מדידה של הפצות לחות תלת-ממדיות בתאים חיים באמצעות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליים

Summary

בשל יחס אות לרעש נמוך (SNR) של חיישנים מבוססי העברת אנרגיית תהודה של Fӧrster (FRET), מדידת אותות המחנה הייתה מאתגרת, במיוחד בשלושה ממדים מרחביים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיית דימות וניתוח FRET היפרספקטרלית המאפשרת מדידה של התפלגות המחנה בשלושה ממדים מרחביים.

Abstract

AMP מחזורי הוא שליח שני המעורב במגוון רחב של פעילויות תאיות ופיזיולוגיות. מספר מחקרים מצביעים על כך שאותות המחנה ממודרים, וכי המידור תורם לאותת על הספציפיות בתוך מסלול האיתות של המחנה. הפיתוח של biosensors מבוססי העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (FRET) קידם את היכולת למדוד ולדמיין אותות cAMP בתאים. עם זאת, מדידות אלה מוגבלות לעתים קרובות לשני ממדים מרחביים, מה שעלול לגרום לפרשנות שגויה של נתונים. עד כה, היו רק מדידות מוגבלות מאוד של אותות המחנה בשלושה ממדים מרחביים (x, Y ו- z), בשל המגבלות הטכניות בשימוש בחיישני FRET המציגים מטבעם יחס אות לרעש נמוך (SNR). בנוסף, גישות הדמיה מסורתיות המבוססות על מסנן אינן יעילות לעתים קרובות למדידה מדויקת של אותות המחנה באזורים תת-תאיים מקומיים בשל מגוון גורמים, כולל הצלבה ספקטרלית, עוצמת אות מוגבלת ופלואורסצנטיות אוטומטית. כדי להתגבר על מגבלות אלה ולאפשר שימוש בביוסנסורים מבוססי FRET עם פלואורופורים מרובים, פיתחנו גישות דימות וניתוח FRET היפרספקטרליות המספקות ספציפיות ספקטרלית לחישוב יעילות FRET והיכולת להפריד באופן ספקטי אותות FRET מפלואורסצנטיות אוטומטית מבלבלת ו / או אותות מתוויות פלואורסצנטיות נוספות. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה ליישום הדמיית FRET היפרספקטרלית, כמו גם את הצורך לבנות ספרייה ספקטרלית מתאימה כי הוא לא undersampled ולא דגימת יתר לבצע unmixing ספקטרלי. בעוד אנו מציגים מתודולוגיה זו למדידה של התפלגות טמפ תלת מימדית בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים (PMVECs), מתודולוגיה זו יכולה לשמש לחקר הפצות מרחביות של המחנה במגוון סוגי תאים.

Introduction

אדנוסין מונופוספט מחזורי (באנגלית: Adenosine monophosphate) הוא שליח שני המעורב בתהליכים תאיים ופיזיולוגיים מרכזיים, לרבות חלוקת תאים, זרם סידן, שעתוק גנים והתמרת אותות. ^גוףגדל והולך של ראיות מצביע על קיומם של תאי המחנה בתא שדרכו מושגת הספציפיות של האיתות 1^,2,3,4,5,6,7. עד לאחרונה, מידור המחנה הסיק בהתבסס על השפעות פיזיולוגיות או תאיות ברורות הנגרמות על ידי אגוניסטים קולטנים שונים מצמידי G^8,9,10,11. לאחרונה, בדיקות הדמיית פלואורסצנטיות מבוססות FRET סיפקו גישות חדשות למדידה ותצפית ישירה של אותות המחנה בתא^12,13,14.

העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא תופעה פיזית שבה העברת אנרגיה מתרחשת בין מולקולות תורם ומקבל בצורה לא רדיאטורית כאשר המולקולות נמצאות בסמיכות^15,16. עם התפתחותם של אינדיקטורים פלואורסצנטיים מבוססי FRET, תופעה פיזית זו שימשה ביישומים ביולוגיים לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון¹⁷, חלבון שיתוף לוקליזציה¹⁸, Ca⁺² איתות¹⁹, ביטוי^{גנים 20}, חלוקת תאים²¹ ואיתות נוקלאוטיד מחזורי. מחווני המחנה מבוסס FRET מורכבים בדרך כלל מתחום כריכת המחנה, פלואורופור תורם ופלואורופור מקובל²². לדוגמה, חיישן H188 cAMP^12,22 המשמש במתודולוגיה זו מורכב מתחום כריכת המחנה המתקבל מ- Epac, בין פלואורופורים בצבע טורקיז (תורם) ונוס (מקבל). בתנאים בסיסיים (לא מאוגדים), טורקיז ונוגה נמצאים באוריינטציה כך FRET מתרחשת בין הפלורופורים. בעת קשירת המחנה לתחום הכריכה, מתרחש שינוי קונפורמציה כך שטורקיז ונוגה מתרחקים זה מזה וכתוצאה מכך ירידה ב- FRET.

גישות הדמיה מבוססות FRET מציעות כלי מבטיח לחקירה והדמיה של אותות המחנה בתוך התא. עם זאת, טכניקות הדמיה מיקרוסקופיות מבוססות FRET הנוכחיות מצליחות לעתים קרובות רק באופן חלקי בהשגת עוצמת אות מספקת כדי למדוד FRET בבהירות מרחבית תת-תאית. זאת בשל מספר גורמים, כולל עוצמת האות המוגבלת של כתבי FRET רבים, רמת הדיוק הגבוהה הנדרשת לכימות מדויק של שינויים ביעילות FRET, ונוכחות של גורמים מבלבלים, כגון autofluorescence הסלולר^23,24. התוצאה היא לעתים קרובות תמונה FRET כי הוא מוטרד על ידי SNR חלש, מה שהופך את הדמיה של שינויים תת תאיים FRET קשה מאוד. בנוסף, חקירה של אותות המחנה המותאמים לשפות הפליא בוצעה כמעט אך ורק בשני ממדים מרחביים בלבד והתפלגות המחנה צירי נחשבה לעתים רחוקות²⁵. סביר להניח שהסיבה לכך היא ש-SNR נמוך עכב את היכולת למדוד ולדמיין מעברי צבע של המחנה בשלושה ממדים מרחביים. כדי להתגבר על מגבלות של שימוש בחיישני FRET עם SNR נמוך, יישמנו גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות כדי למדוד FRET בתאים בודדים^25,26,27.

גישות הדמיה היפרספקטרליות פותחו על ידי נאס"א כדי להבדיל בין אובייקטים יבשתיים הנמצאים בתמונות^{לווין 28,29}. טכניקות אלה תורגמו מאז לשדה מיקרוסקופיה פלואורסצנטית³⁰, עם מספר מערכות מיקרוסקופ קונפוקליות מסחריות המציעות גלאים ספקטרליים. בהדמיית פלואורסצנטיות מסורתית (לא ספקטרלית), המדגם מתרגש באמצעות מסנן פסים או קו לייזר, והפליטה נאספה באמצעות מסנן פסים שני, שנבחר לעתים קרובות כדי להתאים את אורך הגל של פליטת השיא של הפלואורופור(ים). לעומת זאת, גישות הדמיה היפרספקטרליות מבקשות לדגום פרופיל ספקטרלי מלא של פליטת פלואורסצנטיות^26,31,32 או עירור^33,34 במרווחי זמן ספציפיים אורך גל. במחקרים הקודמים שלנו, הראינו כי גישות הדמיה וניתוח היפרספקטרליות יכולות להציע כימות משופר של אותות FRET בתאים בהשוואה לטכניקות הדמיה FRET מבוססות מסנן מסורתיות²⁶. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לביצוע חלוקות וניתוח FRET תלת-ממדיות (x, Y, z ו- λ) כדי למדוד ולדמיין התפלגותamp בשלושה ממדים מרחביים. גישות אלה אפשרו הדמיה של מעברי צבע מרחביים של cAMP הנגרמים על-ידי אגוניסט בתאים בודדים²⁵. מעניין, בהתאם אגוניסט, מעברי צבע המחנה עשוי להיות גלוי בתאים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בהסרת ההסרה הספקטרלית של רקע לא אחיד ואוטלואורסצנטיות תאית כדי לשפר את הדיוק של מדידות FRET. בעוד מתודולוגיה זו מודגמת בתאי אנדותל מיקרו וסקולריים ריאתיים (PMVECs) באמצעות biosensor FRET cAMP, המתודולוגיה יכולה בקלות להיות שונה לשימוש עם כתבי FRET חלופיים או קווי תאים חלופיים.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר נהלים שאושרו על ידי אוניברסיטת דרום אלבמה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.

1. הכנת תאים, דגימה וריאגנט להדמיה

1. לבודד תאי אנדותל מיקרו וסקולריים ריאתי חולדה (PMVECs) כמתואר בעבר³⁵.
   הערה: תאים היו מבודדים ותרבית על ידי הליבה תרבית התא באוניברסיטת דרום אלבמה, נייד, AL על 100 מ"מ תרבית תאים צלחות.
2. זרע PMVECs מבודד על כיסויי זכוכית עגולה 25 מ"מ ולתת להם לגדול באינקובטור ב 37 °C (37 °F) עד התאים להשיג לפחות 80% השפעה (לפחות 24 שעות).
   הערה: תאים וסוג התא עשויים להשתנות ממחקר למחקר ולכן יש לעקוב אחר הליכי תרבית תאים ספציפיים לתאים כדי לזרוע ולגדל תאים. פרוטוקול זריעת תאים ופולחן המשמש במחקרים אלה זמין כמידע משלים בקובץ בשם "תרבות File_Cell משלימה ו Transfection".
3. נצלו PMVECs עם ביו-סנסור FRET ודגרה למשך 48 שעות ב-37 °C (75 °F).
   הערה: הפרוטוקול כדי transfect PMVECs מתואר גם בקובץ מידע משלים בשם "תרבות File_Cell משלימה transfection".
4. ביום ההדמיה, חימם את המאגר של טיירוד ל 37 °C (50 °F) באמבט מים.
   הערה: המאגר של טיירוד מורכב מ- 145 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 10 מ"מ HEPES, 10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ MgCl₂ ו- 1 mM CaCl₂
5. הר כיסוי המכיל תאים שהודבקו לתא תא ואבטח את החלק העליון עם אטם הרכבה כדי למנוע דליפה.
6. נגב את החלק התחתון של כיסוי באמצעות מחיקת משימה עדינה לניקוי כל מדיה עודפת או תאים דבקים.
7. הוסף 800 μL של חיץ עובד ו 4 μL של תווית גרעינית 5 mM לתא התא וסלע בעדינות במשך 5 - 10 שניות.
   הערה: בעת הוספת פתרונות חוצץ או ריאגנט לכיסויים המותקנים בתא התא, הקפד להוסיף את הפתרון בעדינות ובצד תא התא כדי לא לפרק תאים דבקים. הוספת 4 μL של תווית גרעינית 5 mM ל 800 μL של חוצץ עושה 25 μM ריכוז סופי של תווית גרעינית. עבור תאים דבקים באופן רופף כגון תאי HEK293, מערבבים תחילה תווית גרעינית ומאגר בתקנה ולאחר מכן מוסיפים לכיסויים המותקנים בתא התא. פעולה זו תמנע הרמת התאים מהכיסוי.
8. לכסות את תא התא עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור ודגורה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הכנה ריאגנט: להוסיף 1 μL של 50 mM forskolin כדי 199 μL של חוצץ. זה יפיק ריכוז סופי של forskolin של 50 מיקרומטר כאשר נוסף לתאים שהוכנו עם 800 μL של חוצץ. 1 μL של DMSO ב 199 μL של חוצץ צריך גם להיות מוכן לשמש כשליטת רכב.
   הערה: במחקרים אלה, forskolin משמש מפעיל אדניל ציקלאז כדי לעורר ייצור המחנה. אם תרצה, מתודולוגיה זו יכולה להשתנות בקלות כדי לאפשר טיפול עם ריאגנטים חלופיים לגירוי או עיכוב אדניל ציקלאז, פוספודיזטראזים וכו '.

2. רכישת תמונות

1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בגלאי ספקטרלי.
   הערה: כל שלבי רכישת התמונות המתוארים כאן פותחו באמצעות מערכת מיקרוסקופ ניקון A1R זמינה מסחרית. ייתכן שיהיה צורך להתאים שלבים אלה אם משתמשים במיקרוסקופ ספקטרלי חלופי. ודא כי כל הציוד מופעל לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להגיע לתנאי הפעלה יציבים.
2. בחר את המטרה טבילת מים 60x ולהוסיף טיפת מים למטרה.
   הערה: להדמיה של תאים חיים ברזולוציה גבוהה, מומלץ להשתמש במטרה צמצם מספרי גבוה. עיין ברשימת החומרים לקבלת מידע אודות המטרה המשמשת במחקרים אלה.
3. הנח את תא התא הטעון (משלב 1.7) על שלב המיקרוסקופ.
4. בחר את המסנן DFT (DAPI/FITC/TRITC) שהוגדר על-ידי כוונון ידית המסנן בצד ימין של המיקרוסקופ.
5. הפעל את המיקרוסקופ במצב פלואורסצנטיות רחבת שדה באמצעות העינים כדי לבחור שדה תצוגה המכיל תאים המבטאים את חיישן FRET המחנה.
   הערה: ודא שהעוצמה הממוצעת של אות FRET באורך הגל של שיא פליטת התורם או המקבל בתא הנבחר היא לפחות 100 יחידות עוצמה (A.U.) או לפחות פי 4 מהאות הבסיסי של אזור ללא תאים מתבטאים. ניתן לאשר זאת באמצעות מציג פרופיל הספקטרום הזמין בתוכנת רכיבי NIS. כאשר מחפשים תא עם אות טוב, מומלץ להשליך תאים בהירים מדי (הם עלולים להיות בסכנה).
6. פתחו תוכנת NIS, עברו למצב קונפוקל, פתחו את כפתור ההשתלבות בלייזר ולחצו על Live.
7. השתמש בידית המוקד כדי להתמקד בתאים על-ידי התבוננות בתצוגה המקדימה על המסך.
8. קבע תצורה של הגדרות התקן, רכישה וערימת z בתוכנה, כמתואר להלן.
9. הגדרות רכישה:
   הערה: ניתן להחיל הגדרות רכישת מצלמה והתקן באמצעות תמונה שנרכשה בעבר. פתח את התמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר 'שימוש חוזר בהגדרות המצלמה'.
   1. פתח את תפריט הגדרות A1, סמן את התיבות המתאימות לקווי לייזר של 405 ננומטר ו- 561 ננומטר, בחר SD לגלאי ספקטרלי, בחר 10 לרזולוציה ו- 31 לערוצים.
      הערה: תפריט הגדרות A1 מוצג כסמל גלגל שיניים קטן בפינה הימנית העליונה של חלון הגדרות A1 Plus. לייזר 405 ננומטר משמש להתרגשות תורמים ולייזר 561 ננומטר משמש לתסיסת גרעינית.
   2. הגדר את טווח אורך הגל (410 - 730 ננומטר) על-ידי בחירת ערכי אורך גל התחלה וסיום.
   3. לחץ על סמל binning/skip בתפריט הגדרות A1 ובחר בתיבה ממוספרת 15 ולאחר מכן לחץ על אישור בתפריט הגדרות A1.
      הערה: זה כדי להסיר את ערוץ אורך הגל המתאים לייזר עירור 561 ננומטר (זה בדרך כלל ערוץ אורך^הגל 15). חשוב לא להשתמש בפס אורך הגל הזה כדי למנוע אות נמוך באופן מלאכותי, אשר יכול ליצור חפץ ספקטרלי. האות נמוך יותר ברצועה זו בגלל האצבע המכנית המכסה את אלמנט הגלאי כדי להגן עליו מפני נזק לייזר.
   4. הגדר את עוצמות הלייזר ל- 8% ו- 2% עבור לייזרי 405 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה, Si Hv (רווח גלאי) ב- 149, ורדיוס חור סיכה של 2.4 יחידות דיסק אוורירית (AU).
      הערה: ייתכן שיהיה להתאים את עוצמות הלייזר בהתאם לגיל המכשיר ומצב הלייזרים. אם התאמת עוצמות לייזר בין דגימות שונות או קבוצות ניסוי, חשוב לשמור על אותו יחס של עוצמות לייזר (למשל, 8:2). בנוסף, חשוב לבחור בעוצמת לייזר שאינה כה בהירה עד כדי יצירת ליבנה מהירה. יש להתאים את רווח הגלאי כדי למקסם את עוצמת האות תוך מזעור רעש הגלאי. עבור מחקרים אלה, רווח של 149 שימש. גודל חור סיכה של 2.4 AU נבחר כאיזון בין רכישת תמונות עם יחס אות לרעש מספיק (SNR) לבין שמירה על חתך אופטי (confocality). עלייה בגודל חור הסיכה מגדילה את SNR אך מקטינה את הקונפוצליות.
   5. הגדר את מהירות הסריקה ל- 0.25 מסגרות ספקטרליות לשניה, בחר את הסמל המתאים ל- חד-כיווני לכיוון הסריקה, הזן 4 לספירה והגדר 1024 x 1024 עבור גודל הסריקה.
      הערה: אותות FRET חלשים, ומהירות סריקה איטית נדרשת לעתים קרובות. באמצעות מהירות סריקה של 0.25, רכישת מחסנית z ספקטרלית הושלמה בתוך ~ 3 דקות. מהירות הסריקה יכולה להיות מוגברת או מופחתת בהתאם פלואורופורים בשימוש. לדוגמה, עבור פלואורופורים בהירים יותר כמו eGFP, ניתן להשתמש במהירות סריקה מהירה יותר (2 פריימים לשנייה). המספר שהוזן תחת ספירה תואם למסגרת המהווה ערך ממוצע של 4, המסייע בהפחתת רעש במהלך רכישת תמונה. עבור דוגמאות יציבות מאוד והיכן שהזמן אינו אילוץ, ניתן להשתמש בערכי ממוצע גבוהים יותר (עד 16) כדי להשיג תמונות עם SNR משופר.
10. הגדר פרמטרי רכישת z-stack:
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הערכים שהוזנו בשלבים 2.10 כדי להתאים לשינויים בכריכה או בריכוז של תוויות פלואורסצנטיות, סוג התווית, מספר התוויות בהן נעשה שימוש, קו התא ושינויים אחרים בהכנת הדגימה שעשויים להשפיע על צפיפות תיוג התאים ו/או על הפלואורסצנטיות הסלולרית. בעת התאמת פרמטרי הרכישה, יש לנקוט זהירות כדי להשיג SNR מספיק תוך מזעור ההלבנה. בנוסף, בעת קביעת התצורה של בדיקה FRET ספקטרלי, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי הפרמטרים לעבוד היטב על פני כל קבוצות הטיפול. מומלץ להפעיל ניסוי של כל קבוצת טיפול עם הגדרות הפרמטר המוצעות כדי להבטיח כי SNR מספיק והלבנת תמונות ממוזערת.
    1. פתח את חלון הרכישה של ND על-ידי לחיצה על תצוגה → בקרת רכישה → רכישת ND.
    2. הזן את הנתיב/היעד ואת שם הקובץ כדי לשמור את קובץ ND בחלון המוקפץ.
    3. סמן את התיבה המתאימה לסדרת z.
    4. לחץ על חי בחלון הגדרות A1 פלוס. פעולה זו תפתח חלון צפייה חי.
    5. התאם את ידית המוקד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק העליון של התא ולחץ על עליון בחלון הרכישה של ND כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כחלק העליון.
       הערה: מומלץ להתמקד מעט מעל החלק העליון של התא כדי להבטיח שכל התא נדגם בסידרת z.
    6. התאם את ידית המוקד במיקרוסקופ כדי לבחור את החלק התחתון של התא ולחץ על Bottom בחלון הרכישה של ND כדי להגדיר את המיקום הנוכחי כתחתית.
       הערה: התמקד מעט מתחת לתחתית התא כדי להבטיח שכל התא יידגם.
    7. הזן 1 מיקרומטר עבור גודל שלב, בחר בחלק העליון התחתון עבור כיוון סריקת z ולחץ על הפעל בחלון רכישת ND כדי להשיג מחסנית z.
       הערה: גודל השלב קובע את מספר פרוסות z שנרכשו בהתאם למיקומים העליונים והתחתונים (כלומר, המרחק שעבר). גודל שלב של 1 מיקרומטר נבחר כפשרה בין מהירות הדמיה, דגימת ציר z והלבנת תמונות. באמצעות קוטר חור הסיכה הקונפוקל של 2.4 AU ואת המטרה טבילת מים 60x הביא עובי סעיף אופטי של 1.73 מיקרומטר. לפיכך, גודל שלב 1 מיקרומטר הוא מעט מתחת קריטריוני הדגימה Nyquist, אבל זה פשרה שנעשתה כדי להפחית את הזמן הדרוש כדי לרכוש z-מחסנית. עבור דגימות יציבות מאוד, אשר מהירות אינה קריטית, צעד קטן יותר z-ציר ואולי קוטר חור קונפוקלי קטן יותר עשוי לשמש כדי להגדיל את רזולוציית ציר z. החלק התחתון אמור להניב תוצאות דומות וניתן להשתמש בו כדי להעריך את כל ההשפעות של ליחתום תמונות שעלולות להתרחש במהלך סריקת z.
11. הגדר את מערכת המיקוד המושלמת (PFS) אם היא זמינה:
    הערה: PFS מאפשר למערכת לפצות על תנודות בעומק המוקד במהלך רכישת תמונה. ניתן להשתמש בשלבים הבאים כדי להגדיר PFS, וצעדים אלה עשויים להשתנות מעט בהתאם לגירסת ניקון A1R ולגרסת רכיבי NIS בהם נעשה שימוש.
    1. סמן מצב סימטרי המוגדר על-ידי סמל הטווח בחלון הרכישה של ND.
    2. הפעל את לחצן PFS על הפנים הקדמיות של המיקרוסקופ (ודא שידית המראה הדיכרואית הממוקמת במקטע שמתחת לשלב המדגם היא 'ב').
    3. הגדיר מחדש את החלק העליון (סובב נגד כיוון השעון) והתחתון (סובב בכיוון השעון) באמצעות הידית בחזית של בקר היסט PFS.
    4. הגדר מיקום z/z יחסי על-ידי לחיצה על 'יחסי' בחלון הרכישה של ND.
    5. לחץ על זיכרון על הפנים הקדמיות של המיקרוסקופ, כך שהתוכנה תשנן את עומק z היחסי.
12. לאחר השלמת רכישת z-stack, הוסיפו בעדינות את ריאגנט הרצוי (forskolin או בקרת רכב) באמצעות פיפטה והמתינו 10 דקות.
    הערה: הוסף את ריאגנט בעדינות רבה כדי לא להפריע לתאים או להזיז את המיקום של תא התא בתוך שלב המיקרוסקופ XY; מומלץ לוודא בתצוגה חיה או בתמונה שלאחר מכן ששדה הראייה לא השתנה במהלך הוספת ריאגנט. זמן ההמתנה של 10 דקות הוא שהטיפול בסלקולין ייכנס לתוקף. אם נעשה שימוש בטיפול אלטרנטיבי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן ההמתנה.
13. לאחר 10 דקות, שנה את שם הקובץ ולחץ על הפעל בחלון הרכישה של ND.
14. חזור על שלבים 2.11 – 2.13 כמפורט לעיל עבור לפחות 5 כיסויים כדי להשיג תוצאות מספיקות לניתוח סטטיסטי (n = 5 עבור כל קבוצת טיפול – forskolin ובקרת רכב).
15. הכן דוגמאות וריק מדגם כדי לבנות את הספריה הספקטרלית ולרכוש תמונות ספקטרליות באמצעות הגדרות רכישה דומות כפי שמתואר בשלבים 2.9 ו- 2.10.

3. ניתוח תמונה

הערה: תמונות אלה ישמשו לבניית ספרייה ספקטרלית המכילה את הספקטרום הטהור של כל הבאים הבודדים הקיימים במחקר. המברים הסופיים בספרייה הספקטרלית עשויים להשתנות ממחקר למחקר אם משתמשים בפלואורופורים שונים. הליך מפורט לבניית הספרייה הספקטרלית מסופק בקובץ מידע משלים בשם "ספריית File_Spectral משלימה". כאן, אנו מתארים ייצוא נתונים לקבצים .tiff, ביטול ספקטרלי ליניארי, מדידות יעילות FRET, שחזור תלת מימדי ואומדן רמות המחנה. ניתוח תמונה יכול להתבצע באמצעות ניתוח תמונות ופלטפורמות תכנות שונות כגון ImageJ, פייתון, MATLAB או CellProfiler. במחקרים אלה, סקריפטים MATLAB שימשו.

1. יצא נתוני תמונה:
   1. צור תיקיות חדשות עם אותו שם קובץ המתאים לתמונות הערימה z הספקטרליות שנרכשו בשלבים 2.13 ו- 2.14.
      הערה: השלבים הבאים המתוארים לייצוא נתונים ספציפיים עבור רכיבי NIS AR גירסה 4.30.01. שלבים אלה עשויים להשתנות מעט בהתאם לגירסת התוכנה.
   2. לחץ על קובץ, שיפתח חלון קובץ. עיין ובחר את קובץ התמונה הספקטרלי שנרכש בשלב 2.12 ולחץ על פתח.
   3. לאחר טעינת הקובץ, לחץ על קובץ→ ייבוא/ייצוא→ ייצוא מסמך ND.
   4. בחלון המוקפץ: עיין ובחר את התיקיה שנוצרה בשלב 3.1.1, בחר תבנית תמונה מתויגת (TIF) עבור סוג קובץ ולאחר מכן בחר תמונת מונו עבור כל ערוץ ושמור על עומק סיביות.
      הערה: קידומת הקובץ תיווצר מראש; שנה ערך זה לנוחות. סדר האינדקס ישתנה בהתאם לערוצים שנבחרו, ועליו להציג "z, c" עבור יצירת אינדקס לפי מיקום z-slice תחילה ומספר רצועת אורך גל שני. ודא שהתיבות המתאימות להחלת LUTs או להוספת שכבות-על או לשמות נקודות שימוש לא נבחרו.
   5. לחץ על יצא כדי לייצא את קבצי ה- tiff לתיקיית יעד כקבצי tiff בודדים.
   6. חזור על שלבים 3.1.2 – 3.1.5 כדי לייצא קבצי תמונה ספקטרליים שנרכשו בשלב 2.13.
2. ביטול ספקטרלי ליניארי:
   1. פתח את תוכנת התכנות.
      הערה: סקריפט תכנות שפותח בהתאמה אישית כדי לבטל את ה- unmix תמונות ספקטרליות גולמיות מסופק באתר האינטרנט של אוניברסיטת דרום אלבמה BioImaging ו- BioSystems, תחת הכרטיסיה משאבים (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
   2. פתח את הקובץ שכותרתו "ביטול מיקסינג ליניארי.m" ולחץ על לחצן ההפעלה בסרגל הכלים של העורך.
   3. עיינו ובחרו את התיקיה המכילה את רצף הקבצים המיוצא *.tif שנוצר על ידי תוכנת NIS Elements.
   4. לחץ על אישור כדי להמשיך, אשר יפתח חלון חדש בשם אורך גל ו Z-Slice.
   5. העתק את שם הקובץ של הקובץ הראשון (ללא z-slice ומספר ערוץ) בתיקיה שנבחרה בשלב 3.2.4 והדבק אותו בשלב הראשון של תיבת הדו-שיח שכותרתה "הזן את שם התמונה".
   6. הזינו את מספר הערוצים בשלב השני שכותרתו "הזן את מספר רצועות אורך הגל", מספר פרוסות z בשלב השלישי שכותרתו "הזן את מספר פרוסות Z" ולחץ על אישור.
      הערה: מספר רצועות אורכי הגל עשוי להשתנות אם מתבצעים שינויים בהגדרות הרכישה, כגון התאמת טווח אורך הגל או גודל צעד אורך הגל. מספר פרוסות Z עשוי להשתנות גם בהתאם לגובה התא.
   7. עיין ובחר את קובץ אורך הגל בשם "Wavelength.mat" בחלון המוקפץ שכותרתו "בחר את קובץ המידע אורך הגל" ולחץ על פתח.
   8. עיין ובחר בקובץ "Library.mat" בחלון המוקפץ החדש שכותרתו "בחר את קובץ הספריה הספקטרלית", לחץ על פתח והמתן עד לסיום ביטול ה- Slicexing של הפרוסות.
      הערה: קובץ Library.mat הוא קובץ המכיל ספקטרום טהור עבור כל פלואורופור endmember יחד עם autofluorescence התא וחתימות ספקטרליות רקע. במקרה זה, פלואורופור סוף השנה כוללים טורקיז, ונוס ו- DRAQ5. חתימות ספקטרליות ברקע כוללות פלואורסצנטיות תאית או מטריצה, פלואורסצנטיות מכסה, וכיסוי עקיפה. קובץ Wavelength.mat הוא קובץ המכיל מידע ערוץ אורך גל המשמש לרכישת התמונה הספקטרלית. קובץ ספריה לדוגמה וקובץ אורך גל זמינים באתר Bioimaging ו- Biosystems (ראה את הפתק מתחת ל- 3.2.1). לקבלת מידע נוסף על אופן יצירת ספריה ספקטרלית וקבצי אורך גל, עיין בקובץ מידע משלים בשם "ספריית File_Spectral משלימה". תמונות לא מעורבות המתאימות לכל פרוסת z יישמרו בתיקיה הנקראת "לא מעורב" שנוצרה במהלך תהליך ביטול המיקסם בתוך התיקיה שנבחרה בשלב 3.2.3.
3. חישוב יעילות FRET:
   1. פתח את קובץ ה- Script של התוכנית הנקרא "multiFRRCF.m" ולחץ על הפעל.
      הערה: קובץ תכנות זה זמין מאתר הביואימציה והביו-מערכות של אוניברסיטת דרום אלבמה (ראה הערה בשלב 3.2.1).
   2. הזן את מספר הניסויים הניסיוניים שיש לנתח בתיבת הדו-שיח המוקפצת הנקראת "כמה תיקיות לריס" ולחץ על אישור.
      הערה: יש לשמור נתוני תמונה מכל ניסוי בתיקיית תמונה נפרדת שאינה מעורבת. שלב זה פשוט מאפשר לקוד הניתוח לעבור בלולאה על תיקיות רבות כשלב לחיסכון בזמן.
   3. עיין ובחר את התיקיות הלא מעורבות ולחץ על אישור.
      הערה: מספר הפעמים שהחלון המוקפץ "חפש תיקיה" נפתח תלוי במספר שהוזן בתיבת הדו-שיח "כמה תיקיות לריסים" בשלב הקודם. עיין ובחר את התיקיות אחת אחרי השנייה.
   4. בחלון המוקפץ החדש, הזן את המידע הבא בתיבות המתאימות: גורם קנה המידה הוא 12.4, הסף הוא 5.6, X, Y ותדירות Z הם 5, 5 ו- 1 בהתאמה, ואלגוריתם ההחלקה הוא גאוס.
      הערה: גורם קנה המידה הוא ערך בפיקסלים/מיקרומטר וישמש לשינוי קנה המידה של דגימת כיוון Z לזו של כיוון XY. גורם קנה המידה מתקבל מגודל פיקסל התמונה, המסופק בדרך כלל כמטא-נתונים בתמונה עבור רוב מערכות המיקרוסקופ הקונפוקליות. לדוגמה, אם התמונה נרכשת עם מרווח של 0.08 מיקרומטר/פיקסלים, גורם קנה המידה צריך להיות 12.5 פיקסלים/מיקרומטר. ערך הסף ישמש לסף התמונות וליצור מסיכה בינארית של התא. יצרנו רשימה של ערכים אופטימליים המבוססים על עוצמת התורם+מקבל התמונות. השתמש ב- 4.5 כערך סף אם לתמונה יש עוצמת תורם+קבלה בהירה ורקע נמוך, ערך בין 5.6 ל- 6.5 עבור תמונות בעלות עוצמת תורם+קבלה מתונה בלבד ו/או רקע גבוה יותר, וערך של 7.5 ומעלה עבור תמונות בעלות עוצמת תורם+מקבל נמוכה מהרקע. ערך התדירות מתאים למרווח, במספר הפיקסלים, שבו הניקוד מתבצע בשלבים הבאים. לדוגמה, אם עומק Z של התא הוא 17 מיקרומטר עם גודל של 1 מיקרומטר שלב ומקדם קנה מידה של 12.5 פיקסלים/מיקרומטר משמש בכיוון XY, עומק ערכת הנתונים של התמונה התלת-ממדית יידגם מחדש ב- 212 פיקסלים (כיוון Z). בהתבסס על ערך תדר Z שהוזן (לדוגמה, פיקסל אחד), ערכת נתוני התמונה התלת-ממדית תיחתך מחדש החל מראש ערכת נתוני התמונה ולאחר מכן תעבור במרווחים של פיקסל אחד כלפי מטה. התוצאה היא 212 תמונות שנמסרו. אם הוזנו מרווח זמן גדול יותר של ערך תדר עבור תדר Z, ייווצרו פחות תמונות עם שרידים. תמונות שנחסכות נשמרות בשלבים הבאים.
   5. לחץ על הפעל והמתן עד לביצוע כל מדידות FRET והשרידים.
      הערה: תיקיה נפרדת נוצרת בספריית האב שאליה נשמרות תמונות יעילות FRET בגווני אפור ותמונות יעילות FRET צבעוניות (מפת צבעים מוחלת). לדוגמה, כל תמונות FRET בגווני אפור ובמפות צבע השזורות בכיוון X (מישור YZ) נשמרות בתיקיה הנקראת "Resliced_XFRET".
   6. חזור על הניתוח עם הגדרות דומות לכל הניסויים – לפני ואחרי טיפולי forskolin ובקרות רכב.
      הערה: שלבים המוזכרים בסעיף 3.3 מתארים את הערכים שיש להזין עבור קובץ ה- Script של תיכנות ניתוח FRET מותאם אישית כדי ליצור נתוני תמונה תלת-ממדיים של FRET. עם זאת, סקריפט זה מבצע מספר פעולות במהלך הפעלה, כולל: טעינת נתוני תמונה, יצירת ערימות תמונה, החלקה, חישובי יעילות FRET, יצירה והחלה של מסיכת גבול תא, שחזור תמונה תלת-ממדי, הוספת תמונות תלת-ממדיות במרווחי זמן שצוינו (תדרים), החלת מפת צבעים להמחשה חזותית של שינויי FRET ושמירת נתוני התמונה שהוחזרו לאותה ספריה. פרטים נוספים נכללו כהערות בקובץ ה- Script של התוכנית.

4. מיפוי יעילות FRET לרמות המחנה

1. פתח את קובץ התיכנות בשם 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' ולחץ על הפעל בחלון הראשי.
   הערה: הקובץ זמין באתר BioImaging ו- BioSystems (ראה הערה מתחת ל- 3.2.1). קובץ זה קורא תמונות יעילות FRET בגווני אפור וממיר אותן לרמות המחנה בהתבסס על עקומה אופיינית. עקומה אופיינית זו משתמשת בקשר גומלין של המחנה לפראט המתועד בספרות^15,36 המתואר על-ידי משוואת היל (המשוואה השלישית המוצגת להלן). עם זאת, K_d של הבדיקה בתאים שלמים קשה להעריך והנחנו שזה יהיה 1 μM בחישובים שלנו. לפיכך, התוצאות מוצגות כפונקציה של K_d. (כלומר, [amp] = x* K_d). משוואות המשמשות למדידת יעילות FRET ומיפוי FRET לרמות המחנה מוצגות להלן:
   
   כאשר E הוא יעילות FRET, _{ו- d נראה לעין} הם עוצמות פיקסלים לא מעורבות של תמונות קבלה ותורם, בהתאמה.
   Q_a ו- Q_d הם תשואות קוונטיות של מקבל ותורם. שים לב ש- Q_a ו- Q_d מתבטלים כאשר המשוואה עבור k^λ משולבת במשוואת היעילות FRET, kλ הוא גורם^תיקון:
   
   והם מקדמי הכחדה של תורם ומקבל באורך גל עירור התורם, i (405nm).
   
   E הוא יעילות FRET ו- K_D = קבוע דיסוציאציה = 1 מיקרומטר.
2. נווטו ובחרו בתמונת FRET הראשונה בקנה מידה אפור (שנשמרה בשלב 3.3.5) ולחצו על הלחצן 'אשר'.
3. פתח את תמונות FRET/cAMP כדי לבדוק את התפלגות אותות המחנה בשלושה ממדים.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגישות הדמיה וניתוח FRET היפרספקטרליות למדידת שיפועי המחנה בשלושה ממדים מרחביים בתאים חיים. ישנם מספר שלבים מרכזיים המעורבים ביצירת תוצאות אלה, שעבורם נדרשת תשומת לב זהירה בעת ניתוח וכימות הנתונים. צעדים מרכזיים אלה כוללים בניית ספריה ספקטרלית מתאימה, ביטול ספקט...

Discussion

הפיתוח של BIOSENSors FRET אפשר מדידה והדמיה של אותות נוקלאוטיד מחזורי בתאים בודדים, ויש הבטחה גדולה לדמיין אירועי איתות תת תאיים^13,22,37,38. עם זאת, השימוש בביו-סנסורים FRET מציג מספר מגבלות, כולל מאפייני אות לרעש נמוכים של כתבי FRET מב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A7816	Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution	Thermo Scientific	62252	Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F6178	Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin	Sigma	F3917	Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	Gift	Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J	image.net	Free download	Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural	Invitrogen	23017-015	Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000-015	Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB	Mathworks	R2019a	Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope	Nikon Instruments	Nikon A1R	Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	Software dongle	used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)	In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama	Isolated from Rat pulmonary microvasculature	PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides	Clay Adams	3010	Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36961	If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer	Made in-house	Made in-house	Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3506	Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips	Fisher Scientific	12545102	Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	water immersion and commonly used objective for cells