Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Выяснение способа действия нового антибиотика является сложной задачей в процессе обнаружения наркотиков. Целью метода, описанного здесь, является применение изотермальной микрокалориметрии с использованием calScreener в антибактериальном профилировании для обеспечения дополнительного понимания взаимодействий между наркотиками и микробами.
В связи с глобальной угрозой повышения устойчивости к противомикробным препаратам срочно необходимы новые антибиотики. Мы исследуем натуральные продукты myxobacteria как инновационный источник таких новых соединений. Одним из узких мест в этом процессе, как правило, является выяснение их способа действия. Недавно мы создали изотермальную микрокалориметрию в рамках обычного профилирования трубопровода. Эта технология позволяет исследовать влияние воздействия антибиотиков на общую бактериальную метаболическую реакцию, включая процессы, которые отделены от образования биомассы. Важно отметить, что бактериостатические и бактерицидные эффекты легко различимы без какого-либо вмешательства пользователя во время измерений. Тем не менее, изотермальная микрокалориметрия является довольно новым подходом, и применение этого метода к различным бактериальным видам обычно требует предварительной оценки подходящих условий измерения. Есть некоторые эталонные термограммы, доступные некоторых бактерий, значительно облегчая интерпретацию результатов. Поскольку пул справочных данных неуклонно растет, мы ожидаем, что методология будет иметь все большее влияние в будущем, и ожидаем, что она позволит продать углубленный анализ отпечатков пальцев, позволяющий дифференцировать классы антибиотиков.
Цель этого метода заключается в применении изотермальной микрокалориметрии (IMC) в качестве средней пропускной способности анализа в режиме действия (MOA) профилирования новых антибактериальных соединений. Этот метод раскрывает данные о активности соединений на бактериальных видах и предоставляет информацию о бактерицидной или бактериостатической природе самого соединения.
Рост формирующейся устойчивости к противомикробным препаратам (АМР) является глобальной проблемой, и это приводит к менее эффективному лечению распространенных инфекций с известнымиантибиотиками 1. Однако поиск новых соединений и лекарств, которые могут заменить или работать в сочетании с известными антибиотиками, продолжается, и это построено на различных подходах. Натуральные продукты являются ключевым игроком в текущих кампаниях по обнаружению наркотиков и, в частности, в обнаружении противоинфекционыхпрепаратов 2. Тем не менее, выявление новых свинцовой структуры для разработки антибиотиков является длительным и финансово требовательнымпроцессом 3. Таким образом, первые шаги открытия чрезвычайно важны для того, чтобы фильтровать на самых перспективных эшафотах уже на ранней стадии. Первоначальные шаги в открытии природного продукта наркотиков включают получение структуры соединения, определение активности в пробирке вместе с МОА и целевой идентификации. Большинство успешных соединений, имеющих право на дальнейшее развитие, должны отображать благоприятный спектр деятельности (т.е. активность широкого спектра в случае антибактериальных препаратов) и новый МОА, с помощью которого можно преодолеть уже существующие АМР. Перспективные леса, то, как правило, скрининг в вторичных анализов, которые включают в себя в vivo биодоступности, токсичности и метаболизма4. Помимо финансовых проблем, открытие природного продукта наркотиков сталкивается с дальнейшими проблемами, касающимися затрат и технических трудностей, связанных с сложной изоляцией и очисткой, что, в свою очередь, может сделать его трудным для получения нескольких миллиграммов или даже граммов суммы на ранних стадияхпроцесса открытия 5,6. Поэтому крайне важно в исследованиях натуральных продуктов иметь возможность проводить самый современной первичный скрининг с минимальными составными количествами, чтобы принять обоснованное решение о дальнейших инвестициях, чтобы сделать новый натуральный продукт доступным для доклинического развития. С использованием IMC для антибактериального профилирования, количество необходимых соединений значительно уменьшается по сравнению со стандартными методами. Техника также предоставляет более подробную информацию о взаимодействии новых препаратов с микробным сообществом7.
ММК является устоявшимся методом измерения общей энергии в результате всех биологических, физических и биохимических процессов и реакций в биологической системе. Высвобождение бактериальной энергии пропорционально общей метаболическойреакции 8. В закрытой системе, такой как используемый микрокалориметр, уровень тепла может быть измерен в диапазоне микроватт для изучения метаболическойкинетики бактерий 9,,10,,11,,12. Тепло (энергия), которое высвобождается бактериями, связано с клеточными функциями, которые лежат в основе их метаболизма и которые не обязательно пропорциональны клеточной биомассе.
Первоначально применимость изотермальной калорийности для микробиологических анализов была ограничена из-за низкой пропускной способности и высоких объемов испытаний. Тем не менее, используемый микрокалориметр уникален, поскольку он сочетает в себе преимущества изотермальной калорийиметрии с повышенной пропускной способностью и более низкими требованиями соединения, что делает его ценным инструментом для примененияобнаружения наркотиков 10. Кроме того, прибор предоставляет дополнительные преимущества по сравнению с альтернативными методами измерения кинетики роста бактерий, такими как стандартный метод мутности, который основан на измерении оптической плотности на уровне 600 нм (OD'lt;600). Измерение OD600 основано на предположении, что повышенная оптическая плотность равна росту микробов, тем самым пренебрегая наличием нежизнеспособных клеток. Этот метод также был подвергнут критике, поскольку он исключает небольшие варианты колонии и сохраняемыеклетки 11. В отличие от этого, IMC позволяет в режиме реального времени наблюдения любого типа жизнеспособных клеток. Если клетки находятся в состоянии покоя, они по-прежнему проявляют метаболическую активность, и таким образом они могут быть обнаружены IMC, в то время как такие явления не обнаруживаются стандартным методоммутности 11. Другие преимущества IMC включают более короткое время тестирования на противомикробную восприимчивость, измерение взаимодействия с наркотиками в сложном сообществе и стандартные методы анализа без уничтожения образца7.
Технология IMC была внедрена в широком диапазоне исследований, начиная от микробиологии до термогенезаи биологии рака 13,,14,,15,,16,,17. Микробные применения включают определение минимальных ингибирующие концентрации (MIC) соединений против различных бактериальных штаммов. Было проведено несколько исследований, и был сделан вывод о том, что данные МИЦ из изотермальной калорийиметрии для большинства видов бактерий могут быть получены быстрее и результаты аналогичны другим (стандартным) методам определения MIC12,,18,19. Дальнейшее применение IMC включает наблюдение за взаимодействием препаратов и сочетание медикаментозного лечения со сложными бактериальными сообществами, такими какбиопленки 11. Исследование, сосредоточенное на профилировании МОА, показало, что микрокалориметр может обнаружить разницу в цефалоспоринах первого и второго поколения, в то время как различные антибиотики с тем же МО обладают аналогичной кривой теплового потока по сравнению друг сдругом 18.
Здесь мы описываем использование IMC для moA профилирования новых натуральных продуктов с использованием нового изотермального инструмента микрокалориметрии. Метод используется для определения эффективных концентраций антибиотиков и описания характеристик антибиотиков с точки зрения бактерицидных или бактериостатические механизмы. Этот метод может быть широко внедрен в профилировании соединений МОА и может заменить или, по крайней мере, дополнить стандартные микробиологические методы. Будущие исследования будут включать углубленный анализ отпечатков пальцев, который позволит дифференцировать классы антибиотиков на основе целевых механизмов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура прибора должна быть установлена в соответствии с бактерией, используемой по крайней мере за день до начала для обеспечения стабильности системы. Здесь образцы Acinetobacter baumannii DSM30008 проходят при 30 градусах Цельсия.
1. Подготовка к культуре
2. Пример подготовки
3. Вставьте препарат
4. Вставка погрузки
5. Запуск образцов
6. Снимите пододержатель чашки
7. Анализ данных
Достаточное количество бактерий, производящих тепло, необходимо для прибора для записи теплового сигнала. Если есть задержка во времени, пока тепловой поток обнаруживается это означает, что бактерии еще не производят тепловой сигнал выше предела обнаружения. Поэтому обнаружение высвобождаемого тепла из бактериального образца напрямую связано с повышением бактериальной активности, включая рост бактерий. Бактериальный рост и другие метаболические виды деятельности, как известно, сильно зависит от добавления антибактериального препарата. Чтобы определить, оказывает ли новый натуральный продукт, на который ведется исследование, бактерицидные или бактериостатические эффекты или комбинацию обоих МО, мы выбрали небольшой набор эталонных препаратов и записали термограммы, с которыми мы сравнили данные экспериментов с натуральным продуктом. На основе потенции отдельных антибиотиков был выбран диапазон концентраций, близких к минимальной ингибирующей концентрации (ВПК), определяемой разбавлением микроброта.
Ципрофлоксацин нацелен на бактериальную гиразу ДНК и топоизомеразу IV и, следовательно, он обладает бактерицидным МОА. Тем не менее, бактериальное убийство, вызванное ципрофлоксацином, зависит от концентрации, и когда он досируется при недостаточной концентрации, он также может иметь бактериостатическийэффект 21. Тетрациклин и хлорамфеникол нацелены на рибосому в подразделении 30S и 50S, соответственно, и они действуют бактериостатической из-за ингибированиясинтеза белка 22,23. Рифампицин действует путем ингибирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы и может иметь как бактерицидные, так и бактериостатические эффекты, в зависимости отдозы, используемой 24. Натуральный продукт, который мы расследуем здесь, был выделен из myxobacteria и показал мощную активность против грам-отрицательных и грамположительных бактериальных патогенов. При исследовании его MoA и молекулярной цели, мы были заинтересованы в определении того, новый натуральный продукт оказывает бактерицидные и / или бактериостатические эффекты и являются ли тепловые профили обработанных Acinetobacter baumannii похожи на термограммы от бактерий, которые были обработаны с помощью эталонных препаратов, упомянутых выше.
Термограммы, полученные путем разоблачения A. baumannii DSM-30008 для ципрофлоксацина в серийном разбавлении отображаются на рисунке 1A. Концентрации между 0,005 МКМ и 0,1 МКМ имеют минимальное влияние на рост и метаболизм A. baumannii. Тем не менее, лечение клеток с ципрофлоксацином 0,5 МК приводит к значительному сдвигу в продолжительности фазы задержки и снижении максимального теплового потока. Эти два изменения вместе влияют на время пика(рисунок 1C), который увеличивается примерно на 6 часов. На рисунке 1B,кумулятивное выпущенное тепло построено со временем. Здесь мы видим эффект концентраций, который отражается наклоном склона. Количественная оценка наклона термограммы дает нам максимальную скорость метаболизма A. baumannii в присутствии ципрофлоксацина, как показано на рисунке 1D, где мы можем наблюдать сопутствующие снижение скорости обмена веществ клеток, обработанных 0,5 МК ципрофлоксацин. Изменения скорости обмена веществ клеток, обработанных с более низкими концентрациями, минимальны. Этот эксперимент можно было бы еще больше улучшить за счет добавления промежуточных концентраций, охватывающих диапазон 0,1-1 МКМ, с тем чтобы наблюдать более выраженное постепенное изменение между концентрациями, которые не имеют никакого эффекта, и концентрацией, приводящей к значительной задержке фазы отставания и скорости обмена веществ. Тем не менее, тенденции изменений поддерживают бактерицидный МОА ципрофлоксацина.
Рисунок 1A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 1B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 1C: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 1D: Влияние ципрофлоксацина на рост и обмен веществ A. baumannii DSM-30008. (A)Термограммы, показанные как тепловой поток (ЗВ) по сравнению со временем (h) для дикого типа (WT) A. baumannii DSM-30008, необработаваемые и подвергаемые воздействию ципрофлоксацина. (B)Совокупное тепло (mJ) против времени (h). (C)Время пика (h) с барами ошибок (стандартное отклонение). (D)Скорость метаболизма (ЗВ) с барами ошибок (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
В случае тетрациклина, мы не наблюдали значительных изменений в термограммах для всех концентраций испытания до конца экспоненциальной фазы, начиная после 8 часов (см. рисунок 2A). Тем не менее, основные изменения наблюдаются в стационарном фазовом тепловом излуче, где второй пик теплового потока значительно снижен для A. baumannii, обработанного тетрациклином 5 МКМ и 10 МКМ. Более низкие концентрации имели влияние также, которое было однако более менее pronounced. Этот эффект также вызывает продление во времени до пика, как показано на рисунке 2C. Совокупные выпущенные кривыетепла (рисунок 2B) показывают, что необработаемые и обработанные клетки не отображают значительные различия в общей форме кривой, но по тенденции, наклон кривых снижается при более высоких концентрациях тетрациклина. Это также приводит к количественной скорости метаболизма отображается на рисунке 2D, где концентрациозависимый эффект, (т.е. снижение скорости обмена веществ при увеличении концентрации антибиотиков) наблюдается. Эти выводы подтверждают тот факт, что тетрациклин имеет бактериостатический эффект.
Рисунок 2A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2C: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2D: Влияние тетрациклина на рост и обмен веществ A. baumannii DSM-30008. (A)Термограммы, показанные как тепловой поток (ЗВ) по сравнению со временем (h) для дикого типа (WT) A. baumannii DSM-30008, необработаваемые и подвергаемые воздействию тетрациклина. (B)Совокупное тепло (mJ) против времени (h). (C)Время пика (h) с барами ошибок (стандартное отклонение). (D)Скорость метаболизма (ЗВ) с барами ошибок (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Еще более выраженные эффекты можно наблюдать при лечении A. baumannii с ингибитором синтеза белка хлорамфеникол, который нацелен на 50S рибосомной субъединица. Воздействие возрастающей концентрации хлорамфеникол приводит к продлению фазы отставания и значительным изменениям метаболической активности в стационарной фазе(рисунок 3А и рисунок 3B). Для самой низкой проверенной концентрации не наблюдается никаких изменений в скорости обмена веществ, а выбранная самая высокая испытательная концентрация (50 МКМ) предотвращает выброс большей части энергии образца. Если посмотреть на промежуточные тестовые концентрации (5 МКМ и 10 МКМ), то время пика значительно увеличивается примерно на 8-9 часов(рисунок 3С). В то же время, скорость обмена веществ обработанных клеток значительно снижается, при этом 50 МКМ являются смертельными(рисунок 3D). В целом, изменения, наблюдаемые в концентрациях до 10 МК хлорамфеникол, согласуются с бактериостатический эффект этого класса антибиотиков.
Рисунок 3A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3C: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3D: Влияние хлорамфеникол на A. baumannii DSM-30008 роста и метаболизма. (A) Термограммы показаны как поток тепла (ЗВ) по сравнению со временем (h) для дикого типа (WT) A. baumannii DSM-30008, необработаваемый и подверженный хлорамфениколу. (B)Совокупное тепло (mJ) против времени (h). (C)Время пика (h) с барами ошибок (стандартное отклонение). (D)Скорость метаболизма (ЗВ) с барами ошибок (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Лечение рифампицина в выбранном диапазоне концентрации имеет драматическое влияние на термограммы A. baumannii DSM-30008, связанные с длительностью фазы задержки и влиянием на рост до поздней стационарной фазы(рисунок 4A). Значительное сокращение тепловых выбросов можно увидеть на рисунке 4B, который идет вместе со снижением метаболической активности. Рисунок 4C и рисунок 4D иллюстрируют влияние продления фазы задержки и изменения метаболической активности в стационарной фазе. Рисунок 4C показывает определенное увеличение времени до пика для всех используемых концентраций. Рисунок 4D иллюстрирует снижение скорости обмена веществ, вызванное уменьшением наклона для всех концентраций, которые обычно приписывают бактерицидный эффект. Из-за антибиотиков индуцированных убийство бактериальных клеток, метаболическая активность, как ожидается, будет ниже из-за меньшего числа активных бактерий настоящее время. Собранные данные в соответствии с тем, что рифампицин может действовать бактерицидных и бактериостатические, и данные, представленные здесь поддержки в основном бактерицидные эффекты выбранных концентраций.
Рисунок 4A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4C: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4D: Влияние рифампицина на рост и обмен веществ A. baumannii DSM-30008. (A)Термограммы, показанные как тепловой поток (ЗВ) по сравнению со временем (h) для дикого типа (WT) A. baumannii DSM-30008, необработаваемые и подвергаемые воздействию рифампицина. (B)Совокупное тепло (mJ) против времени (h). (C)Время пика (h) с барами ошибок (стандартное отклонение). (D)Скорость метаболизма (ЗВ) с барами ошибок (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Самая низкая выбранная тестовая концентрация антибиотика природного продукта (0,25 МКМ) не имеет или только незначительное воздействие на термограмму A. baumannii DSM-30008. Тем не менее, другие проверенные концентрации проявляют некоторое влияние на продолжительность фазы задержки и влияют на рост до поздней стационарной фазы(рисунок 5A). Наиболее очевидным эффектом является значительное сокращение тепловых выбросов в стационарной фазе. Данные, отображаемые на рисунке 5B, ясно показывают, что высасытая энергия значительно снижается для всех эффективных концентраций и наклон также снижается. Эти эффекты приводят к уменьшению времени до пика(рисунок 5C) и что более важно, значительное и явно зависит от дозы снижение скорости обмена веществ наблюдается (Рисунок 5D). Исследование нового миксобактериального натурального продукта выявило комбинированный бактериостатический и бактерицидный эффект.
Рисунок 5A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5C: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5D: Влияние нового антибактериального натурального продукта на рост и обмен веществ A. baumannii DSM-30008. (A)Термограммы, показанные как тепловой поток (ЗВ) по сравнению со временем (h) для дикого типа (WT) A. baumannii DSM-30008, необработаваемые и подвергаемые воздействию природного продукта. (B)Совокупное тепло (mJ) против времени (h). (C)Время пика (h) с барами ошибок (стандартное отклонение). (D)Скорость метаболизма (ЗВ) с барами ошибок (стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный рисунок 1: Выбор нового эксперимента в программном интерфейсе. В красном квадрате изображен шаг для выбора нового эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 2: Наименование нового эксперимента в программном интерфейсе. В красном квадрате изображен шаг, чтобы назвать и подтвердить новый эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 3: Начало нового эксперимента в программном интерфейсе. В красном квадрате изображен шаг к началу нового эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 4: Ну выбор и реакция начать в программном интерфейсе. Отбираются все реакционной скважины (колодцы, окрашенные в темно-синий цвет, кнопка Выберите все изображенные в красном квадрате) и выбирается начало реакции (изображено на красном квадрате). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 5: Правильная загрузка подателя для чашки. Выбираются справочные скважины (глубокий синий цвет, красный квадрат) и термограммы отображаются во всплывающем окне. При правильной загрузке мы наблюдаем резкое снижение обнаруженного сигнала тепловых выбросов, который должен достичь фазы плато и оставаться в этой фазе примерно 2-3 мин, после чего сигнал возвращается к исходной точке. При этом наблюдается правильное погрузочные части пододержатель чашки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 6: Конец эксперимента. Красным цветом изображена кнопка Стоп в эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 7: Подтверждение окончания эксперимента. Красным цветом изображена кнопка Да для подтверждения окончания запущенного эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 8: Сохранение файла эксперимента. Отображается всплывающее окно с вариантами сохранения файла, а красным цветом изображена кнопка Сохранить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 9: Интерфейс программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 10: Доступ к сохраненным экспериментам. Красным цветом изображена кнопка Открытый эксперимент по доступу к сохраненным экспериментам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 11: Открытие выбранного файла эксперимента. Красным цветом изображена кнопка Open. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 12: Представление скважин по умолчанию. Все экспериментальные хорошо и соответствующие термограммы видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 13: Выбор скважин для анализа. Красным цветом изображена кнопка Выберите все. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 14: Определение базового уровня. Красным цветом изображена кнопка Определить базовый уровень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный рисунок 15: Выбор базового сигнала. Выбрано не менее 30 минут сигнала в фазе задержки (красная коробка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 16: Сохранение изменений в экспериментальном файле. В красном изображена кнопка Сохранить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 17: веб-приложение для анализа калориметрии. Отображается интерфейс программного обеспечения и путь загрузки файлов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 18: Загрузка выбранного экспериментального файла. Красным цветом изображена кнопка Open. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 19: Анализ термограмм. Метаболические параметры, рассчитанные для каждой экспериментальной колодец, изображены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 20: Установка экспериментальных данных на теоретические модели роста. Данные о тепловом потоке устанавливаются либо на Gompertz, либо на модель роста Ричарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 21: Экспорт измерений. Красным цветом изображены кнопки Скачать меры и сохранить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Изотермальная микрокалориметрия измеряет энергию, выделяемую из образца с течением времени, и этот выброс энергии является результатом всех биологических, физических и (био-) химических процессов. Измеренный тепловой поток может быть использован для оценки или определения антибактериального воздействия веществ, поскольку он позволяет непрерывно контролировать метаболическую активность в режиме реального времени.
Для получения достоверных данных для анализа необходимо определить корректные стартовые единицы формирования колоний (КФУ) индивидуально для каждого используемого вида или штамма. В случае, если количество CFU слишком низко, это приводит к длительной фазе отставания, поскольку система занимает больше времени, чтобы достичь критического количества биомассы, производящей достаточно тепла для обнаружения. В случае, если количество CFU слишком высока, фаза задержки будет очень короткой, а произведенное количество тепла может привести к передаче тепла соседним сенсорным ячейкам (справочным и экспериментальным скважинам) и вызвать искажения термограмм. Большое количество CFU также приведет к более быстрому истощению кислорода и перейти к анаэробных условиях. Следует также учитывать, что в течение первых 30 минут эксперимента, когда система эквилибрирует, сбор данных не представляется возможным, а фактическая запись эффектов задерживается. Кроме того, неправильное определение CFU приводит к ложному определению MIC, в конечном счете, влияющих на эксперимент и изменения,наблюдаемые 25. Другим критическим моментом является правильное определение базовой линии. Как правило, базовый сигнал выбирается во время фазы отставания, когда сигнал теплового потока равна нулю и в идеале, диапазон времени для базового определения составляет 30 мин. Однако это не всегда возможно, так как время, необходимое бактериям для достижения предела обнаружения теплового сигнала, различается между штаммами и видами. Некоторым видам или штаммам требуется более 30 минут, чтобы достичь предела обнаружения теплового сигнала, в то время как другие штаммы или виды достигают его в течение первых 30 минут. В этом случае можно выбрать базовый сигнал в конце эксперимента, когда все тепловые сигналы упали обратно к нулю и остаются стабильными. Кроме того, базовые показатели от других экспериментов с тем же бактериальным штаммом могут быть использованы, который, однако, не рекомендуется.
Система обеспечивает некоторую гибкость в плане проектирования и оптимизации экспериментов и устранения неполадок. Используемые объемы находятся в диапазоне 100-300 йл при использовании пластиковых вставок и 100-600 МКЛ при использовании титановых стаканчиков без пластиковых вставок. Рекомендуемый производителем рабочий объем составляет 120 мл. Использование различных объемов при создании новой экспериментальной серии и при поиске оптимальных условий для измерений оказывает влияние главным образом на два параметра. Используя более низкие объемы, количество требуемого испытательного соединения может быть уменьшено, что особенно важно для соединений, которые доступны только в небольших количествах. Кроме того, используемый объем непосредственно влияет на доступность кислорода во время измерения с более низкими объемами, увеличивая количество доступного кислорода, необходимого для роста бактерий. Истощение кислорода является одним из основных факторов, способствующих максимально возможной продолжительности эксперимента. Важно отметить, что можно использовать твердые средства массовой информации, а не только жидкие средства массовой информации. Это особенно важно для медленно растущих микроорганизмов, так как рост на стыке твердой и газовой фазы обеспечивает лучший доступ к кислороду9.
IMC является полезным аналитическим инструментом для обнаружения неизвестных процессов с приложениями в физике, химии и биологии. Метод измеряет теплообмеся в закрытой системе, а анализ записанного теплообмесяя предоставляет дополнительную информацию, которую не всегда можно получить стандартными методами. В исследованиях микробиологии и антибиотиков, одним из самых больших преимуществ IMC является его способность различать живые, мертвые и упорствующие или спящие клетки, что невозможно с помощью стандартных методовмутности 11. Кроме того, IMC является высокочувствительным и он может обнаружить тепловые выбросы от всего лишь 104-105 клеток 9. Еще одним преимуществом является то, что экспериментальная установка быстро и легко, и это позволяет непрерывное, в режиме реального времени отслеживания с минимальным без вмешательства пользователя. Кроме того, ММК не является деструктивным, что позволяет проводить дальнейший анализ образцов. Анализ данных позволяет отделить образование биомассы до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы и метаболической активности в стационарной фазе.
Помимо новых и интересных функций приложения, упомянутых выше, Есть также недостатки этого метода. Основным ограничением является то, что приборы ММК измеряют общее тепло, производимое и высвобождаемое в рамках конкретной системы, которые также включают неспецифические сигналы. Это подчеркивает важность экспериментального планирования с соответствующими управлениями, чтобы иметь возможность оценить изменения теплового сигнала, которые измеряются путем записитеплового потока 9,20.
В наших руках IMC является важным инструментом для изучения антибактериального воздействия новых натуральных продуктов и определения эффективных диапазонов концентрации. Помимо дифференциации бактериостатических и бактерицидных эффектов, он может быть использован в будущем в рамках целевых исследований идентификации и определения МОА. Это можно сделать, сравнив термограммы различных классов антибиотиков с термограммами новых активных соединений, как показано здесь. Однако еще предстоит иззнать, достаточны ли для таких сопоставлений определенные поддающиеся количественной оценке параметры, которые могут быть извлечены из измеренных данных, или же необходимо будет работать над алгоритмами, дающие отпечатки пальцев на основе полных термограмм. Другим возможным применением в области исследований антибиотиков является сравнение дикого типа с устойчивыми клонами в сочетании с секвенированием всего генома, которое может помочь выяснить режим устойчивости (MOR) новых антибактериальных препаратов. Из-за статического характера метода, исследование эффективности новых агентов либо на биопленку формирования или на уже установленных биопленок может привести к лучшему пониманию биологического процесса и влияние отдельных агентов на микробы на различных стадиях покоя. IMC записывает общую энергию, выпущенную в виде тепла, что делает его подходящим методом для исследования также суб-ингибирующее воздействие активных веществ, которые могут быть соединены с транскриптомикой. Этот метод также может быть использован в клинических условиях для обнаружения загрязнения образцов или для определения антибиограмм, помогающих быстро принять решение о точномлечении пациентов 11.
Проект был выполнен в сотрудничестве с Symcel, разработчиком технологии calScreener. Авторов нечего раскрывать.
Авторы хотели бы поблагодарить команду Symcel за плодотворные дискуссии, и мы хотели бы отметить большую поддержку со стороны Ганны Олийнык и Вильгельма Пауландера. Мы также хотели бы поблагодарить Даниэля Конхойзера за предоставление натурального продукта и Стефани Шмидт за искусную техническую поддержку.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 - 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 - 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 - 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 - 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 - 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534----------K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены