Metabolische Profilerstellung zur Bestimmung bakterizider oder bakteridarischer Wirkungen neuer Naturprodukte mit isothermen Mikrokalorimetrie

Zusammenfassung

Die Aufklärung der Wirkungsweise eines neuartigen Antibiotikums ist eine herausfordernde Aufgabe im Prozess der Arzneimittelentdeckung. Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist die Anwendung der isothermen Mikrokalorimetrie mit calScreener in antibakteriellem Profiling, um zusätzliche Einblicke in Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Mikroben zu geben.

Zusammenfassung

Aufgrund der globalen Bedrohung durch steigende Antibiotikaresistenzen werden neue Antibiotika dringend benötigt. Wir untersuchen natürliche Produkte aus Myxobacteria als innovative Quelle solcher neuen Verbindungen. Ein Engpass im Prozess ist in der Regel die Aufklärung ihrer Wirkungsweise. Kürzlich haben wir die isotherme Mikrokalorimetrie als Teil einer routinemäßigen Profiling-Pipeline etabliert. Diese Technologie ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Antibiotika-Exposition auf die gesamte bakterielle Stoffwechselreaktion, einschließlich Von der Biomassebildung entkoppelter Prozesse. Wichtig ist, dass bakteriostatische und bakterizide Wirkungen ohne Benutzereingriffe während der Messungen leicht zu unterscheiden sind. Die isotherme Mikrokalorimetrie ist jedoch ein ziemlich neuer Ansatz, und die Anwendung dieser Methode auf verschiedene Bakterienarten erfordert in der Regel eine Vorbewertung geeigneter Messbedingungen. Es gibt einige Referenz-Thermogramme von bestimmten Bakterien, die die Interpretation der Ergebnisse erheblich erleichtern. Da der Pool an Referenzdaten stetig wächst, erwarten wir, dass die Methodik in Zukunft eine zunehmende Wirkung haben wird, und erwarten, dass sie eingehende Fingerabdruckanalysen ermöglicht, die eine Differenzierung der Antibiotikaklassen ermöglichen.

Einleitung

Ziel dieser Methode ist es, die isotherme Mikrokalorimetrie (IMC) als Mitteldurchsatz-Assay bei der Wirkungsart(MoA)-Profilierung neuer antibakterieller Verbindungen anzuwenden. Diese Methode zeigt Daten über die Aktivität von Verbindungen auf bakteriellen Arten und liefert Informationen über die bakterizide oder bakteriostatische Natur der Verbindung selbst.

Der Anstieg der aufkommenden antimikrobiellen Resistenz (AMR) ist ein globales Problem und führt zu weniger wirksamen Behandlungen von häufigen Infektionen mit bekannten Antibiotika¹. Die Suche nach neuen Verbindungen und Medikamenten, die ersetzen oder in Kombination mit bekannten Antibiotika arbeiten können, ist jedoch im Gange und baut auf verschiedenen Ansätzen auf. Natürliche Produkte sind ein wichtiger Akteur in aktuellen Drogen-Entdeckungskampagnen und vor allem bei der Entdeckung von Anti-Infektions-Medikamenten². Die Identifizierung neuer Bleistrukturen für die Entwicklung von Antibiotika ist jedoch ein langwieriger und finanziell anspruchsvoller Prozess³. Daher sind die frühen Entdeckungsschritte extrem wichtig, um schon frühzeitig auf die vielversprechendsten Gerüste zu filtern. Erste Schritte bei der Entdeckung von Arzneimitteln für Natürliche produkte umfassen die Erlangung der Struktur einer Verbindung, die Bestimmung der Aktivität in vitro zusammen mit MoA und Zielidentifikation. Die erfolgreichsten Verbindungen, die für die Weiterentwicklung in Frage kommen, sollten ein günstiges Aktivitätsspektrum aufweisen (d. h. breitspektrumige Aktivität bei Antibakterien) und ein neuartiges MoA aufweisen, mit dem bereits bestehende AMR überwunden werden können. Vielversprechende Gerüste werden dann in der Regel in sekundären Assays gescreent, die In-vivo-Bioverfügbarkeit, Toxizität und Stoffwechsel umfassen⁴. Neben den finanziellen Bedenken steht die Entdeckung von Arzneimitteln für Naturprodukte vor weiteren Herausforderungen in Bezug auf die Kosten und technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Isolierung und Reinigung von Verbindungen, die es wiederum schwierig machen können, in den frühen Stadien des Entdeckungsprozesses mehrere Milligramm oder sogar Grammmengen zu erhalten^5,6. Daher ist es in der Naturproduktforschung von größter Bedeutung, in der Lage zu sein, modernste sittliche Primärscreenings mit minimalen ZusammengesetztenMengen durchzuführen, um eine fundierte Entscheidung über weitere Investitionen zu treffen, um ein neuartiges Naturprodukt für die präklinische Entwicklung zugänglich zu machen. Mit der Verwendung von IMC für antibakterielle Profilierung wird die benötigte Menge an Verbindung im Vergleich zu Standardmethoden deutlich reduziert. Die Technik bietet auch tiefergehende Informationen über die Wechselwirkung neuer Medikamente mit der mikrobiellen Gemeinschaft⁷.

IMC ist eine etablierte Methode zur Messung der Gesamtenergie als Ergebnis aller biologischen, physikalischen und biochemischen Prozesse und Reaktionen in einem biologischen System. Die bakterielle Energiefreisetzung ist proportional zu den gesamten Stoffwechselreaktionen⁸. Innerhalb eines geschlossenen Systems, wie dem verwendeten Mikrokalorimeter, können die Wärmeniveaus im Mikrowattbereich gemessen werden, um die metabolische Kinetik von Bakterien^9,10,11,12zu untersuchen. Die Wärme (Energie), die von Bakterien freigesetzt wird, ist mit zellulären Funktionen verbunden, die ihrem Stoffwechsel zugrunde liegen und die nicht unbedingt proportional zur zellulären Biomasse sind.

Anfangs war die Anwendbarkeit der isothermen Kalorimetrie für mikrobiologische Assays aufgrund des geringen Durchsatzes und der hohen Testvolumina begrenzt. Das verwendete Mikrokalorimeter ist jedoch einzigartig, da es die Vorteile der isothermen Kalorimetrie mit erhöhtem Durchsatz und geringeren Zusammengesetzten Anforderungen kombiniert, was es zu einem wertvollen Werkzeug für Anwendungen zur Arzneimittelentdeckung macht¹⁰. Darüber hinaus bietet das Instrument weitere Vorteile gegenüber alternativen Methoden zur Messung der bakteriellen Wachstumskinetik, wie z.B. der Standard-Trübungsmethode, die auf der Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD<₆₀₀₎basiert. Die Messung von OD₆₀₀ basiert auf der Annahme, dass eine erhöhte optische Dichte dem mikrobiellen Wachstum gleichkommt, wodurch das Vorhandensein nicht lebensfähiger Zellen vernachlässigt wird. Diese Methode wurde auch kritisiert, da sie kleine Kolonievarianten und Persistenzzellen¹¹ausschließt. Im Gegensatz dazu ermöglicht IMC die Echtzeitbeobachtung jeder Art von lebensfähigen Zellen. Wenn Zellen ruhen, weisen sie immer noch metabolische Aktivität auf und können daher von IMC erkannt werden, während solche Phänomene mit der Standard-Trübungsmethode¹¹nicht nachweisbar sind. Weitere Vorteile von IMC sind eine kürzere antimikrobielle Anfälligkeitstestzeit, die Messung von Arzneimittelwechselwirkungen in einer komplexen Gemeinschaft und Standardanalysemethoden, ohne die Probe zu zerstören⁷.

Die IMC-Technologie wurde in einer breiten Palette von Studien implementiert, von Mikrobiologie bis Thermogenese und Krebsbiologie^{13,14,15,16,17}. Die mikrobiellen Anwendungen umfassen die Bestimmung von minimalen hemmenden Konzentrationen (MIC) von Verbindungen gegen verschiedene Bakterienstämme. Mehrere Studien wurden durchgeführt, und es wurde der Schluss gezogen, dass MIC-Daten aus der isothermen Kalorimetrie für die Meisten Bakterienarten schneller gewonnen werden können und die Ergebnisse im Vergleich zu anderen (Standard-)Methoden für die MIC-Bestimmung^12,18,19vergleichbar sind. Weitere Anwendungen von IMC sind die Beobachtung der Wechselwirkung von Medikamenten und die Kombination von medikamentösen Behandlungen mit komplexen bakteriellen Gemeinschaften wie Biofilme¹¹. Eine Studie, die sich auf MoA-Profilierung konzentrierte, zeigte, dass das Mikrokalorimeter einen Unterschied in Cephalosporinen der ersten und zweiten Generation erkennen kann, während verschiedene Antibiotika mit dem gleichen MoA eine ähnliche Wärmeflusskurve aufweisen wie die anderen¹⁸.

Hier beschreiben wir die Verwendung von IMC für die MoA-Profilierung neuer Naturprodukte mit dem neuen isothermen Mikrokalorimetrie-Instrument. Die Methode wird verwendet, um wirksame Antibiotikakonzentrationen zu bestimmen und die Eigenschaften von Antibiotika in Bezug auf bakterizide oder bakteriostatische Mechanismen zu beschreiben. Die Methode kann weitgehend in MoA-Profilierung von Verbindungen implementiert werden und könnte Standard mikrobiologische Methoden ersetzen oder zumindest ergänzen. Zukünftige Studien werden eingehende Fingerabdruckanalysen umfassen, die eine Differenzierung von Antibiotikaklassen auf der Grundlage von Zielmechanismen ermöglichen.

Protokoll

HINWEIS: Die Gerätetemperatur muss gemäß dem Bakterium eingestellt werden, das mindestens einen Tag im Voraus verwendet wird, um die Stabilität des Systems zu gewährleisten. Hier werden Acinetobacter baumannii DSM30008 Proben bei 30 °C ausgeführt.

1. Kulturvorbereitung

1. Streichen Sie den untersuchten Stamm (hier: A. baumannii) auf einer CASO-Agarplatte aus und inkubieren Sie über Nacht in einem statischen Inkubator bei 30 °C.
2. Bereiten Sie eine Nachtkultur vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in MHB (Mueller-Hinton-Brühe) impfen und auf einem Schüttelinkubator bei 180 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C brüten.

2. Probenvorbereitung

1. Verwenden Sie 1,5 ml-Rohre, um den Konzentrationsbereich ausgewählter Arzneimittel oder Verbindungen vorzubereiten (z. B. durch Zugabe von 1,5 l 100-fachen Stofflösungen in DMSO; siehe Schritt 2.3).
2. Verwässern Sie die Übernachtungskultur im MHB-Medium.
   1. Messen Sie die optische Dichte der Nachtkultur mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm.
   2. Verdünnen Sie die Kultur, um 5 x 10⁵ koloniebildende Einheiten (CFU)/ml in frischem MHB-Medium zu erhalten. Eine OD₆₀₀ von einem entspricht etwa 5 x 10⁸ KBE/ml (z.B. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      HINWEIS: Es ist wichtig, den Umrechnungsfaktor OD₆₀₀ in CFU/mL für jeden einzelnen Bakterienstamm unter den angewandten Kultivierungsbedingungen zu kalibrieren.
3. Fügen Sie 150 l der Zellen in die in Schritt 2.1 hergestellten Reagenzgläser ein, um eine korrekte Endkonzentration des getesteten Arzneimittels oder der getesteten Verbindung und eine korrekte endgültige Zellkonzentration zu gewährleisten.
4. Mischen Sie die Verbindung mit den Zellen durch Wirbeln.
   ANMERKUNG: Die Probenplatte (siehe Materialtabelle)hat sechs Reihen mit jeweils acht Brunnen, insgesamt 48 Brunnen; Zeile A und Zeile F sind die thermodynamische Referenz. Daher können keine Proben in diese Brunnen geladen werden, entsprechende Medien werden in diese Brunnen geladen. 32 Testproben können pro Durchlauf mit Bohrungen in den Zeilen B-E gemessen werden. Einzelne Testproben sollten mindestens in doppelter Ausführung ausgeführt werden (hier: alle Proben wurden als Triplicate ausgeführt). Wachstumskontrollen sollten einbezogen werden.

3. Präparation einfügen

1. 120 l aus dem in Schritt 2.4 hergestellten Gemisch auf die Kunststoffeinsätze übertragen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Umgekehrte Pipettierung in Schritt 3.1, um zu verhindern, dass Flüssigkeit auf die Seiten der Kunststoffeinsätze sprüht, was zu Störungen bei korrekten Signalauslesungen führen kann.
2. Legen Sie alle Titanfläschchen mit einer Pinzette in die Halterungen (siehe Materialtabelle).
3. Tragen Sie die Einsätze vorsichtig in die Titanfläschchen in der Halterplatte.
4. Legen Sie Titandeckel lose auf alle Titan-Fläschchen.

4. Einstecken des Ladens

1. Übertragen Sie den Halter mit Titanbechern auf die Probenstation und legen Sie sie auf einen ausgewiesenen Bereich.
2. Verwenden Sie den Auf 40 cNm Kraft eingestellten Drehmomentschlüssel, um alle Deckel festzuziehen.

5. Ausführen von Proben

1. Starten Sie in der calView-Software ein neues Experiment (ergänzende Abbildung 1).
2. Ziehen Sie den Probeneinsteckarm vom Instrument ein.
3. Stellen Sie den Becherhalter auf die "Brücke", Spalte 8 zur Probeneinlageöffnung und drücken Sie den Becherhalter vorsichtig in das Instrument an der angegebenen "Position 1". Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat. Beschriften Sie die experimentellen Brunnen.
4. Drücken Sie den Probeneinsteckarm, bis sich der Becherhalter an der angegebenen "Position 2" befindet. Warten Sie 20 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat.
5. Drücken Sie den Probeneinschubarm in "Position 3" und ziehen Sie den Probeneinsteckarm so lange zurück, bis er sich an der "Laufposition" befindet. Markieren Sie alle Brunnen in der Software und wählen Sie Reaktionsstart (Ergänzende Abbildung 4).
6. Führen Sie das Experiment aus, bis die Wärmeemissionswerte stabil wieder bei Null liegen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich alle Brunnen in diesen Schritten ähnlich verhalten. Ergänzende Abbildung 5 zeigt, was zu beachten ist, wenn die Brunnen richtig geladen sind. Wenn Sie falsch geladen sind, wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4.

6. Entfernen Sie den Becherhalter

1. Wählen Sie in der Software Stop (Supplemental Abbildung 6). Die Software wird dann fragen, ob "Sie sicher sind", wählen Sie Ja (Ergänzende Abbildung 7) und speichern Sie das Experiment auf einem Laufwerk oder Desktop für die Datenanalyse (Ergänzende Abbildung 8).
2. Setzen Sie den Probeneinsteckarm vollständig in das Instrument ein und greifen Sie die Magnete an, um den Becherhalter abzurufen.
3. Lösen Sie die Deckel, entfernen Sie die Einsätze und legen Sie Fläschchen und Deckel in Glashalter und legen Sie sie 4 Stunden bei 180 °C, gefolgt von der Platzierung der Fläschchen und Deckel in einen Trockenbau, um sicherzustellen, dass Deckel und Fläschchen trocken sind.

7. Analysieren von Daten

1. Öffnen Sie die Software (Ergänzende Abbildung 9), wählen Sie Experiment in der linken oberen Ecke öffnen (Ergänzende Abbildung 10). Wählen Sie im Popup-Fenster das Experiment von Interesse aus und drücken Sie Open (Ergänzende Abbildung 11). Die Anwendung öffnet das Experiment in der Standardbrunnenansicht (Ergänzende Abbildung 12).
2. Drücken Sie Alle auswählen oder Strg+A (Ergänzende Abbildung 13).
3. Drücken Sie Baseline definieren, normalisiert dieser Parameter die Daten an jeder Position (Ergänzende Abbildung 14). Wählen Sie im Popup-Fenster einen Zeitraum von >30 min in der Verzögerungsphase aus (der Wärmestrom muss niedrig sein, zwischen null und zehn W; Ergänzende Abbildung 15). Nach der Auswahl des Basislinienzeitraums wird die gewählte Basislinie im Thermogramm grün angezeigt. Schließen Sie das Fenster Basislinienabschnitt definieren.
4. Drücken Sie Speichern oder Strg+S und schließen Sie die Software (Ergänzende Abbildung 16).
5. Öffnen Sie die webbasierte Symcel Calorimetry Analysis Application (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
6. Um die Datei in die Calorimetry-Analyseanwendung hochzuladen, drücken Sie Durchsuchen (Ergänzende Abbildung 17), wählen Sie das Experiment aus und drücken Sie Open (Supplemental Figure 18). Die metabolischen Parameter werden automatisch für die 32 Proben in der Webanwendung berechnet (Ergänzungsabbildung 19).
7. Um die Wärmeflussdaten an Gompertz und/oder Richards Wachstumsmodelle anzupassen, klicken Sie auf Growth Function. Wachstumsmodelle passen werden im Abschnitt "Kumulativ" angezeigt, auch im Vergleich zu den Rohdaten im Abschnitt "Flow" (Ergänzende Abbildung 20).
8. Um alle berechneten Parameter herunterzuladen, drücken Sie Download Measures. Wählen Sie den Speicherort der Datei aus, und drücken Sie Speichern (Ergänzende Abbildung 21). Die Datei wird für weitere Berechnungen in eine Kalkulationstabelle exportiert.

Ergebnisse

Eine ausreichende Anzahl von Bakterien, die Wärme erzeugen, wird benötigt, damit das Gerät ein Wärmesignal aufnimmt. Wenn es eine zeitliche Verzögerung gibt, bis ein Wärmestrom nachweisbar ist, bedeutet dies, dass die Bakterien noch kein Wärmesignal oberhalb der Nachweisgrenze erzeugen. Der Nachweis der freigesetzten Wärme aus der bakteriellen Probe steht daher in direktem Zusammenhang mit der zunehmenden bakteriellen Aktivität, einschließlich des Bakterienwachstums. Bakterielles Wachstum und andere metabolische Aktivitäten sind dafür bekannt, stark durch die Zugabe eines antibakteriellen Medikaments beeinflusst werden. Um festzustellen, ob ein neues Naturprodukt, das untersucht wird, bakterizide oder bakteriostatische Wirkungen oder eine Kombination beider MoAs ausübt, haben wir einen kleinen Satz von Referenzmedikamenten ausgewählt und Thermogramme aufgezeichnet, mit denen wir Daten aus Experimenten mit dem Naturprodukt verglichen haben. Basierend auf der Wirksamkeit ausgewählter Antibiotika wurde eine Reihe von Konzentrationen ausgewählt, die die minimale hemmende Konzentration (MIC) nahe beidermaßen, die durch Mikrobrüheverdünnung bestimmt wird.

Ciprofloxacin zielt auf bakterielle DNA-Gyrase und Topoisomerase IV und zeigt daher ein bakterizides MoA. Jedoch, bakterielle Tötung durch Ciprofloxacin induziert ist konzentrationsabhängig und wenn es in unzureichenden Konzentrationen dosiert wird, kann es auch eine bakteriostatische Wirkung haben²¹. Tetracyclin und Chloramphenicol zielen auf das Ribosom in der Untereinheit 30S bzw. 50S ab und wirken aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese^22,23bakteriostatisch. Rifampicin wirkt durch Hemmung der DNA-abhängigen RNA-Polymerase und es kann beide, bakterizide und bakteriostatische Wirkung haben, abhängig von der verwendeten Dosis²⁴. Das natürliche Produkt, das wir hier untersuchen, wurde von Myxobacteria isoliert und zeigte eine starke Aktivität gegen Gram-negative und Gram-positive bakterielle Krankheitserreger. Bei der Untersuchung des MoA und des molekularen Targets waren wir daran interessiert, festzustellen, ob das neue Naturprodukt bakterizide und/oder bakteriostatische Wirkungen ausübt und ob die Wärmeprofile der behandelten Acinetobacter baumannii Denthermogrammen von Bakterien ähneln, die mit den oben genannten Referenzmedikamenten behandelt wurden.

Die Thermogramme, die durch Aussetzen von A. baumannii DSM-30008 ciprofloxacin in serieller Verdünnung gewonnen werden, sind in Abbildung 1Adargestellt. Die Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,1 m haben einen minimalen Einfluss auf das Wachstum und den Stoffwechsel von A. baumannii. Die Behandlung der Zellen mit 0,5 M Ciprofloxacin führt jedoch zu einer signifikanten Verschiebung der Verzögerungsphasendauer und einem geringeren maximalen Wärmestrom. Diese beiden Änderungen zusammen beeinflussen die Zeit bis zum Höhepunkt (Abbildung 1C), die um etwa 6 Stunden erhöht wird. In Abbildung 1Bwird die kumulativ ekumulierte Wärme gegen die Zeit dargestellt. Hier sehen wir die Wirkung von Konzentrationen, die sich in einer Steigung der Steigung widerspiegelt. Die Quantifizierung der Neigung des Thermogramms ergibt eine maximale Stoffwechselrate von A. baumannii in Gegenwart von Ciprofloxacin, wie in Abbildung 1Ddargestellt, wo wir eine gleichzeitige Abnahme der Metabolitätsrate der mit 0,5 M Ciprofloxacin behandelten Zellen beobachten können. Veränderungen der Stoffwechselrate von Zellen, die mit niedrigeren Konzentrationen behandelt werden, sind minimal. Dieses Experiment könnte durch die Zugabe von Zwischenkonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 1 m weiter verbessert werden, um eine ausgeprägtere allmähliche Veränderung zwischen den Konzentrationen ohne Wirkung und einer Konzentration zu beobachten, die zu einer erheblichen Verzögerung der Verzögerungsphase und der Stoffwechselrate führt. Die Trends des Wandels unterstützen jedoch ein bakterizides MoA von Ciprofloxacin.

Abbildung 1A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 1B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 1C: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 1D: Wirkung von Ciprofloxacin auf A. baumannii DSM-30008 Wachstum und Stoffwechsel. (A) Thermogramme, die als Wärmestrom (W) vs. Zeit (h) für Wildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, unbehandelt und Ciprofloxacin ausgesetzt sind, angezeigt werden. (B) Kumulierte Wärme (mJ) vs. Zeit (h). (C) Zeit bis Spitze (h) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). (D) Stoffwechselrate (W) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bei Tetracyclin haben wir keine signifikanten Veränderungen der Thermogramme für alle bis zur späten Exponentialphase getesteten Konzentrationen nach 8 Stunden beobachtet (siehe Abbildung 2A). Dennoch werden große Veränderungen bei der stationären Phasenwärmeemission beobachtet, bei der der zweite Spitzenwert des Wärmeflusses für A. baumannii, der mit 5 m und 10 M Tetracyclin behandelt wird, deutlich abgesenkt wird. Auch niedrigere Konzentrationen wirkten sich aus, die jedoch weniger ausgeprägt waren. Dieser Effekt bewirkt auch eine Verlängerung in der Zeit bis zum Höhepunkt, wie in Abbildung 2Cdargestellt. Die kumulativ freigesetzten Wärmekurven (Abbildung 2B) zeigen, dass nicht behandelte und behandelte Zellen keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtkurvenform aufweisen, sondern tendenziell nimmt die Neigung der Kurven bei höheren Tetracyclinkonzentrationen ab. Dies führt auch zu quantifizierten Stoffwechselraten, die in Abbildung 2Ddargestellt sind, wo ein konzentrationsabhängiger Effekt (d. h. eine Abnahme der Stoffwechselrate bei steigenden Antibiotikakonzentrationen) beobachtet wird. Diese Ergebnisse stützen die Tatsache, dass Tetracyclin eine bakteriostatische Wirkung hat.

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Abbildung 2B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2C: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2D: Wirkung von Tetracyclin auf A. baumannii DSM-30008 Wachstum und Stoffwechsel. (A) Thermogramme, die als Wärmestrom (W) vs. Zeit (h) für Wildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, unbehandelt und Tetracyclin ausgesetzt sind, angezeigt werden. (B) Kumulierte Wärme (mJ) vs. Zeit (h). (C) Zeit bis Spitze (h) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). (D) Stoffwechselrate (W) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Noch ausgeprägtere Effekte können bei der Behandlung von A. baumannii mit dem Proteinsynthesehemmer Chloramphenicol beobachtet werden, der auf die ribosomale Untereinheit 50S abzielt. Die Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen von Chloramphenicol führt zu einer Verlängerung der Verzögerungsphase und signifikanten Veränderungen der Stoffwechselaktivität in der stationären Phase (Abbildung 3A und Abbildung 3B). Bei der niedrigsten getesteten Konzentration wird keine Veränderung der Stoffwechselrate beobachtet, und die höchste gewählte Testkonzentration (50 m) verhindert die größte Energiefreisetzung der Probe. Betrachtet man die Zwischentestkonzentrationen (5 m und 10 m), so wird die Zeit bis zum Höhepunkt um ca. 8-9 Stunden signifikant erhöht(Abbildung 3C). Gleichzeitig wird die Stoffwechselrate der behandelten Zellen signifikant reduziert, wobei 50 M tödlich sind (Abbildung 3D). Insgesamt stimmen die veränderungen, die bei Konzentrationen von bis zu 10 M Chloramphenicol beobachtet wurden, mit einer bakteriostatischen Wirkung dieser Antibiotikaklasse überein.

Abbildung 3A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3C: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3D: Wirkung von Chloramphenicol auf A. baumannii DSM-30008 Wachstum und Stoffwechsel. (A) Thermogramme, die als Wärmestrom (W) vs. Zeit (h) für Wildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, unbehandelt und Chloramphenicol ausgesetzt sind, angezeigt werden. (B) Kumulierte Wärme (mJ) vs. Zeit (h). (C) Zeit bis Spitze (h) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). (D) Stoffwechselrate (W) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Rifampicin-Behandlung im gewählten Konzentrationsbereich wirkt sich dramatisch auf die Thermogramme von A. baumannii DSM-30008 aus, die sich auf die Verzögerungsphasendauer und die Auswirkungen auf das Wachstum bis zur späten stationären Phase beziehen(Abbildung 4A). Eine signifikante Verringerung der Wärmeemission ist in Abbildung 4B zu sehen, die mit einer Abnahme der metabolischen Aktivität einhergeht. Abbildung 4C und Abbildung 4D veranschaulichen den Einfluss der Verlängerung der Verzögerungsphase und Veränderungen der Stoffwechselaktivität in der stationären Phase. Abbildung 4C zeigt eine deutliche Erhöhung der Zeit bis zum Höhepunkt für alle verwendeten Konzentrationen. Abbildung 4D zeigt die Abnahme der Stoffwechselrate, die durch die Abnahme der Steigung für alle Konzentrationen verursacht wird, die normalerweise einem bakteriziden Effekt zugeschrieben wird. Aufgrund der antibiotikainduzierten Abtötung von Bakterienzellen wird erwartet, dass die Stoffwechselaktivität aufgrund einer geringeren Anzahl aktiver Bakterien geringer sein wird. Die erhobenen Daten sind im Widerspruch zu der Tatsache, dass Rifampicin bakterizid und bakteriostatisch wirken kann, und die hier vorgestellten Daten unterstützen hauptsächlich bakterizide Wirkungen der gewählten Konzentrationen.

Abbildung 4A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4C: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4D: Wirkung von Rifampicin auf A. baumannii DSM-30008 Wachstum und Stoffwechsel. (A) Thermogramme, die als Wärmestrom (W) vs. Zeit (h) für Wildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, unbehandelt und Rifampicin ausgesetzt sind, dargestellt werden. (B) Kumulierte Wärme (mJ) vs. Zeit (h). (C) Zeit bis Spitze (h) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). (D) Stoffwechselrate (W) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die niedrigste ausgewählte Testkonzentration des Naturprodukts Antibiotikum (0,25 m) hat keine oder nur marginale Auswirkungen auf das Thermogramm von A. baumannii DSM-30008. Andere getestete Konzentrationen zeigen jedoch einen gewissen Einfluss auf die Verzögerungsphasendauer und beeinflussen das Wachstum bis zur späten stationären Phase(Abbildung 5A). Der offensichtlichste Effekt ist die signifikante Reduzierung der Wärmeemission in der stationären Phase. Die in Abbildung 5B dargestellten Daten zeigen deutlich, dass die freigesetzte Energie bei allen effektiven Konzentrationen deutlich verringert wird und auch die Steigung verringert wird. Diese Effekte führen zu einer Verminderung der Zeit bis zum Höhepunkt (Abbildung 5C) und, was noch wichtiger ist, eine signifikante und eindeutig dosisabhängige Abnahme der Stoffwechselrate beobachtet wird (Abbildung 5D). Die Untersuchung des neuen myxobakteriellen Naturprodukts ergab eine kombinierte bakteriostatische und bakterizide Wirkung.

Abbildung 5A: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5B: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5C: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5D: Wirkung eines neuen antibakteriellen Naturprodukts auf das Wachstum und den Stoffwechsel von A. baumannii DSM-30008. (A) Thermogramme, die als Wärmestrom (W) vs. Zeit (h) für Wildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, unbehandelt und dem Naturprodukt ausgesetzt sind, angezeigt werden. (B) Kumulierte Wärme (mJ) vs. Zeit (h). (C) Zeit bis Spitze (h) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). (D) Stoffwechselrate (W) mit Fehlerbalken (Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Auswählen eines neuen Experiments in der Software-Schnittstelle. In einem roten Quadrat wird der Schritt zur Auswahl eines neuen Experiments dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Benennen eines neuen Experiments in der Softwareschnittstelle. In einem roten Quadrat wird der Schritt zum Benennen und Bestätigen des neuen Experiments dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Starten eines neuen Experiments in der Software-Schnittstelle. In einem roten Quadrat wird der Schritt zum Start eines neuen Experiments dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Brunnenauswahl und Reaktionsbeginn in der Software-Schnittstelle. Alle Reaktionsbrunnen sind ausgewählt (Brunnen in tiefblauer Farbe gefärbt, Taste Alle in einem roten Quadrat dargestellt auswählen) und Reaktionsbeginn wird ausgewählt (in einem roten Quadrat dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Korrektes Beladen des Becherhalters. Referenzbrunnen werden ausgewählt (tiefblaue Farbe, rotes Quadrat) und Thermogramme werden in einem Popup-Fenster angezeigt. Wenn die Belastung korrekt durchgeführt wird, beobachten wir einen steilen Rückgang des wärmeemissionssignals, das eine Plateauphase erreichen muss und in dieser Phase ca. 2-3 min bleiben muss, danach kehrt das Signal zum Ausgangspunkt zurück. Wenn dies beobachtet wird, ist die Belastung des Becherhalters korrekt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Ende des Experiments. In Rot wird die Stopp-Taste im Experiment dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Bestätigung des Endes des Experiments. In Rot wird die Schaltfläche Ja angezeigt, um das Ende des laufenden Experiments zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Speichern der Experimentdatei. Ein Popup-Fenster mit Speicherdateioptionen wird angezeigt und in rot wird die Schaltfläche Speichern angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Software-Schnittstelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: Zugriff auf gespeicherte Experimente. In rot wird die Schaltfläche Öffnen Experiment für den Zugriff auf gespeicherte Experimente dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: Öffnen der ausgewählten Experimentierdatei. In rot ist die Schaltfläche Öffnen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 12: Standardbrunnenansicht. Alle experimentellen Brunnen und entsprechende Thermogramme sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 13: Auswählen von Brunnen fürdie Analyse . In rot wird die Schaltfläche Alle auswählen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 14: Definieren der Basislinie. In rot wird die Schaltfläche Basislinie definieren dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 15: Auswahl des Basissignals. Mindestens 30 min Signal in der Verzögerungsphase ist ausgewählt (rotes Feld). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 16: Speichern von Änderungen an der experimentellen Datei. In rot ist die Schaltfläche Speichern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 17: Webbasierte Calorimetrie-Analyseanwendung. Die Online-Software-Schnittstelle und Datei-Upload-Pfad wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 18: Hochladen ausgewählter experimenteller Datei. In rot ist die Schaltfläche Öffnen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 19: Analyse der Thermogramme. Metabolische Parameter, die für jeden Versuchsbrunnen berechnet werden, sind rot dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 20: Anpassen der experimentellen Daten an theoretische Wachstumsmodelle. Wärmeflussdaten werden entweder an ein Gompertz- oder ein Richards Wachstumsmodell angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 21: Exportieren der Messungen. In rot sind die Schaltflächen Download Measures und Save abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Die isotherme Mikrokalormetrie misst die von einer Probe im Laufe der Zeit emittierte Energie, und diese Energiefreisetzung ist das Ergebnis aller biologischen, physikalischen und (bio-)chemischen Prozesse. Der gemessene Wärmestrom kann genutzt werden, um antibakterielle Wirkungen von Substanzen zu bewerten oder zu bestimmen, da er eine kontinuierliche Echtzeitüberwachung der Stoffwechselaktivität ermöglicht.

Um zuverlässige Daten für die Analyse zu erhalten, müssen für jede verwendete Art oder Sorte die richtigen beginnenden koloniebildenden Einheiten (CFU) individuell bestimmt werden. Falls die KBE-Zahl zu niedrig ist, führt dies zu einer längeren Verzögerungsphase, da es länger dauert, bis das System eine kritische Menge an Biomasse erreicht, die genügend Wärme erzeugt, um erkannt zu werden. Falls die KBE-Zahl zu hoch ist, wird die Verzögerungsphase sehr kurz sein, und die erzeugte Wärmemenge kann zu Wärmeübertragung entoseln (Referenz- und Versuchsbrunnen) und Verzerrungen der Thermogramme verursachen. Eine hohe Anzahl von KBE wird auch zu einem schnelleren Sauerstoffmangel führen und auf anaerobe Bedingungen umstellen. Es ist auch zu berücksichtigen, dass während der ersten 30 Minuten des Experiments, wenn das System ausgeglichen wird, die Datenerhebung nicht möglich ist und die tatsächliche Erfassung der Effekte verzögert wird. Darüber hinaus führt eine falsche KBE-Bestimmung zu einer falschen MIC-Bestimmung, die letztlich das Experiment und die beobachteten Veränderungen beeinflusst²⁵. Ein weiterer kritischer Punkt ist die korrekte Bestimmung der Basislinie. Normalerweise wird das Basissignal während der Verzögerungsphase ausgewählt, wenn das Wärmeflusssignal Null ist und idealerweise der Zeitbereich für die Basisliniendefinition >30 min beträgt. Dies ist jedoch nicht immer möglich, da die Zeit, die die Bakterien benötigen, um die Wärmesignalerkennungsgrenze zu erreichen, zwischen Stämmen und Arten unterschiedlich ist. Einige Arten oder Stämme benötigen mehr als 30 Minuten, um die Wärmesignalerkennungsgrenze zu erreichen, während andere Stämme oder Arten sie innerhalb der ersten 30 Minuten erreichen. In diesem Fall ist es möglich, das Basissignal am Ende des Experiments auszuwählen, wenn alle Wärmesignale wieder auf Null gefallen sind und stabil bleiben. Alternativ können Baselines aus anderen Experimenten mit dem gleichen Bakterienstamm verwendet werden, was jedoch nicht empfohlen wird.

Das System ermöglicht eine gewisse Flexibilität bei der Konzeption und Optimierung von Experimenten und Fehlerbehebung. Die verwendeten Mengen liegen im Bereich von 100-300 l bei Verwendung von Kunststoffeinsätzen und 100-600 l bei Verwendung von Titanbechern ohne Kunststoffeinsätze. Das vom Hersteller empfohlene Arbeitsvolumen beträgt 120 l. Die Verwendung unterschiedlicher Volumina bei der Einrichtung einer neuen Versuchsreihe und bei der Suche nach optimalen Bedingungen für Messungen wirkt sich hauptsächlich auf zwei Parameter aus. Durch die Verwendung geringerer Mengen kann die Menge der benötigten Prüfmasse verringert werden, was besonders wichtig für Verbindungen ist, die nur in geringen Mengen erhältlich sind. Darüber hinaus wirkt sich das verwendete Volumen direkt auf die Sauerstoffverfügbarkeit während der Messung aus, wobei geringere Volumina die Menge an verfügbarem Sauerstoff erhöhen, die für das Bakterienwachstum benötigt wird. Der Sauerstoffmangel ist einer der Hauptfaktoren, die zur maximal möglichen Dauer des Experiments beitragen. Wichtig ist, dass es möglich ist, feste Medien zu verwenden, nicht nur flüssige Medien. Dies ist besonders wichtig für langsam wachsende Mikroorganismen, da das Wachstum an der Schnittstelle zwischen Feststoff- und Gasphase einen besseren Sauerstoffzugang ermöglicht⁹.

IMC ist ein nützliches Analysewerkzeug, um unbekannte Prozesse mit Anwendungen in Physik, Chemie und Biologie zu entdecken. Das Verfahren misst den Wärmeaustausch innerhalb eines geschlossenen Systems und die Analyse des aufgezeichneten Wärmeaustauschs liefert zusätzliche Informationen, die nicht immer mit Standardmethoden gewonnen werden können. In der Mikrobiologie und Antibiotikaforschung ist einer der größten Vorteile von IMC seine Fähigkeit, zwischen lebenden, toten und persistenten oder ruhenden Zellen zu unterscheiden, was mit Standard-Trübungsmethoden nicht möglich ist¹¹. Darüber hinaus ist IMC hochempfindlich und kann Wärmeemissionen von nur 10⁴-10⁵ Zellen⁹erkennen. Ein weiterer Vorteil ist, dass das experimentelle Setup schnell und einfach ist, und es ermöglicht eine kontinuierliche Echtzeit-Tracking mit minimalen bis keine Benutzereingriffe. Darüber hinaus ist IMC zerstörungsfrei, was eine weitere Analyse von Proben ermöglicht. Die Datenanalyse ermöglicht die Entkopplung der Biomassebildung bis zur späten exponentiellen oder frühen stationären Phase und der metabolischen Aktivität in der stationären Phase.

Neben den oben erwähnten neuartigen und spannenden Anwendungsmerkmalen gibt es auch Nachteile dieser Methode. Die Hauptbeschränkung besteht darin, dass IMC-Instrumente die gesamte erzeugte und freigesetzte Wärme in einem bestimmten System messen, zu denen auch unspezifische Signale gehören. Dies unterstreicht die Bedeutung der experimentellen Planung mit geeigneten Steuerungen, um die Wärmesignaländerungen beurteilen zu können, die durch Aufzeichnung des Wärmestroms^9,20gemessen werden.

In unseren Händen ist IMC ein wichtiges Werkzeug, um antibakterielle Wirkungen neuer Naturprodukte zu untersuchen und effektive Konzentrationsbereiche zu bestimmen. Abgesehen von der Differenzierung der bakteridären und bakteriziden Wirkungen könnte es in Zukunft als Teil von Zielidentifikationsstudien und MoA-Bestimmung verwendet werden. Dies kann durch den Vergleich von Thermogrammen verschiedener Antibiotikaklassen mit Thermogrammen neuer Wirkstoffe, wie hier dargestellt, erfolgen. Es muss jedoch noch untersucht werden, ob bestimmte quantifizierbare Parameter, die aus den gemessenen Daten extrahiert werden können, für solche Vergleiche ausreichen oder ob es notwendig sein wird, an Algorithmen zu arbeiten, die Fingerabdrücke auf der Grundlage vollständiger Thermogramme erhalten. Eine weitere mögliche Anwendung auf dem Gebiet der Antibiotikaforschung ist der Vergleich von Wildtyp mit resistenten Klonen, gekoppelt mit der vollständigen Genomsequenzierung, die helfen kann, die Art-of-Resistenz (MoR) neuer Antibakterien aufzuklären. Aufgrund der statischen Natur der Methode könnte die Untersuchung der Wirksamkeit neuer Wirkstoffe bei der Biofilmbildung oder auf bereits etablierten Biofilmen zu einem besseren Verständnis des biologischen Prozesses und der Wirkung ausgewählter Wirkstoffe auf Mikroben in verschiedenen Stadien des Ruhezustands führen. IMC zeichnet die Gesamtenergie auf, die in Form von Wärme freigesetzt wird, was es zu einer geeigneten Methode macht, um auch subhemmende Wirkungen von Wirkstoffen zu untersuchen, die mit Transkriptomik gekoppelt werden könnten. Diese Methode kann auch in klinischen Umgebungen verwendet werden, um Kontamination von Proben zu erkennen oder für die Bestimmung von Antibiogrammen, die helfen, schnell über eine bestimmte Behandlung der Patienten zu entscheiden¹¹.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acinetobacter baumannii	DSMZ	DSM-30008	reference strain used in this study
calPlate	Symcel	1220093	48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener	Symcel	1200001	isothermal microcalorimetry instrument
calView software	Symcel		collection and analysis software
calWell	Symcel	1901004	micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar	Carl Roth	X937.1	isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic
Ciprofloxacin	Sigma-Aldrich	17850	antibiotic
Cuvettes	Brand	759015	1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops	Sarsted	86.1562.050	10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	85190
Eppendorf tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	10428671
Falcon Tubes	Sarsted	62.554.502	15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL)	Thermo Fisher Scientific	10316380
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Mueller Hinton Broth	Sigma-Aldrich	70192	liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media	Sigma-Aldrich	90922	Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes	LABSOLUTE	7696404
Pipette 100 - 1000 µL	Brand	705880
Pipette 2 - 20 µL	Brand	705872
Pipette 20 - 200 µL	Brand	705878
Pipette tips 100 - 1000 L	Brand	732032
Pipette tips 2 - 200 µL	Brand	732028
Polymyxin B sulfate	Sigma-Aldrich	P0972	antibiotic
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501	antibiotic
Serological pipette	Thermo Fisher Scientific	170356N	10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer	Eppendorf AG	6135 000.017
Sterile filters	Minisart	16534----------K	0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL	NORM-JECT	22778
Tetracycline	Sigma-Aldrich	87128	antibiotic
Titanium cups	Symcel	1220089	inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids	Symcel	1220091	screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim	Sigma-Aldrich	T7883	antibiotic
Tweezers	Symcel	1900602