם פועלים בקטריוזטטיים עקב עיכוב סינתזת חלבון^22,23. Rifampicin פועל על ידי עיכוב פולימראז RNA תלוי DNA וזה יכול להיות שניהם, bactericidal ואפקטים bacteriostatic,^{בהתאם המינון בשימוש 24}. המוצר הטבעי שאנו חוקרים כאן היה מבודד מ Myxobacteria וזה הראה פעילות חזקה נגד גראם שלילי ופתוגנים חיידקים גראם חיוביים. בעת חקירת MoA שלה היעד המולקולרי, היינו מעוניינים לקבוע אם המוצר הטבעי החדש מפעיל אפקטים bactericidal ו / או bacteriostatic והאם פרופילי החום של Baumannii Acinetobacter מטופלים דומים לתרמוגרם מחיידקים שטופלו בתרופות התייחסות שהוזכרו לעיל.

התרמוגרמה שהושגה על ידי חשיפת A. baumannii DSM-30008 לציפרופלוקסאצין באופן סדרתי מוצגים איור 1A. ריכוזים בין 0.005 μM ו 0.1 μM יש השפעה מינימלית על הצמיחה וחילוף החומרים של A. baumannii. עם זאת, טיפול בתאים עם 0.5 μM ציפרופלוקסאצין מוביל לשינוי משמעותי משך שלב השהיה וזרימת חום מקסימלית נמוכה יותר. שני שינויים אלה יחד משפיעים על הזמן לשיא ( איור1C), אשר גדל בכ 6 שעות. באות 1B, החום המצטבר ששוחרר מתווה כנגד הזמן. כאן, אנו רואים את ההשפעה של ריכוזים, אשר משתקף על ידי שיפוע של שיפוע. כימות של שיפוע התרמוגרמה נותן לנו את קצב חילוף החומרים המרבי של A. baumannii בנוכחות ציפרופלוקסאצין כפי שמוצג איור 1D, שבו אנו יכולים לצפות ירידה במקביל של קצב חילוף החומרים של תאים שטופלו 0.5 μM ציפרופלוקסאצין. שינויים בקצב חילוף החומרים של תאים שטופלו בריכוזים נמוכים הם מינימליים. ניסוי זה יכול להיות משופר עוד יותר על ידי תוספת של ריכוזי ביניים המכסים את טווח 0.1-1 μM כדי לצפות בשינוי הדרגתי בולט יותר בין הריכוזים שאין להם השפעה וריכוז וכתוצאה מכך עיכוב משמעותי של שלב השהיה וקצב חילוף החומרים. עם זאת, המגמות של שינוי תומכות ב-MoA bactericidal של ציפרופלוקסאצין.

איור 1א: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 1B: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 1C: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 1D: ההשפעה של ציפרופלוקסאצין על צמיחה וחילוף חומרים של A. baumannii DSM-30008. (א)תרמוגרם המוצג כזרימת חום (μW) לעומת זמן (h) עבור סוג בר (WT) A. baumannii DSM-30008, לא מטופל וחשוף ציפרופלוקסאצין. (ב)חום מצטבר (mJ) לעומת זמן (ח). (ג)הגיע הזמן לשיא (h) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). (D) קצב חילוף חומרים (μW) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

במקרה של טטרציקלין, לא צינו שינויים משמעותיים בתרמוגרם עבור כל הריכוזים שנבדקו עד שלב אקספוננציאלי מאוחר החל לאחר 8 שעות (ראה איור 2A). אף על פי כן, שינויים עיקריים נצפים פליטת חום שלב נייח, שם השיא השני של זרימת חום הוא הוריד באופן משמעותי עבור A. baumannii מטופל עם 5 μM ו 10 μM טטרציקלין. ריכוזים נמוכים יותר היו השפעה גם כן, אשר היה פחות בולט. אפקט זה גם גורם להארכה בזמן כדי להגיע לשיא כפי שמוצג באות 2C. עקומות החום המצטברות שפורסמו(איור 2B)מראות כי תאים שאינם מטופלים ומטופלים אינם מציגים הבדלים משמעותיים בצורת העקומה הכוללת, אלא על ידי נטייה, השיפוע של הקימורים יורד בריכוזים גבוהים יותר של טטרציקלין. זה גם מתורגם קצב חילוף החומרים מכמת המוצג באיור 2D, שם השפעה תלוית ריכוז, (כלומר, ירידה של קצב חילוף החומרים בהגדלת ריכוזי אנטיביוטיקה) נצפתה. ממצאים אלה תומכים בעובדה כי טטרציקלין יש השפעה bacteriostatic.

איור 2א: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2ב: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2C: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2D: ההשפעה של טטרציקלין על A. baumannii DSM-30008 צמיחה וחילוף חומרים. (א)תרמוגרם המוצג כזרימת חום (μW) לעומת זמן (h) עבור סוג בר (WT) A. baumannii DSM-30008, לא מטופל וחשוף טטרציקלין. (ב)חום מצטבר (mJ) לעומת זמן (ח). (ג)הגיע הזמן לשיא (h) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). (D) קצב חילוף חומרים (μW) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

עוד יותר אפקטים בולטים ניתן לצפות בעת טיפול A. baumannii עם מעכב סינתזת חלבון כלוראמפניקול הכוונה 50S ריבוזומאל תת-יחידת. חשיפה לריכוזים הולכים וגדלים של כלוראמפניקול מובילה להארכת שלב ההשהיה ולשינויים משמעותיים בפעילות חילוף החומרים בשלבהנייח ( איור 3א' ואיור 3B). אין שינוי בקצב חילוף החומרים נצפתה עבור הריכוז הנמוך ביותר שנבדק וריכוז הבדיקה הגבוה ביותר שנבחר (50 μM) מונע את שחרור האנרגיה ביותר של המדגם. בהסתכלות על ריכוזי בדיקות ביניים (5 μM ו 10 μM), הזמן לשיא גדל באופן משמעותי על ידי כ 8-9 שעות(איור 3C). בו זמנית, קצב חילוף החומרים של תאים שטופלו מופחת באופן משמעותי, עם 50 μM להיות קטלני(איור 3D). בסך הכל, השינויים שנצפו בריכוזים של עד 10 μM כלוראמפניקול עולים בקנה אחד עם השפעה bacteriostatic של שיעור אנטיביוטיקה זה.

איור 3א: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3ב: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3C: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3D: ההשפעה של כלוראמפניקול על צמיחה וחילוף חומרים של A. baumannii DSM-30008. (א)תרמוגרם המוצג כזרימת חום (μW) לעומת זמן (h) עבור סוג בר (WT) A. baumannii DSM-30008, לא מטופל וחשוף כלוראמפניקול. (ב)חום מצטבר (mJ) לעומת זמן (ח). (ג)הגיע הזמן לשיא (h) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). (D) קצב חילוף חומרים (μW) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

טיפול Rifampicin בטווח הריכוז הנבחר יש השפעה דרמטית על התרמוגרם של A. baumannii DSM-30008 הקשורים משך שלב השהיה והשפעות על הצמיחה עד השלב הנייח המאוחר(איור 4A). ירידה משמעותית של פליטת חום ניתן לראות איור 4B שהולך יחד עם ירידה בפעילות חילוף החומרים. איור 4C ואיור 4D ממחישים את ההשפעה של הארכת שלב ההשהיה ושינויים בפעילות חילוף החומרים בשלב הנייח. איור 4C מציג עלייה מוחלטת בזמן לשיא עבור כל הריכוזים המשמשים. איור 4D ממחיש את הירידה בקצב חילוף החומרים הנגרמת על ידי הירידה במדרון עבור כל הריכוזים כי הוא בדרך כלל ייחס לאפקט bactericidal. בשל הרג אנטיביוטיקה המושרה של תאים חיידקיים, הפעילות חילוף החומרים צפויה להיות נמוכה יותר בשל מספר קטן יותר של חיידקים פעילים נוכח. הנתונים הנאספים הם בהסכמה עם העובדה כי rifampicin יכול לפעול bactericidal ו bacteriostatic, והנתונים המוצגים כאן תומכים בעיקר השפעות bactericidal של הריכוזים שנבחרו.

איור 4א: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4ב: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4C: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4D: ההשפעה של ריפמפיקין על צמיחה וחילוף חומרים של A. baumannii DSM-30008. (א)תרמוגרם המוצג כזרימת חום (μW) לעומת זמן (h) עבור סוג בר (WT) A. baumannii DSM-30008, לא מטופל וחשוף ריפאמפין. (ב)חום מצטבר (mJ) לעומת זמן (ח). (ג)הגיע הזמן לשיא (h) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). (D) קצב חילוף חומרים (μW) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

ריכוז הבדיקה הנמוך ביותר שנבחר של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי (0.25 μM) אין או רק השפעות שוליות על התרמוגרמה של A. baumannii DSM-30008. עם זאת, ריכוזים אחרים שנבדקו מציגים השפעה מסוימת על משך שלב ההשהיה, ומשפיעים על הצמיחה עד לשלב הייחתי המאוחר(איור 5א). ההשפעה הברורה ביותר היא הפחתה משמעותית של פליטת חום בשלב הנייח. נתונים המוצגים בדמות 5B מראים בבירור כי אנרגיה ששוחררה יורדת באופן משמעותי עבור כל הריכוזים היעילים והמדרון יורד גם כן. תופעות אלה לתרגם לירידה של זמן לשיא (איור 5C) וחשוב מכך, ירידה משמעותית ותלויה במינון בקצב חילוף החומרים נצפתה(איור 5D). החקירה של המוצר הטבעי החדש myxobacterial חשפה אפקט bacteriostatic ובקטריוטי משולב.

איור 5א: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5B: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5C: אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5D: השפעה של מוצר טבעי אנטיבקטריאלי חדש על צמיחה וחילוף חומרים של A. baumannii DSM-30008. (א)תרמוגרם המוצג כזרימת חום (μW) לעומת זמן (h) עבור סוג בר (WT) A. baumannii DSM-30008, לא מטופל וחשוף למוצר הטבעי. (ב)חום מצטבר (mJ) לעומת זמן (ח). (ג)הגיע הזמן לשיא (h) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). (D) קצב חילוף חומרים (μW) עם קווי שגיאה (סטיית תקן). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: בחירת ניסוי חדש בממשק התוכנה. בריבוע אדום מתואר השלב לבחירת ניסוי חדש. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 2: מתן שם לניסוי חדש בממשק התוכנה. בכיכר אדומה מתואר השלב לשמו ולאשר את הניסוי החדש. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 3: מתחיל ניסוי חדש בממשק התוכנה. בכיכר אדומה מתואר השלב להתניע ניסוי חדש. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 4: בחירה טובה ותגובה להתחיל בממשק תוכנה. כל בארות התגובה נבחרות (בארות צבועות בצבע כחול עמוק, כפתור בחר את כל מתואר בריבוע אדום) ולהתחיל תגובה נבחרה (מתואר בריבוע אדום). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 5: טעינה נכונה של מחזיק כוסות. בארות הפניה נבחרות (צבע כחול עמוק, ריבוע אדום) ותרמוגרם מוצגים בחלון מוקפץ. כאשר הטעינה מבוצעת כראוי, אנו צופים ירידה תלולה באות פליטת חום שזוהה שחייב להגיע לשלב הרמה ולהישאר בשלב זה כ 2-3 דקות, לאחר מכן האות חוזר לנקודת ההתחלה. כאשר זה נצפה העמסה של מחזיק הספל נכון. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

דמות משלימה 6: סוף הניסוי. באדום, לחצן עצור בניסוי מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 7: אישור סיום הניסוי. באדום, מתואר לחצן כן כדי לאשר את סיום הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 8: שמירת קובץ הניסוי. חלון מוקפץ עם אפשרויות שמירת קובץ מוצג ובאדום מוצג הלחצן שמור. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 9: ממשק תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 10: גישה לניסויים שמורים. באדום, הלחצן פתח ניסוי כדי לגשת לניסויים שמורים מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 11: פתיחת קובץ ניסוי נבחר. באדום הלחצן פתח מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 12: תצוגת בארות המוגדרת כברירת מחדל. כל התרמורמות הניסיוניות והתאמוגרם המתאים נראות לעין. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 13: בחירת בארות לניתוח. באדום הלחצן בחר הכל מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 14: הגדרת תוכנית הבסיס. באדום, הלחצן הגדר קו בסיס מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 15: בחירת האות הבסיסי. נבחרה לפחות 30 דקות של אות בשלב ההשהיה (תיבה אדומה). אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 16: שמירת שינויים בקובץ הניסיוני. באדום, הלחצן שמור מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 17: יישום ניתוח קלורימטרי מבוסס אינטרנט. ממשק התוכנה המקוונת ומסלול העלאת קבצים מוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 18: העלאת קובץ ניסיוני נבחר. באדום הלחצן פתח מתואר. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 19: ניתוח התרמוגרמה. פרמטרים מטבוליים מחושבים עבור כל באר ניסיונית מתוארים באדום. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 20: התאמת הנתונים הניסיוניים למודלים תיאורטיים של צמיחה. נתוני זרימת החום מותאמים לגוף גוף או למודל הצמיחה של ריצ'רד. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 21: ייצוא המידות. באדום מתוארים הלחצנים הורד מידות ושמירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

Discussion

מיקרוקלורימטריה איזותרמית מודדת אנרגיה הנפלטת מדגימה לאורך זמן ושחרור אנרגיה זה הוא תוצאה של כל התהליכים הכימיים הביולוגיים, הפיזיים (הביולוגיים והביו-כימיים). זרימת החום נמדד ניתן לנצל כדי להעריך או לקבוע השפעות אנטיבקטריאליות של חומרים כפי שהוא מאפשר ניטור רציף בזמן אמת של פעילות מטבולית.

על מנת להשיג נתונים אמינים לניתוח, יש לקבוע יחידות נכון של מושבה (CFU) בנפרד עבור כל מין או זן המשמשים. במקרה ספירת CFU הוא נמוך מדי, זה מוביל שלב השהיה ממושכת כפי שלוקח זמן רב יותר עבור המערכת להגיע כמות קריטית של ביומסה לייצר מספיק חום כדי להתגלות. במקרה שספירת CFU גבוהה מדי, שלב ההשהיה יהיה קצר מאוד, וכמות החום המיוצר עלולה לגרום להעברת חום לתאי חיישנים סמוכים (הפניה ובבארות ניסיוניות) ולגרום לעיוותים של התרמוגרם. מספרים גבוהים של CFU גם יובילו לדלדול חמצן מהיר יותר ולעבור לתנאים אנאירוביים. יש לקחת בחשבון גם כי במהלך 30 הדקות הראשונות של הניסוי, כאשר המערכת משווה, איסוף נתונים אינו אפשרי וההקלטה בפועל של אפקטים מתעכבת. בנוסף, קביעת CFU שגויה מובילה לקביעת MIC כוזבת, ובסופו של דבר משפיעה על הניסוי ועל השינויים שנצפו²⁵. נקודה קריטית נוספת היא הקביעה הנכונה של קו הבסיס. בדרך כלל, האות הבסיסי נבחר במהלך שלב ההשהיה כאשר אות זרימת החום הוא אפס ובאופן אידיאלי, טווח הזמן להגדרה בסיסית הוא >30 דקות. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כמו הזמן כי החיידקים דורשים להגיע למגבלת זיהוי אותות חום שונה בין זנים מינים. מינים או זנים מסוימים דורשים יותר מ-30 דקות כדי להגיע למגבלת זיהוי אותות החום בעוד זנים או מינים אחרים מגיעים אליהם ב-30 הדקות הראשונות. במקרה זה, ניתן לבחור את האות הבסיסי בסוף הניסוי כאשר כל אותות החום ירדו בחזרה לאפס ולהישאר יציבים. לחלופין, ניתן להשתמש בנספות מניסויים אחרים עם אותו זן חיידקי, אשר עם זאת אינו מומלץ.

המערכת מאפשרת גמישות מסוימת במונחים של עיצוב ואופטימיזציה של ניסויים ופתרון בעיות. כרכים בשימוש נמצאים בטווח של 100-300 μL בעת שימוש תוספות פלסטיק 100-600 μL בעת שימוש כוסות טיטניום ללא תוספות פלסטיק. נפח העבודה המומלץ על ידי היצרן הוא 120 μL. השימוש בכמויות שונות בהקמת סדרה ניסיונית חדשה, ותוך מציאת תנאים אופטימליים למדידות, משפיע בעיקר על שני פרמטרים. באמצעות אמצעי אחסון נמוכים יותר, ניתן להקטין את כמות תרכובת הבדיקה הנדרשת, דבר שחשוב במיוחד עבור תרכובות, הזמינות רק בכמויות קטנות. בנוסף, הנפח בשימוש משפיע ישירות על זמינות החמצן במהלך המדידה עם נפחים נמוכים יותר להגדיל את כמות החמצן הזמין הנדרש לצמיחה חיידקים. דלדול חמצן הוא אחד הגורמים העיקריים התורמים למשך הזמן המרבי האפשרי של הניסוי. חשוב לציין, ניתן להשתמש במדיה מוצקה, לא רק במדיה נוזלית. זה חשוב במיוחד עבור מיקרואורגניזמים בצמיחה איטית כמו צמיחה בממשק בין שלב מוצק וגז מאפשר גישה טובה יותר חמצן^9.

IMC הוא כלי אנליטי שימושי לגילוי תהליכים לא ידועים עם יישומים בפיזיקה, כימיה וביולוגיה. השיטה מודדת את חילופי החום בתוך מערכת סגורה וניתוח של חילופי החום המתוקליטים מספק מידע נוסף שלא תמיד ניתן להשיג בשיטות סטנדרטיות. במחקר מיקרוביולוגיה ואנטיביוטיקה, אחד היתרונות הגדולים ביותר של IMC היא היכולת שלה להבחין בין תאים חיים, מתים ו persister או רדום, אשר אינו אפשרי באמצעות שיטות טורביות^{סטנדרטיות 11}. בנוסף, IMC הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות פליטת חום מ כמה שיותר 10⁴-10⁵ תאים⁹. יתרון נוסף הוא שההתקנה הניסיונית מהירה וקלה, והיא מאפשרת מעקב רציף בזמן אמת עם מינימום עד ללא הפרעה למשתמש. יתר על כן, IMC הוא לא הרסני, המאפשר ניתוח נוסף של דגימות. ניתוח נתונים מאפשר פענוח של היווצרות ביומסה עד שלב אקספוננציאלי מאוחר או נייח מוקדם ופעילות מטבולית בשלב נייח.

מלבד תכונות היישום הרומן והמרגש שהוזכרו לעיל, יש גם חסרונות לשיטה זו. המגבלה העיקרית היא שמכשירי IMC מודדים את החום הכולל המיוצר ומשוחרר בתוך מערכת ספציפית, הכוללת גם אותות לא ספציפיים. זה מדגיש את החשיבות של תכנון ניסיוני עם פקדים מתאימים כדי להיות מסוגל להעריך את שינויי אות החום הנמדדים על ידי^{הקלטת זרימת חום 9,20}.

בידיים שלנו, IMC הוא כלי חשוב ללמוד השפעות אנטיבקטריאליות של מוצרים טבעיים חדשים ולקבוע טווחי ריכוז יעילים. מלבד הבדיל בין השפעות bacteriostatic ו bactericidal, זה יכול לשמש בעתיד כחלק מחקרי זיהוי היעד ונחישות MoA. זה יכול להיעשות על ידי השוואת תרמוגרם של מחלקות אנטיביוטיקה שונות לתרמוגרם של תרכובות פעילות חדשות כפי שמוצג כאן. עם זאת, עדיין צריך לחקור אם פרמטרים מסוימים הניתנים לכימות שניתן לחלץ מהנתונים הנמדדים מספיקים להשוואות כאלה או אם יהיה צורך לעבוד על אלגוריתמים המעניקים טביעות אצבעות המבוססות על תרמוגרם מלא. יישום אפשרי נוסף בתחום המחקר האנטיביוטיקה הוא השוואה של wildtype שיבוטים עמידים, יחד עם רצף הגנום כולו, אשר יכול לעזור בהדרת מצב ההתנגדות (MoR) של אנטיבקטריאליים חדשים. בשל האופי הסטטי של השיטה, חקירת היעילות של סוכנים חדשים על היווצרות biofilm או על biofilms כבר הוקמה יכול להוביל להבנה טובה יותר של התהליך הביולוגי ואת ההשפעה של סוכנים נבחרים על חיידקים בשלבים שונים של רדום. IMC רשומות אנרגיה כוללת שוחרר בצורה של חום מה שהופך אותו שיטה מתאימה לחקור גם השפעות תת מעכבות של חומרים פעילים שעשויים להיות יחד עם תעתיק. שיטה זו יכולה לשמש גם בהגדרות קליניות כדי לזהות זיהום של דגימות או לקביעת אנטיביוגרמות עוזר להחליט במהירות על טיפול מוגדר של^{החולים 11}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acinetobacter baumannii	DSMZ	DSM-30008	reference strain used in this study
calPlate	Symcel	1220093	48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener	Symcel	1200001	isothermal microcalorimetry instrument
calView software	Symcel		collection and analysis software
calWell	Symcel	1901004	micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar	Carl Roth	X937.1	isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic
Ciprofloxacin	Sigma-Aldrich	17850	antibiotic
Cuvettes	Brand	759015	1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops	Sarsted	86.1562.050	10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	85190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	10428671
Falcon Tubes	Sarsted	62.554.502	15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL)	Thermo Fisher Scientific	10316380
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Mueller Hinton Broth	Sigma-Aldrich	70192	liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media	Sigma-Aldrich	90922	Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes	LABSOLUTE	7696404
Pipette 100 - 1000 µL	Brand	705880
Pipette 2 - 20 µL	Brand	705872
Pipette 20 - 200 µL	Brand	705878
Pipette tips 100 - 1000 L	Brand	732032
Pipette tips 2 - 200 µL	Brand	732028
Polymyxin B sulfate	Sigma-Aldrich	P0972	antibiotic
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501	antibiotic
Serological pipette	Thermo Fisher Scientific	170356N	10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer	Eppendorf AG	6135 000.017
Sterile filters	Minisart	16534----------K	0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL	NORM-JECT	22778
Tetracycline	Sigma-Aldrich	87128	antibiotic
Titanium cups	Symcel	1220089	inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids	Symcel	1220091	screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim	Sigma-Aldrich	T7883	antibiotic
Tweezers	Symcel	1900602