ניתוח ניקוד שיטתי עבור דלקת מעיים במודל קוליטיס נתרן סולפט הנגרמת על ידי מורין

Summary

ניקוד שיטתי של דלקת מעיים באמצעות מערכת חופשית בסיוע מחשב הוא כלי רב עוצמה להשוות כמותית שינויים היסטופטולוגיים במודלים קוליטיס המאופיינת על ידי נוכחות של כיבים ושינויים דלקתיים. הערכת ניקוד קוליטיס היסטולוגית מחזקת תצפיות קליניות ומאפשרת פרשנות נתונים.

Abstract

מודלים קוליטיס מורין הם כלים כי הם מועסקים בהרחבה במחקרים התמקדו בהבנת הפתוביולוגיה של הפרעות מעיים דלקתיות. עם זאת, סטנדרטים חזקים לכימות אובייקטיבי וניתן לשחזור של חומרת המחלה נשארים מוגדרים. רוב שיטות ניתוח קוליטיס מסתמכות על ניקוד היסטולוגי מוגבל של מקטעים קטנים של המעי, מה שמוביל לניתוחים חלקיים או מוטים. כאן, אנו משלבים רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח אורך של המעי הגס כולו כדי לכמת פגיעה במעיים וכיב במודל דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) המושרה של קוליטיס מורין. פרוטוקול זה מאפשר יצירת תוצאות אובייקטיביות ושחזוריות ללא הכשרה נרחבת של המשתמש. כאן, אנו מספקים פרטים מקיפים על הכנת מדגם וניתוח תמונה באמצעות דוגמאות של נתונים של קוליטיס המושרה DSS. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות מודלים אחרים של קוליטיס מורין כי יש דלקת משמעותית הקשורים לפגיעה הרירית. אנו מראים כי השבר של רירית מודלקת/פצועה ושחוקה/כיבית ביחס לאורך המלא של המעי הגס מקבילה באופן הדוק לממצאים קליניים כגון ירידה במשקל בין התקדמות המחלה הנגרמת על ידי DSS. פרוטוקול היסטולוגי זה מספק זמן אמין וסיוע חסכוני לתקנן ניתוחים של פעילות המחלה בצורה לא משוחדת בניסויי קוליטיס DSS.

Introduction

מחסום האפיתל במערכת העיכול ממלא תפקיד מרכזי בהפרדת אנטיגנים ופתוגנים לומינליים מתאי הרקמות הבסיסיים¹. פגיעה אפיתל ופצעים ריר לראות בתנאים פתולוגיים כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD), איסכמיה, או פציעה כירורגית קשורים עם תסמינים קליניים הכוללים שלשולים, ירידה במשקל, דם בצואה, וכאבי בטן. בתגובה לפציעה, תאי אפיתל נודדים ומתרבים כדי לאפיתל מחדש ולתקן פגמים במחסום הרירית. רזולוציה של דלקת והחזרת שלמות הרירית חיוניים להקמה מחדש של הומאוסטזיס הרירית במעיים ולתפקד^2,3,4.

מודלים שונים של בעלי חיים שימשו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים הקשורים לפגיעה במחסום האפיתל במעיים. מודלים מבוססים היטב וישימים בקלות של קוליטיס המושרה כימית נמצאים בשימוש נרחב, במיוחד במחקרים הקשורים לפגיעה דלקתית כגון מחלות מעי דלקתיות. דגם קוליטיס מורין נפוץ, ניתן לשחזור ואמין מעסיק נתרן גופרתי (DSS) בתיווך פגיעה במעי הגס ודלקת. חומרת המחלה משתנה בהתאם לזן העכבר, מינון של DSS, אורך ניהול DSS, ומשקל מולקולרי של DSS^5,6,7.

נזק ריר מעיים במהלך קוליטיס DSS מוערך בדרך כלל באמצעות מדד פעילות המחלה (DAI), ציון מרוכב שנקבע על ידי ירידה במשקל, תוכן דם צואה, ועקביות צואה. תכולת הדם בצואה יכולה להיות מיקרוסקופית (מזוהה באמצעות בדיקת חומצה guaiac צואה) או מקרוסקופי; עקביות צואה מסווגת קשה, רך, או נוזלי (כלומר, שלשול)^5,8. ניקוד של פרמטרים קליניים אלה יכול להיות סובייקטיבי ועשוי להשתנות בהתאם לניסיון של המשתמש והטיה, אם כי בסך הכל, הנתונים מספקים מידע אמין ולכן נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרי IBD. לעומת זאת, אין שיטה מקובלת להערכה היסטולוגית של נזקי ריר. לרוב, אזורים נבחרים של המעי הגס נבדקים על ידי פתולוג מיומן וציון בהתבסס על מספר פרמטרים הכוללים בדרך כלל פגיעה בקריפטה וחדירת לויקוציטים^9,10,11. עם זאת, מכיוון שמספר הפרמטרים שנחקרו וכמות הרקמות שנותחו משתנה במידה ניכרת בין דוחות בודדים, ההסתגלות של מחקרים רבים שפורסמו מוגבלת. כדי להפחית את הטיית הצופה ולשפר את הקונקורדנציה הבין-מחקרית, פרוטוקול ניקוד היסטולוגי אידיאלי צריך: 1) לכלול את כל אורך המעי הגס, שכן דלקת הרירית במעיים היא לרוב משתנה ולדלג על נגעים נפוצים, 2) להגביל ניתוח לפרמטרים ספציפיים מפתח קל לפרשנות כדי להפחית את הסובייקטיביות, 3) להקל על עיבוד מהיר ועקבי של מספר גדול של דגימות, ו 4) להשתמש בכלים זמינים ובמחיר סביר נרחב לרכישת נתונים, ניתוח ומצגת.

כאן אנו מתארים טכניקה לעבד את המעי הגס כולו או קטעים ארוכים של המעי הדק בתצורת "רול שוויצרי" יחד עם השימוש במערכת ניקוד בסיוע מחשב חינם כדי לנתח דלקת ריר מעיים ונזק בגלל קוליטיס הנגרמת על ידי DSS.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת מישיגן לשימוש וטיפול בבעלי חיים.

1. קציר רקמות

1. המתת חסד עכברים באופן אנושי באמצעות הרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו. עבור כל הניסויים בבעלי חיים, האישור התקבל על ידי ועדת בדיקה מוסמכת בהתאם להנחיות הלאומיות והמוסדיות לטיפול בבעלי חיים.
2. הנח את העכבר על משטח ניתוח במצב על-חושי. לשתק את גפיים העכבר באמצעות 20 G x 1 1/2 אינץ' G מחטים.
3. באמצעות מלקחיים ומספריים, לעשות חתך קטן על עור הבטן ולמשוך אותו לצד כדי לחשוף את הצפק.
4. פתח את חלל הבטן עם חתך קו האמצע בצפק מעצם הערווה לצדי הבטן.
5. בזהירות להסיר רקמות ואיברים עד המעי הגס הוא דמיון. חותכים את עצם האגן משני צידי המעי הגס כדי לדמיין באופן מלא את האיבר, המשתרע מפי הטבעת לכיוון cecum.
6. בעדינות להסיר שומן, ורידים קטנים ועורקים המחוברים המעי הגס, תוך ניתוח זהיר של האיבר, חיתוך רק קרוב לפי הטבעת ופשוט distal כדי cecum.
   הערה: המעי הגס המנותח צריך להישאר בטמפרטורת החדר תוך השלמת הליך רול שוויצרי.
7. בזהירות לשטוף את המעי הגס עם 1x PBS, באמצעות מחט gavage פלסטיק גמיש מוכנס דרך פי הטבעת כדי להסיר תוכן צואה.
8. מקמו את המעי הגס בקו ישר, ופתחו לאורך העורק המזנטרי. חוצה את המעי הגס לאורך זמן מהדיסטלי לקצה הפרוקסימלי(איור 1A). מחצית אחת של הרקמה יכולה לשמש לניתוח היסטולוגי ואילו השני יכול להיות מעובד עבור כתם מערבי, PCR או התגלגל לתוך גליל שוויצרי שני עבור מיקרוסקופיה קפואה טרי¹².

2. הכנת לחמניות שוויצריות

1. לקצץ רקמה נוספת מן המעי הגס proximal באמצעות סכין גילוח עד בערך באותו רוחב לאורך המעי הגס כולו מתקבל.
2. ליישר את המעי הגס כדי לחשוף את לומן פונה כלפי מעלה, ולשטח את הרקמה לחלוטין באמצעות מחט gavage גמיש. הוסף עוד PBS, במידת הצורך, כדי לשמור על הרקמה לחה לאורך כל ההליך.
3. הסר את עודף PBS באמצעות ניגוב נייר. עם מזרק ומחט gavage, להוסיף 10% ניטרלי אגירה פורמלין פתרון על הרקמה במשך 2-3 דקות כדי לתקן ולשטח את הרקמה.
4. השתמשו במלקחיים ישרים כדי לתפוס את קצה המעי הגס הדיסטלי ולסובב את המעי הגס לעיגולים קונצנטריים מהסופה הדיסטלית לקצה הפרוקסימלי (איור 1B).
   הערה: ניתן לדחוף בחזרה את החלק הפנימי של הגליל השוויצרי תוך כדי גלגול באמצעות האבן כדי להבטיח את הרקמה היא בתוך הגליל.
5. הכנס מחט 27 G כדי להצמיד את המעי הגס באמצע כדי להחזיק את צורת הגליל השוויצרית שלו (איור 1C).
6. מניחים את הגליל השוויצרי עם המחט לתוך קלטת הטמעה בתוך מיכל דגימה היסטולוגית.
   הערה: יש לכוון את הרקמה במקביל לקלטת לפני הקיבעון (איור 1D).
7. לתקן את הרקמה בתמיסת פורמלין אגירה ניטרלית 10% לילה ב 4 °C⁽⁷⁰°F 13 ).
8. לאחר קיבוע לילה, לשטוף את הרקמה 3x עם PBS.
9. מוסיפים 70% אתנול לרקמה לפני תהליך הטמעת הפרפין. הסר את המחט מן הגליל השוויצרי לפני שתמשיך. רקמה ניתן לאחסן אתנול בטמפרטורת החדר עד הטבעה פרפין¹³.
10. הניחו דגימות במעבד הרקמות, הטמיבו בפרפין והכינו 4 מקטעי מיקרומטר, המותקנים על שקופיות מיקרוסקופיות טעונות חיובית (איור 1E). זו יכולה להיות נקודת עצירה אופציונלית.
    הערה: כיוון רקמות תקין הוא קריטי להשגת מקטעים המתאימים לניתוח תמונה. הטמעת גליל שוויצרי מקביל בקלטת הפרפין תגרום למקטעים מלאים המתאימים לניתוח תמונה (איור 1F-1H). יש להימנע ממקטעים אלכסוניים כדי למנוע מקטעים לא שלמים (איור 1I-1K). לקבלת פרטים נוספים, עיין בסעיף דיון.
11. כתמים עם המטוקסילין ואאוסין (H&E)¹³.

3. סריקה וניתוח דיגיטליים

הערה: להערכה מדויקת של שינויים ריר, בחר רק מקטעים הכוללים לפחות 90% מאורך המעי הגס הכולל.

1. סרוק מקטעים מוכתמים באמצעות סורק שקופיות או תמונה (ראה טבלת חומרים). תמונות המיוצרות זקוקות לרזולוציה של 0.25 מיקרון לפיקסל עם מטרה של פי 40 והגדלה של פי 40.
2. התקן והורד תוכנה מתאימה לניתוח דיגיטלי של שקופיות סרוקות (ראה טבלת חומרים).
3. פתחו תמונות סרוקות בתוכנת עיבוד התמונה (איור 2A). ודא שהמעי הגס כולו גלוי ושלא חסרים אזורים במדגם.
4. הפעילו את כלי Imager ו- Scale Bar כדי לזהות כראוי שקופיות סרוקות על-ידי לחיצה על Imager Label (איור 2A).
5. פתחו את כלי הביאורים בלחיצה על ביאורים,(איור 2A)ויצרו 3 שכבות שונות בלחיצה על שכבה חדשה (איור 2B)כדי לכמת את האורך הכולל של הגליל השוויצרי, דלקת/פציעה ושחיקה/כיב. בחרו צבע אחר לכל שכבה בלחיצה על 'צבע שכבה' (איור 2B).
6. מדדו את אורך כל שכבה/קטגוריה בלחיצה על הכלי עט (איור 2A),תוך שימוש ברירית השרירים כהפניה:
   1. הצג את התמונה בזום של 400 מיקרומטר (או יותר) כדי להקל על הדמיה נאותה של רירית השרירים.
      הערה: הגדלה נשלטת בקלות באמצעות גלגל הגלילה של העכבר ויהיה צורך לכוונן אותה לפי הצורך תוך כדי מעבר על פני המקטע כדי לצייר את כל הקווים.
   2. לחצו על הכלי עט כדי למתוח קו בעקבות רירית השרירים (איור 2A). הזז את המצביע לפי הצורך כדי להציג באופן חזותי את האזור הסמוך לניתוח.
      הערה: בכל פעם שהעט מופסק, ייווצר אזור שכבה חדש וקטן. ניתן להמחיש ולערוך אותו באמצעות הכרטיסייה אזורי שכבה (בחר מקטע רצוי ולחץ על מחק שכבה במקרה של טעויות או תיקונים, איור 2B).
7. לאחר הגדרת כל השכבות (איור 2C),יש לייצא את הנתונים באמצעות הלחצן 'ייצוא רשת לקובץ טקסט' בתוך אפשרויות אזורי השכבה (איור 2B).
   הערה: שמרו קבצים לעתים קרובות בשעת יצירת השכבות כדי להבטיח שהנתונים מאוחסנים כראוי.
8. פתח את קבצי הטקסט והעתק את הנתונים באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני. סה"כ את כל המקטעים מכל אזור וחשב את אחוז הפציעה והכיב ביחס לאורך הכולל.
9. כדי לחשב את ציון קוליטיס היסטולוגית (HCS) וכדי להעריך את חומרת המחלה, לשקול שלושה מאפיינים עיקריים כמפורט להלן.
   1. בדוק אם יש רירית מעיים בריאה המאופיינת בתאי אפיתל מאורגנים בציר הקריפטה-לומינלית, למינה פרופריה עם מעט תאי חיסון, ורירית שרירים תת-עורית המתממשקת לרירית ולתת-מוקסיה(איור 3A).
   2. בדוק אם יש דלקת/פציעה המאופיינת בקריפטות אפיתל מוחלשות או חסרות חלקית בתאי אפיתל ודלקת ריר עם חדירת נויטרופילים לקריפטות (איור 3B).
   3. בדוק אם יש נוכחות של שחיקה/כיב המאופיינת באזורים נטולי אפיתל פני השטח או באזורים שחסרים בהם לחלוטין קריפטות אפיתל עם או בלי לויקוציטים קשורים(איור 3C).
10. חשב HCS של אזורים פצועים וכיבים המבוטאים כאחוז מהאורך הכולל בנוסחה הבאה:
    
    הערה: HCS משלב את אחוז הדלקת/פציעה והשחיקה/כיב ומוסיף גורם של שניים לאחרון, בהתבסס על הנחה סבירה כי אובדן מוחלט של האפיתל גורם לאובדן מרבי של שלמות המחסום ומכאן מחלה גרועה יותר. HCS מייצג באופן עקבי את השינויים המורפולוגיים הנגרמים על ידי קוליטיס ניסיונית הנגרמת על ידי DSS. מעניין, לא ראינו מתאם ברור בין המספרים של אגרגטים לימפואיד המעי הגס או זקיקים וחומרת המחלה הקלינית קוליטיס DSS, ולכן, לא כללנו את הכימות בניתוח זה.
11. צלם תמונה של התמונות המייצגות (לחץ על תצלום בזק, איור 2A)ושמור. כלול סרגלי קנה מידה במידת הצורך על-ידי לחיצה על הצג/הסתר סרגל קנה מידה (איור 2A).

תוצאות

כדי להמחיש את האמינות של ניתוח ניקוד קוליטיס היסטולוגי זה בהקשר של נזק ריר לאחר אתגר DSS והתאוששות לאחר מכן קוליטיס, ניהלנו 2.5% DSS במי שתייה של שמונה עכברים מסוג C57BL6 זכר בן 10 שבועות במשך 5 ימים ואחריו תקופת התאוששות עם מים רגילים במשך 5 ימים. לא חל שינוי במשקל הגוף במהלך הניהול...

Discussion

מערכת הקוליטיס ההיסטולוגית שלנו מהווה כלי אמין לכימות דלקת רקמות ונזק במעי. גישה זו מספקת הבנה משופרת של המצב ההיסטופטולוגי של האיבר כולו ללא הטיה של בחירת אזורים קטנים או קטעים לא שלמים. בין הצעדים הקריטיים לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה ניתן למנות הכנה נכונה של לחמניות שוויצריות המאפשרות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning	Leica Biosystems	Aperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier	VWR International	56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg	GT Midwest	TL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles	Fisher scientific	14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors - ToughCut	Fine Science tools	11103-09
Bonn Strabismus Scissors - ToughCut	Fine Science tools	14084-09
Dumont #5 Forceps	Fine Science tools	11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea	Fisherbran	70% denatured ethyl alcohol
ImageScope	Aperio	Version 12.3.3.5039	http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: Sterile	Starplex Scientific	B120210
Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium	Corning	21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm	Instech	FTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in	BD (Becton, Dickinson and Company)	305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in	BD (Becton, Dickinson and Company)	305109
Syringe, 10 ml	BD (Becton, Dickinson and Company)	302995
Unisette Tissue Cassettes	Simport	M505-2