JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

新しい抗生物質の作用様式の解明は、創薬プロセスにおける困難な作業である。ここで説明する方法の目的は、抗菌プロファイリングでcalScreenerを使用した等温マイクロカロリメトリーの適用による薬物と微生物の相互作用に関するさらなる洞察を提供することです。

要約

抗菌性の上昇という世界的な脅威のために、新しい抗生物質が緊急に必要とされています。このような新しい化合物の革新的な供給源として、ミキソバクテリアの天然物を調査します。プロセスのボトルネックの 1 つは、通常、その動作モードの解明です。我々は最近、定期的なプロファイリングパイプラインの一部として等温マイクロカロリメトリーを確立しました。この技術により、バイオマス生成から分離されたプロセスを含む全細菌代謝反応に対する抗生物質暴露の効果を調査することができます。重要なことに、静菌および殺菌効果は、測定中にユーザーの介入なしに容易に区別可能である。しかし、等温マイクロカロリメトリーはかなり新しいアプローチであり、この方法を異なる細菌種に適用するには、通常、適切な測定条件の事前評価が必要です。特定の細菌の参照温度計がいくつかあり、結果の解釈を大幅に促進します。参照データのプールが着実に増加するにつれて、方法論は今後ますます影響を及ぼすと予想し、抗生物質クラスの分化を可能にする詳細な指紋分析を可能にすることを期待しています。

概要

この方法の目的は、新しい抗菌化合物の作用型(MoA)プロファイリングにおいて、中スループットアッセイとして等温マイクロカロリメトリー(IMC)を適用することです。この方法は、細菌種に対する化合物の活性に関するデータを明らかにし、化合物自体の殺菌性または静菌性に関する情報を提供する。

新たな抗菌性(AMR)の台頭は世界的な問題であり、既知の抗生物質1を伴う一般的な感染症の効果的でない治療法につながる。しかし、既知の抗生物質と組み合わせて置き換えたり、働くことができる新しい化合物や薬物の探索が進行中であり、これは多様なアプローチに基づいて構築されています。天然物は、現在の創薬キャンペーンの主要なプレーヤーであり、特に抗感染薬の発見2.しかし、抗生物質開発のための新しいリード構造を特定することは、長く財政的に要求の厳しいプロセス3です。したがって、発見の初期段階は、すでに初期段階で最も有望な足場をフィルタリングするために非常に重要です。天然物創薬の初期段階には、化合物の構造を取得し、MoAおよび標的同定と共にインビトロで活性を決定することを含む。さらなる開発の対象となるほとんどの成功した化合物は、良好な活性スペクトル(すなわち、抗菌薬の場合は広域スペクトル活性)と既存のAMRを克服できる新しいMoAを示すべきである。有望な足場は、通常、生体内の生物学的利用可能性、毒性、および代謝を含む二次アッセイでスクリーニングされる4。経済的な懸念に加えて、天然物創薬は、複合単離と精製に関連するコストと技術的困難に関するさらなる課題に直面しており、これは、発見プロセス55、66の初期段階で複数ミリグラムまたはグラム量を得ることを困難にする可能性がある。したがって、自然産物研究では、臨床前の開発のために新しい天然物をアクセス可能にするために、さらなる投資に関する十分な情報に基づいた意思決定を行うために、最小限の化合物量で最先端の一次スクリーニングを行うことができることは最も重要です。抗菌プロファイリングにIMCを使用すると、標準的な方法と比較して必要な化合物の量が大幅に減少します。この技術はまた、微生物群集7との新薬の相互作用に関するより詳細な情報を提供する。

IMCは、生物学的システムにおける生物学的、物理的、生化学的プロセスおよび反応の結果として、全エネルギーを測定するための確立された方法です。細菌エネルギー放出は、代謝反応全体8に比例する。使用したマイクロカロリメータのような閉系内では、マイクロワット範囲で熱レベルを測定して、細菌99、10、11、1210,11,12の代謝動態を研究することができる。細菌によって放出される熱(エネルギー)は、代謝の根本となる細胞機能に関連しており、必ずしも細胞バイオマスに比例するとは限りません。

当初、微生物学的アッセイに対する等温熱熱量測定の適用性は、その低スループットと高い試験量のために制限されていました。しかし、使用されるマイクロカロリメータは、等温熱熱量測定の利点とスループットの増加と低い化合物要件を兼ね備えているため、ユニークであり、創薬用途10にとって貴重なツールとなる。さらに、この装置は、600nm(OD< 600)における光学密度の測定に基づく標準的な濁度法などの細菌増殖性の運動を測定するための代替方法よりもさらなる利点を提供600する。OD600の測定は、光学密度の増加が微生物増殖と等しいという仮定に基づいて、非生存細胞の存在を無視する。この方法は、小コロニー変異体やパーシスター細胞11を除外するので批判されている。対照的に、IMCはあらゆるタイプの生存細胞をリアルタイムで観察することを可能にする。細胞が休眠状態にある場合、それらはまだ代謝活性を示し、したがってIMCによって検出することができるが、そのような現象は標準的な濁度法11では検出できない。IMCの他の利点は、より短い抗菌感受性検査時間、複雑なコミュニティにおける薬物相互作用およびサンプル7を破壊することなく標準的な分析方法を測定することである。

IMC技術は、微生物学から熱発生、癌生物学,,13、14、15、16、17に至13,14,るまで、幅広い研究に実装されています。151617微生物用途としては、様々な細菌株に対する化合物の最小阻害濃度(MIC)の決定が含まれる。いくつかの研究が行われ、細菌種の大部分に対する等温熱熱量測定からのMICデータをより速く得ることができ、その結果は、MIC決定12、18、19,18,19のための他の(標準)方法と同様であることが結論付けられた。IMCのさらなる応用は、バイオフィルム11のような複雑な細菌群集との薬物治療および薬物治療の組み合わせを観察することを含む。MoAプロファイリングに焦点を当てた研究は、マイクロカロリメーターが第1世代および第2世代のセファロスポリンの違いを検出できることを示したが、同じMoAを有する異なる抗生物質は互いに18と比較して同様の熱流曲線を示す。

ここでは、新しい等温マイクロカロリメトリー装置を用いた新天然物のMoAプロファイリング用IMCの使用について説明する。この方法は、有効な抗生物質濃度を決定し、殺菌または静菌機構の観点から抗生物質の特性を記述するために使用される。この方法は、化合物のMoAプロファイリングで広く実施することができ、標準的な微生物学的方法を置き換えるか、少なくとも補完する可能性があります。今後の研究では、標的メカニズムに基づく抗生物質クラスの分化を可能にする詳細な指紋分析が含まれる。

プロトコル

注:装置温度は、システムの安定性を確保するために、少なくとも1日前に使用される細菌に応じて設定する必要があります。ここで、 アシネトバクターバウマンニ DSM30008サンプルは30°Cで実行される。

1. 文化の準備

  1. CASO寒天プレート上の調査中の株(ここでは A.バウマンニー)を抜き出し、30°Cの静的インキュベーターで一晩インキュベートする。
  2. MHB(ミューラー・ヒントンブロス)に単一コロニーを接種して一晩培養を準備し、30°Cで180rpmで振るインキュベーターでインキュベートする。

2. サンプル準備

  1. 1.5 mLチューブを使用して、選択した薬物または化合物の濃度範囲を調製します(例えば、DMSOに100xストック溶液の1.5 μLを添加することにより、ステップ2.3を参照)。
  2. 一晩培養したMHB培地で希釈します。
    1. 600nmの波長の分光光度計を用いて一晩培養した光学濃度を測定する。
    2. 培養液を希釈し、新鮮なMHB培地で5 x 105コロニー形成単位(CFU)/mLを得る。1つのOD600は、約5 x 108 CFU/mLに等しい(例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌、A.バウマンニ)。
      注:適用された培養条件下で個々の細菌株ごとに変換係数OD600 からCFU/mLを較正することが重要です。
  3. ステップ2.1で調製した試験管に150μLの細胞を加え、試験した薬物または化合物の正しい最終濃度を確保し、最終的な細胞濃度を正しくします。
  4. ボルテックスで化合物を細胞と混合します。
    注: サンプルプレート( 材料表を参照)には6つの行があり、それぞれに8つの井戸、合計48ウェルが含まれています。行 A と行 F は熱力学参照です。したがって、それらのウェルにサンプルをロードすることはできません、対応する媒体はそれらの井戸にロードされます。32のテストサンプルは、行B-Eの井戸を使用して、実行ごとに測定することができます。個々のテスト サンプルは、少なくとも重複して実行する必要があります (ここでは、すべてのサンプルがトリケートとして実行されました)。成長制御を含める必要があります。

3. 挿入準備

  1. ステップ2.4で調製した混合物からプラスチック製のインサートに120 μLを移します。
    注: ステップ 3.1 でリバースピペットを使用して、プラスチック製のインサートの側面に液体が噴霧されるのを防ぎ、正しい信号読み出しに干渉する可能性があります。
  2. すべてのチタンバイアルをピンセットでホルダー( 材料表を参照)に入れる。
  3. ホルダープレートのチタンバイアルに挿入物をそっと移します。
  4. すべてのチタンバイアルにチタン製の蓋をゆるやかに置きます。

4. 挿入ローディング

  1. チタンカップを持つホルダーをサンプルステーションに移し、指定された場所に置きます。
  2. トルクレンチを使用し、40 cNmの力に設定して、すべての蓋を締めます。

5. サンプルの実行

  1. calView ソフトウェアでは、新しい実験を開始します (補足図 1)。
  2. サンプル挿入アームを器具から引き込む。
  3. カップホルダーを「ブリッジ」の上に置き、列8をサンプル挿入開口部に向け、「位置1」でカップホルダーを楽器にそっと押し込みます。システムが安定するまで10分待ちます。実験井戸にラベルを付けます。
  4. カップホルダーが指定された「位置2」になるまでサンプル挿入アームを押します。システムが安定するまで20分待ちます。
  5. サンプル挿入アームを「位置 3」に押し込み、サンプル挿入アームが「実行位置」になるまで引き込みます。ソフトウェア内のすべてのウェルをハイライトし、 反応開始 (補足図4)を選択します。
  6. 熱放射の読み取りが安定してゼロに戻るまで、実験を実行します。
    注: すべてのウェルが、これらの手順で同様の動作をすることを確認してください。 補足図5 は、ウェルが正しくロードされた場合に何を観察すべきかを示しています。正しくロードされない場合は、手順 5.2 ~ 5.4 を繰り返します。

6. カップホルダーを取り外します。

  1. ソフトウェアで、[ 停止 ] (補足図 6)を選択します。ソフトウェアは、"確信している" かどうかを確認し、[ はい ] (補足図 7) を選択し、データ分析用のドライブまたはデスクトップに実験を保存します (補足図 8)。
  2. サンプル挿入アームを器具に完全に挿入し、マグネットを巻き込んでカップホルダーを取り出します。
  3. 蓋を緩め、インサートを取り外し、バイアルと蓋をガラスホルダーに入れ、180°Cで4時間置き、バイアルと蓋をデシケータに入れ、蓋とバイアルが乾燥していることを確認します。

7. データの分析

  1. ソフトウェアを開きます (補足図 9)、左上隅の [実験を開く ]を選択します(補足図10)。ポップアップウィンドウで目的の実験を選択し 、Open (補足図 11)を押します。アプリケーションは、デフォルトのウェルビュー(補足図12)で実験を開きます。
  2. [ すべて選択] または Ctrl + A キーを押します (補助図 13)。
  3. [ベースラインの定義]を押すと、このパラメータは各位置のデータを正規化します (補足図 14)。ポップアップウィンドウでラグフェーズに位置する>30分の期間を選択します(熱流量は0~10μWの間で低くなければなりません。補足図 15)。ベースラインの選択後、選択したベースラインはサーモグラムに緑色で表示されます。[ベースラインセクションの定義]ウィンドウを閉じます。
  4. 保存またはCtrl+S を押してソフトウェアを閉じます (補足図 16)。
  5. オープンウェブベースのシンセル熱量測定分析アプリケーション(https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/)。
  6. ファイルを熱量測定解析アプリケーションにアップロードするには、[参照] (Open補足図 17)を押します。メタボリックパラメータは、Webアプリケーションの32サンプルについて自動的に計算されます(補足図19)。
  7. 熱流量データをゴンペルツやリチャードの成長モデルに合わせるために、 成長関数をクリックします。成長モデル適合は「累積」セクションに表示され、また「フロー」(補足図20)の原データと比較されます。
  8. 計算されたパラメータをすべてダウンロードするには、[ メジャーのダウンロード]を押します。ファイルの場所を選択し、[ 保存] を押します (図 21 を補足します)。ファイルは、さらに計算するためにスプレッドシートにエクスポートされます。

結果

熱を発生させる細菌の十分な数は、機器が熱信号を記録するために必要とされます。熱流が検出可能になるまでの時間の遅延がある場合、細菌はまだ検出限界を超える熱信号を生成していないことを意味します。したがって、細菌サンプルから放出された熱の検出は、細菌の増殖を含む細菌活性の増加に直接関連している。細菌の増殖および他の代謝活性は、抗菌薬の添加によって強く影響されることが知られている。調査中の新しい天然物が殺菌効果や静菌効果を発揮するのか、それとも両方のMoAの組み合わせを発揮するのかを判断するために、我々は少数の参照薬を選択し、実験のデータを天然物と比較したサーモグラムを記録しました。選択した抗生物質の効力に基づいて、微量の希釈によって決定される最小阻害濃度(MIC)に近い範囲の濃度が選択された。

シプロフロキサシンは細菌DNAジャイラーゼおよびトポイソメラーゼIVを標的とし、その結果、殺菌性MoAを示す。しかし、シプロフロキサシンによって誘導される細菌の殺滅は濃度依存性であり、不十分な濃度でのドーズ時には静菌効果21を有することもできる。テトラサイクリンとクロラムフェニコールは、それぞれ30S及び50Sサブユニットでリボソームを標的とし、タンパク質合成22,23,23の阻害による静菌作用を行う。リバンピシンは、DNA依存性RNAポリメラーゼを阻害することによって作用し、かつ、それが両方を有することができる、殺菌および静菌効果、使用する用量に応じて24。ここで調べている天然物は、菌菌から分離され、グラム陰性菌およびグラム陽性細菌病原体に対して強力な活性を示した。MoAと分子標的を調査する際に、新しい天然物が殺菌および/または静菌効果を発揮するかどうか、および処理されたアシネトバクターバウマンニの熱プロファイルが上記の参照薬で処理された細菌の熱グラムに似ているかどうかを判断することに興味を持ちました。

A.バウマンニDSM-30008を連続希釈中のシプロフロキサシンにさらしたサーグラムを図1Aに示す。0.005 μM ~0.1 μM の濃度は、A. バウマンニの成長と代謝に対する影響を最小限に抑えます。しかし、0.5 μM シプロフロキサシンで細胞を処理すると、ラグフェーズ持続時間が著しい変化し、最大熱流量が減少します。これら2つの変化は、ピークまでの時間(図1C)に影響を及ぼし、約6時間増加します。図1Bでは、累積放出熱が時間に対してプロットされています。ここでは、傾斜傾斜によって反射される濃度の影響を確認します。サーモグラムの傾斜の定量化は、図1Dに示すように、シプロフロキサシンの存在下でA.バウマンニの最大代謝率を与え、0.5μMシプロフロキサシンで処理された細胞の代謝率の付随的な減少を観察することができます。低濃度で処理された細胞の代謝率の変化は最小限である。この実験は、0.1~1μMの範囲をカバーする中間濃度を加えて、効果のない濃度と、ラグ相と代謝率の著しい遅延をもたらす濃度との間のより顕著な緩やかな変化を観察することによってさらに改善することができる。しかし、変化の傾向は、シプロフロキサシンの殺菌性MoAを支持する。

figure-results-1738
図 1A: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2023
図 1B: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2308
図 1C: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2595
図1D: A. バウマンニDSM-30008の成長と代謝に対するシプロフロキサシンの効果(A)熱流(μW)と時間(h)として示された熱グラム(wt)A.バウマンニDSM-30008、非処理およびシプロフロキサシンにさらされた。(B) 累積熱 (mJ) と時間 (h) の対数。(C) 誤差範囲 (標準偏差) を含むピークまでの時間 (h)。(D) エラーバー(標準偏差)を有する代謝率(μW)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

テトラサイクリンの場合、8時間後から始まる後期指数位相まで試験されたすべての濃度に対して、サーモグラムの有意な変化は観察されなかった( 図2Aを参照)。それでも、5 μM および 10 μM テトラサイクリンで処理された A. バウマンニ に対して熱流の第 2 ピークが著しく低下する定常相熱放射では大きな変化が観察されます。低濃度も効果があり、しかしそれほど顕著ではなかった。この効果はまた、 図2Cに示すようにピークに時間の延長を引き起こします。累積放出熱曲線(図2B)は、非処理および処理された細胞が全体的な曲線形状に有意な差を示さないことを示しているが、傾向により、曲線の傾きはテトラサイクリンの高濃度で低下する。これはまた、濃度依存効果(すなわち、抗生物質濃度の増加における代謝率の低下)が観察される 図2Dに表示される定量化代謝率に変換される。これらの知見は、テトラサイクリンが静菌効果を有するという事実を裏付けている。

figure-results-3749
図 2A: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4034
図2B:この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4317
図 2C: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4604
図2D:テトラサイクリンがA.バウマンニDSM-30008の成長と代謝に及ぼす影響(A)熱流(μW)と時間(h)として示された熱グラム(wt)A.バウマンニDSM-30008、非処理およびテトラサイクリンにさらされる。(B) 累積熱 (mJ) と時間 (h) の対数。(C) 誤差範囲 (標準偏差) を含むピークまでの時間 (h)。(D) エラーバー(標準偏差)を有する代謝率(μW)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

さらに顕著な効果は、50Sリボソームサブユニットを標的とするタンパク質合成阻害剤クロラムフェニコールで A.バウマンニイ を治療する際に観察することができる。クロラムフェニコールの濃度の上昇への暴露は、遅れ相の延長および静止期における代謝活性の有意な変化をもたらす(図3A および 図3B)。最も低い試験濃度に対して代謝率の変化は認められず、選択された最も高い試験濃度(50 μM)はサンプルのほとんどのエネルギー放出を防ぐ。中間試験濃度(5μMおよび10μM)を見ると、ピークまでの時間は約8〜9時間大幅に増加します(図3C)。同時に、処理された細胞の代謝速度は有意に低下し、50μMは致死的である(図3D)。全体として、10 μMクロラムフェニコールまでの濃度で観察された変化は、この抗生物質クラスの静菌効果と一致する。

figure-results-5700
図 3A: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5985
図 3B: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6270
図 3C: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6557
図3D: A.バウマンニDSM-30008の成長と代謝に対するクロラムフェニコールの効果(A)熱流(μW)と時間(h)として示された熱グラム(wt)A.バウマンニDSM-30008、非処理およびクロラムフェニコールにさらされた。(B) 累積熱 (mJ) と時間 (h) の対数。(C) 誤差範囲 (標準偏差) を含むピークまでの時間 (h)。(D) エラーバー(標準偏差)を有する代謝率(μW)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

選択した濃度範囲におけるリバンピシン処理は、遅位相持続時間および遅い定常期までの成長に及ぼす影響に関連する A.バウマンニ DSM-30008のサーモグラムに劇的な影響を及ぼす(図4A)。代謝活性の低下に伴って行く熱放出の有意な減少が 図4B に見られる。 図4C および 図4D は、遅れ相の延長と静止期における代謝活性の変化の影響を示す。 図4C は、使用されるすべての濃度についてピークまでの時間の明確な増加を示す。 図4D は、通常殺菌効果に起因するすべての濃度に対する傾斜の低下によって引き起こされる代謝率の低下を示す。抗生物質による細菌細胞の殺滅により、活性菌の数が少ないため代謝活性が低下すると予想される。収集されたデータは、リバンピシンが殺菌および静菌を作用することができるという事実と一致しており、ここで提示されたデータは、主に選択された濃度の殺菌効果をサポートしています。

figure-results-7752
図 4A: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8037
図 4B: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8322
図 4C: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8609
図4D: A.バウマンニDSM-30008の成長と代謝に対するリファミシンの効果(A)熱流(μW)と時間(h)として示された熱グラム(wt)A.バウマンニDSM-30008、非処理およびリフィンピシンにさらされた。(B) 累積熱 (mJ) と時間 (h) の対数。(C) 誤差範囲 (標準偏差) を含むピークまでの時間 (h)。(D) エラーバー(標準偏差)を有する代謝率(μW)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

天然物抗生物質(0.25 μM)の最も低い選択された試験濃度は 、A.バウマンニ DSM-30008のサーモグラムに対して、まったくまたは唯一の限界効果を有しない。しかし、他の試験濃度はラグフェーズ持続時間に何らかの影響を及ぼし、遅い定常期まで成長に影響を及ぼす(図5A)。最も明白な効果は、定常相における熱放出の大幅な減少である。 図5B に示すデータは、放出されたエネルギーが有効な濃度で有意に減少し、斜面も同様に減少していることを明確に示している。これらの効果はピーク時の減少(図5C)に変換され、さらに重要なことに、代謝速度の有意かつ明らかに用量依存的な減少が観察される(図5D)。新しい菌酸菌天然物の調査は、静菌と殺菌効果を組み合わせた明らかにした。

figure-results-9671
図 5A: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-9956
図 5B: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-10241
図 5C: この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-10528
図5D:新しい抗菌天然物がA.バウマンニDSM-30008の成長と代謝に及ぼす影響(A)熱流(μW)と時間(h)として示された熱グラム(wt)A.バウマンニDSM-30008、非処理され、天然物にさらされる。(B) 累積熱 (mJ) と時間 (h) の対数。(C) 誤差範囲 (標準偏差) を含むピークまでの時間 (h)。(D) エラーバー(標準偏差)を有する代謝率(μW)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1: ソフトウェア・インターフェースでの新規実験の選択 赤い四角形では、新しい実験を選択するステップが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 2: ソフトウェア・インターフェースでの新しい実験の命名 赤い正方形では、名前を付け、新しい実験が描かれている確認のステップ。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 3: ソフトウェア・インターフェースでの新規実験の開始 赤い四角形では、新しい実験を開始するステップが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図4:ソフトウェアインターフェースでの選択と反応開始。 すべての反応ウェルが選択され(深い青色で色付きのウェル、ボタン赤い四角で描かれた すべてを選択 )、反応開始が選択されます(赤い四角形で示されています)。 こちらをダウンロードしてください。

補足図5:カップホルダーの正しいローディング。 参照ウェル(濃い青色、赤い四角)が選択され、サーモグラムがポップアップウィンドウに表示されます。負荷が正しく行われると、検出された熱放射信号の急激な低下が観察され、高原相に到達し、約2〜3分間この段階にとどまり、その後、信号は出発点に戻ります。これが観察されると、カップホルダーの荷重は正しい。 こちらをダウンロードしてください。

補足図6:実験終了 赤で、実験の 停止 ボタンが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図7:実験終了の確認 赤で、実験の実行終了を確認する[ はい ]ボタンが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

図 8: 実験ファイルの保存 保存ファイルオプションを含むポップアップウィンドウが表示され、赤で 保存 ボタンが表示されます。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 9: ソフトウェア・インターフェースこちらをダウンロードしてください。

図 10:保存された実験へのアクセス 赤で保存された実験にアクセスするための ボタンを開く 実験が描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図11:選択した実験ファイルを開く。 赤で 開く ボタンが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 12: デフォルトのウェルビュー すべての実験井戸と対応するサーモグラムが見えます。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 13: 分析用の井戸の選択赤でボタン すべて選択 が描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 14: ベースラインの定義 赤で[ ベースラインを定義] ボタンが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 15: ベースライン信号の選択 ラグフェーズでの最小30分の信号が選択されます(赤色のボックス)。 こちらをダウンロードしてください。

図 16: 実験ファイルへの変更の保存 赤でボタン 保存 が描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図17:Webベースの熱量測定解析アプリケーション。 オンラインソフトウェアインターフェースとファイルアップロード経路が表示されます。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 18: 選択した実験ファイルのアップロード 赤で 開く ボタンが描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図19:サーモグラムの分析。 実験井戸ごとに計算された代謝パラメータは赤で描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

補足図20:実験データを理論成長モデルに適合する。 熱流量データは、ゴンペルツまたはリチャードの成長モデルに適合します。 こちらをダウンロードしてください。

補足図 21: 測定値のエクスポート 赤でボタンの ダウンロードメジャー と 保存 が描かれています。 こちらをダウンロードしてください。

ディスカッション

等熱マイクロカロリメトリーは、時間の経過とともに標本から放出されるエネルギーを測定し、このエネルギー放出は、すべての生物学的、物理的および(バイオ)化学的プロセスの結果である。測定された熱流量は、代謝活性の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にする物質の抗菌効果を評価または決定するために利用することができる。

分析のための信頼できるデータを得るためには、使用される種または株ごとに正しい開始コロニー形成単位(CFU)を個別に決定する必要があります。CFU数が低すぎると、システムが検出するのに十分な熱を生成する重要な量のバイオマスに達するまでに時間がかかるため、遅延フェーズが長くなります。CFUの数が高すぎると、ラグ相が非常に短くなり、生成される熱量が隣接するセンサーセル(基準および実験井戸)への熱伝達を引き起こし、サーモグラムの歪みを引き起こす可能性があります。CFUの数が多いと、酸素の枯渇が速くなり、嫌気性条件に切り替わります。また、実験の最初の30分間、システムが平衡状態にある場合、データ収集が不可能であり、実際の効果の記録が遅れることを考慮する必要があります。また、誤ったCFU判定は誤ったMIC決定につながり、最終的には実験と観察された変化に影響を与える25.もう 1 つの重要なポイントは、ベースラインの正しい決定です。通常、ベースライン信号は、熱流信号がゼロのラグフェーズ中に選択され、ベースライン定義の時間範囲は30分です。しかし、これは、細菌が熱信号検出限界に達するために必要な時間が株と種によって異なるように常に可能であるとは限りません。いくつかの種または株は、他の株または種が最初の30分以内に到達しながら、熱信号検出限界に達するために30分以上を必要とします。その場合、全ての熱信号がゼロに戻って安定した状態で、実験終了時にベースライン信号を選択することができる。あるいは、同じ細菌株を有する他の実験からのベースラインを使用することができるが、これは推奨されない。

システムは実験およびトラブルシューティングの設計および最適化の点でいくらかの柔軟性を可能にする。使用される容積はプラスチックの挿入物を使用するとき100-300 μLおよびプラスチックの挿入なしでチタニウムのコップを使用するとき100-600 μLの範囲である。メーカーが推奨する作業量は120μLです。新しい実験シリーズをセットアップする場合、また測定に最適な条件を見つけると、異なるボリュームを使用すると、主に2つのパラメータに影響を与えます。少量を使用することで、必要な試験化合物の量を減らすことができるので、少量でしか入手できない化合物にとって特に重要です。さらに、使用された容積は、測定中の酸素の供給に直接影響を与え、低い容積は細菌の成長に必要な酸素の量を増加させる。酸素の枯渇は、実験の最大可能な期間に寄与する主な要因の一つです。重要なのは、液体培地だけでなく、固体媒体を用いることが可能である。固体相と気相の界面での成長により酸素アクセスが改善される9が可能となるため、これは成長の遅い微生物にとって特に重要である。

IMCは、物理学、化学、生物学のアプリケーションで未知のプロセスを発見するのに便利な分析ツールです。この方法は、閉じたシステム内の熱交換を測定し、記録された熱交換の分析は、常に標準的な方法では得られない追加情報を提供します。微生物学および抗生物質研究において、IMCの最大の利点の1つは、標準的な濁り法11を使用して不可能である生細胞、死んだ細胞およびパーシスターまたは休眠細胞を区別する能力である。さらに、IMCは感度が高く、わずか10個から10個の4-10セル9から熱放射を検出できる。もう1つの利点は、実験のセットアップが迅速かつ簡単であり、ユーザーの干渉を最小限に抑え、リアルタイムで連続的な追跡を可能にすることです。さらに、IMCは非破壊であり、サンプルのさらなる分析を可能にする。データ解析により、後期指数または初定常相までバイオマス形成の分離と、静止期における代謝活性を可能にします。

上記の斬新でエキサイティングなアプリケーション機能のほかに、この方法には欠点もあります。主な制限は、IMC機器が特定のシステム内で発生し放出される総熱を測定する点です。これは、熱流量9,20を記録することによって測定される熱信号の変化を評価することができる適切な制御を用いた実験計画の重要性を強調する。

私たちの手の中で、IMCは新しい天然物の抗菌効果を研究し、有効な濃度範囲を決定するための重要なツールです。静菌および殺菌効果の区別とは別に、将来的には標的識別研究およびMoA決定の一環として使用される可能性がある。これは、異なる抗生物質クラスのサーモグラムを、ここに表示される新しい活性化合物のサーモグラムと比較することによって行うことができます。しかし、測定されたデータから抽出できる特定の定量化可能なパラメータがそのような比較に十分であるかどうか、または完全なサーモグラムに基づいて指紋を与えるアルゴリズムに取り組む必要があるかどうかはまだ調査する必要があります。抗生物質研究の分野でもう一つの可能な応用は、野生型と耐性クローンの比較であり、全ゲノムシーケンシングと相まって、新しい抗菌薬の抵抗モード(MoR)を解明するのに役立つ。この方法の静的な性質のために、バイオフィルム形成または既に確立されたバイオフィルムに対する新しい薬剤の有効性の調査は、生物学的プロセスのより良い理解と休眠の異なる段階の微生物に対する選択された薬剤の効果につながる可能性があります。IMCは、熱の形で放出される総エネルギーを記録し、転写学に結合される可能性のある活性物質の亜阻害効果も調査するのに適した方法です。この方法はまた、臨床現場で、サンプルの汚染を検出したり、患者11の明確な治療を迅速に決定するのに役立つ抗バイオグラムの決定に使用することができる。

開示事項

このプロジェクトは、calScreener技術の開発者であるSymcelと共同で行われました。著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者たちは、Symcelのチームの実りある議論に感謝したいと思い、ガンナ・オリイニクとヴィルヘルム・ポーランダーの大きな支援を認めたいと思います。また、ダニエル・クンホイザーが天然製品を提供し、ステファニー・シュミットが巧みな技術サポートをしてくれたことに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acinetobacter baumannii DSMZDSM-30008reference strain used in this study
calPlateSymcel122009348-well plate for titanium cups to be inserted
calScreenerSymcel1200001isothermal microcalorimetry instrument
calView softwareSymcelcollection and analysis software
calWellSymcel1901004micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agarCarl RothX937.1isolation and cultivation of microorganisms
ChloroamphenicolSigma-AldrichC0378antibiotic
CiprofloxacinSigma-Aldrich17850antibiotic
CuvettesBrand7590151.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loopsSarsted86.1562.05010 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO)Thermo Fisher Scientific85190
Eppendorf tubesEppendorf301200861.5 mL eppendorf safe-lock tubes
EthanolThermo Fisher Scientific10428671
Falcon TubesSarsted62.554.50215 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL)Thermo Fisher Scientific10316380
MethanolThermo Fisher ScientificA412-500
Mueller Hinton BrothSigma-Aldrich70192liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted mediaSigma-Aldrich90922Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishesLABSOLUTE7696404
Pipette 100 - 1000 µLBrand705880
Pipette 2 - 20 µLBrand705872
Pipette 20 - 200 µLBrand705878
Pipette tips 100 - 1000 LBrand732032
Pipette tips 2 - 200 µLBrand732028
Polymyxin B sulfateSigma-AldrichP0972antibiotic
RifampicinSigma-AldrichR3501antibiotic
Serological pipetteThermo Fisher Scientific170356N10 mL Nunc serological pipette
SpectrophotometerEppendorf AG6135 000.017
Sterile filtersMinisart16534----------K0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mLNORM-JECT22778
TetracyclineSigma-Aldrich87128antibiotic
Titanium cupsSymcel1220089inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lidsSymcel1220091screwed and tightend to the titanium cups
TrimethroprimSigma-AldrichT7883antibiotic
TweezersSymcel1900602

参考文献

  1. Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018)
  2. Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
  3. Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  4. Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
  5. Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).
  6. Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
  7. Antimicrobial Development. Symcel Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019)
  8. Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
  9. Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
  10. Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
  11. Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
  12. Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
  13. Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
  14. Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
  15. Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
  16. Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  17. Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
  18. von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
  19. Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
  20. Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
  21. LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
  22. Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
  23. Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
  24. Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).
  25. Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

164

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved