JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.

Abstract

הרעיון של טיפול בשילוב תרופות הופך להיות חשוב מאוד בעיקר עם עלייה דרסטית בהתנגדות לתרופות. לוח השחמט Quadruple, המכונה גם Q-checkerboard, שואפת למקסם את מספר השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד כדי למזער את הזמן והעבודה הדרושים כדי להשיג את אותן תוצאות עם פרוטוקולים אחרים. פרוטוקול זה מבוסס על טכניקת דילול מיקרו פשוט שבו התרופות מדוללות ומשולבים יחד בכמה צלחות 96-באר.

בסט הראשון של צלחות 96-באר, מרק מולר-הינטון מתווסף ואחריו התרופה הנדרשת הראשונה (למשל, Cefotaxime כאן) כדי לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר הצעד הראשון נעשה, קבוצה נוספת של צלחות 96-באר משמש כדי לדלל את התרופה השנייה (למשל, Amikaci), אשר יועברו על ידי הסרת נפח מסוים של תרופה 2 ולשים את בארות המקבילה בסט הראשון של צלחות 96-באר המכיל תרופה אחת. השלב השלישי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית (למשל, Levofloxacin), ללוחות המתאימים בסט הראשוני המכיל שילוב של תרופה 1 ו -2. השלב הרביעי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית (למשל, Trimethoprim-sulfamethoxazol) לתוך הצלחות המתאימות במערכה הראשונה. לאחר מכן, אי קולי ESBL אינוקולום חיידקי יהיה מוכן והוסיף.

שיטה זו חשובה כדי להעריך את כל השילובים האפשריים ויש לו מגוון רחב יותר של אפשרויות להיבדק יתר על כן עבור בדיקות vivo. למרות היותו טכניקה מעייפת הדורשת הרבה מיקוד, התוצאות הן מדהימות וחיסכון בזמן שבו הרבה שילובים ניתן לבחון בניסוי אחד.

Introduction

עם העלייה בהתנגדות עקב שימוש יתר ושימוש לרעה שלאנטיביוטיקה 1,2, הצורך לפתח תרופות חדשות וסוכנים לטיפול בזיהומים חיידקיים הפך חיוני. גישות חדשות כגון פיתוח תרופות חדשות חשובות מאוד כדי להתגבר על משבר ההתנגדות. עם זאת, תעשיית התרופות אינה מעוניינת לפתח סוכנים מיקרוביאלית חדשים. יתר על כן, אם תרופות חדשות מפותחות, חיידקים ימשיכו להתפתח ולפתח עמידות נגד תרופות חדשות אלה3,4. לכן, בעיית ההתנגדות לא תיפתר, מה שהופך את הצורך בגישה אחרת חובה שיש לשקול וללמוד כדי להתגבר על עמידות חיידקים.

שילוב תרופות הוא מושג חשוב מאוד לטיפול בזיהומים חיידקיים בעיקר אלה הנגרמים על ידי פתוגנים עמידים multidrug5,6. זה מקטין את מהלך הטיפול, מקטין את המינון שניתן; לכן, הפחתת הרעילות של התרופה הנתונה, מסייעת בהפחתת קצב התפתחות ההתנגדות, ובמובן מסוים, רגישה את החיידקים לתרופות הנתונות כמתואר במושג רגישות בטחונות5,7,8,9.

פיתוח התנגדות לתרופה אחת דורש מוטציה אחת; עם זאת, פיתוח ההתנגדות לשילוב של תרופות המכוונות למסלולים מרובים דורש מספר מוטציות עצמאיות המואטות על ידי שילוב זה. דוגמה לירידה בהתנגדות בעת שימוש בטיפול משולב היא ירידה בשיעור ההתנגדות לריפאמפין בשחפת מיקובקטריום10. דוגמה נוספת היא מחקר שנעשה על ידי Gribble et al. שהראה את קצב הופעתם של זנים עמידים בחולים הנוטלים פייפרצילין לבד להיות גבוה יותר מאשר אלה הנוטלים שילוב של carboxypenicillin ו aminoglycoside10. מחקרים הראו כי התפתחות ההתנגדות aminoglycosides בחיידקים מתפתחים עשה זנים אלה רגישים לתרופות שונות אחרות5. השילוב בין אמוקסיצילין תרופה ברמה בטא לקטם לבין חומצה clavulanic מעכב לקטמה הראההצלחהבטיפול זנים חיידקיים עמידים 8 .

הפחתת זמן הטיפול היא יתרון טוב הנובע משילובי תרופות. לדוגמה, טיפול של פניצילין משולב או ceftriaxone עם gentamicin במשך 2 שבועות ייתן את אותה יעילות שניתנה על ידי פניצילין או ceftriaxone לבד כאשר ניתנת במשך 4 שבועות11. שילוב תרופות מאפשר שימוש במינונים נמוכים יותר של תרופות שאינן יעילות כאשר ניתנות לבד כגון תת MICs. הדוגמה של sulfonamides ניתן לתת שבו השימוש של sulfonamides משולש ממזער, במינונים נמוכים יותר, הרעילות המיוצרת שהיא היווצרות גביש או crystalluria בעת שימוש sulfonamides מסיס במינונים מלאים12.

לכן, הפחתת המינון שניתן ואת זמן הטיפול בסופו של דבר להקטין את הרעילות של התרופות על הגוף. הרעיון של פיתוח שיטות להערכת האינטראקציה בין תרופות משולבות חשוב מאוד. במחקר אחד, התוצאות הראו כי טיפול משולב יעיל יותר לטיפול במינים עמידים של Acinetobacter ו P. aeruginosa8.

מתן תרופות בשילוב
ישנן שיטות שונות שבאמצעותן אנו יכולים ללמוד שילובי תרופות, כגון שיטת לוח השחמט, שיטת עקומת זמן להרוג, ואת שיטת E-test13. שיטת לוח השחמט יכולה לחקור את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות המדוברות בניסוי אחד עצמו. בנוסף, הוא פותח כדי ללמוד שילוב של שלוש תרופות14. עכשיו, אנו מרחיבים את זה כדי ללמוד שילוב של ארבע תרופות בעיקר לטיפול של פתוגנים עמידים multidrug.

הבדיקה עקומת להרוג זמן מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את ההשפעה bactericidal של תרופה מסוימת. זה שימש גם כדי לבדוק את ההשפעה של שילובי סמים שבו מספר תרופות משולבות בריכוזים ספציפיים. פרוטוקול זה דורש הכנה של כמה צינורות סטריליים או כוסות שבו בכל אנו מוסיפים את המרק, שילוב של תרופות, ואת הזן החיידקי הנדרש. לאחר הדגירה והרישום של הצפיפות האופטית במספר נקודות זמן, התוצאות מושוות לקצב הצמיחה הרגיל של הזן המשומש כדי לראות אם קצב הצמיחה גדל, ירד או לא השתנה13.

שיטת בדיקה אלקטרונית נעשית בדרך כלל כדי לבדוק את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) שבו רצועה המכילה ריכוז שיפוע של התרופה המדוברת הוא לשים על צלחת מחוסן. זה שימש גם כדי לבדוק את השילוב בין שתי תרופות שבו שתי רצועות מתווספים לצלחת באופן ניצב מצטלבים ב MICs שלהם13.

על פי הספרות, אין תקן זהב להגדיר וללמוד סינרגיה; לכן, קשה להעריך איזו מהשיטות המשמשות ללימוד שילוב היא טובה יותר ואיזה מהם מייצר תוצאות טובות ואמינות יותר בעיקר13. עם זאת, זמן להרוג assay הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ויקר15,16, בעוד שיטת E-test מפותחת ללמוד שילוב בין שתי תרופות בלבד. Checkerboard יכול ללמוד את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות שנבדקו ולכן טכניקה זו נבחרה להיות מפותחת.

Protocol

1. שלבי הכנה

  1. הכן מרק מולר-הינטון (MHB) על ידי הוספת 25 גרם מרק MH ל 1 L של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלאב ב 121 °C (69 °F) עבור 2.5 שעות. לאחר מכן, לאחסן את המדיה autoclaved בטמפרטורת החדר או במקרר.
  2. תת-תרבות החיידקים המדוברים(E. coli ESBL) על מדיה אגר באמצעות שיטת פסים ארבעה רבעים דגירה לילה ב 37 °C (69 °F).
    1. באמצעות לולאה סטרילית, לקחת מושבה אחת ולהפיץ אותו במחצית הראשונה של צלחת אגר MacConkey על ידי ביצוע פסים מקבילים קרובים.
    2. באמצעות הלולאה, להפיץ את החיידקים ברביע השני על ידי פסים אותו מהרביע הראשון.
    3. מהרביע השני, הארך את הפסים ברבע השלישי באמצעות פסים מקבילים קרובים.
    4. להפיץ את החיידקים במרכז הרבע הרביעי על ידי פסים אותו מן הרבע השלישי.

2. הכנת פאנל

  1. מניחים ארבעה צלחות 96-באר אחד ליד השני כדי ליצור ריבוע. באמצעות קלטת, הדבק את תחתיתם יחד.
  2. חזור על שלב זה כדי להשיג ארבעה לוחות שכל אחד מהם מכיל 4 לוחות ותן להם שם A1, A2, A3 ו- A4.
  3. הוסף 50 μL של מרק MH לבארות בין עמודה 2 ועמודה 11 ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.
  4. הוסף 200 μL של מרק MH לבאר H12 המשמש היטב שליטה שלילית 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.
  5. הוסף 150 μL של מרק MH לבארות A1 ו- H1 המשמשים בארות בקרה חיוביות ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.

3. סמים 1, Cefotaxime, דילול סדרתי

  1. לצינור חרוט, להוסיף 15 מ"ל של dH סטרילי2O.
    1. לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 15 מ"ל) / C1.
      הערה: במקרה שלנו, פתרון מניית Cefotaxime הוא 105 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 38.4 μL.
  2. הסר את הנפח המחושב מ 15 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
  3. פיפט 50 μL של פתרון התרופה מוכן לתוך כל באר בעמודה 11 וטור 12 למעט H12.
  4. התחל את הדילול הטורי על-ידי הסרת 50 μL מעמודה 11 והכנסתו לבארות המתאימות בעמודה 10 ולאחר מכן מ- 10 עד להגעה לעמודה 2 שבה 50 μL שנלקח מעמודה 2 יימחקו.
  5. חזור על שלבים 3.4 ו- 3.5 עבור כל 16 לוחות 96-באר של ארבעת הלוחות.

4. סמים 2, אמקאצ'ין, דילול סדרתי

  1. לצינור חרוט, להוסיף 10 מ"ל של dH סטרילי2O.
  2. לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 10 מ"ל) / C1.
    הערה: במקרה שלנו, פתרון מלאי Amikacin הוא 103 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 64 μL.
  3. הסר את הנפח המחושב מ 10 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
  4. קח שמונה צלחות נפרדות של 96 באר.
  5. לכל צלחת, להוסיף 100 μL של MHB לבארות בין שורות G ו- B.
  6. הוסף 100 μL של התרופה שהוכנה בעבר 2 פתרון בארות של שורה G.
  7. לדלל באופן סדרתי משורה G לשורה B על ידי לקיחת 100 μL מכל באר ולבסוף להשליך את 100 μL מן בארות שורה B.
  8. חזור על שלבים 4.5, 4.6 ו- 4.7 כדי להכין שמונה צלחות.

5. העברת תרופה 2 לארבעת הפאנלים

  1. פיפטה 50 μL של תרופה 2 מן הבארות בין שורות G ו- B לתוך בארות המקביל בכל צלחת בארבעת הלוחות. צלחת אחת מוכנה 96-באר מכיל 100 μL של תרופה 2 זה מספיק עבור שתי צלחות בפאנל אחד.

6. תרופה 3, לבופלוקסאצין, תוספת

  1. לארבעה צינורות חרוט שונים, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.
  2. לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1.
    הערה: במקרה שלנו, Levofloxacin מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל.
    C1 = 2 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 5.6 μL
    C2 = 4 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 11.2 μL
    C3 = 8 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 22.4 μL
    C4 = 16 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 44.8 μL
  3. הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O מכל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
  4. לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בצלחת המתאימה בכל פאנל שבו C1 מתאים לארבעת לוחות P1 בארבעת הלוחות, C2 מתאים לארבעת לוחות P2 בארבעת הלוחות C3 מתאים לארבעת לוחות ה-P3 בארבעת הלוחות, ו-C4 מתאים לארבעת לוחות ה-P4 בארבעת הלוחות.

7. תרופה 4, טרימתופרים-סולפטוקסזול, בנוסף

  1. לצינור חרוט, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.
  2. לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1.
    הערה: במקרה שלנו, trimethoprim-sulfamethoxazole מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל.
    C1 = 512 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 149.33 μL
    C2 = 1024 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 298.66 μL
    C3 = 2048 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 597.33 μL
    C4 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 1 194.66 μL
  3. הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O של כל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.
  4. לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בארבע הצלחות בלוח המתאים שבו C1 מתאים פאנל 1, C2 מתאים פאנל 2, C3 מתאים פאנל 3, ו C4 מתאים פאנל 4.

8. הכנה ותוספת של אינקולום חיידקי E. קולי ESBL

  1. באמצעות לולאה סטרילית, להעביר מושבה אחת של איזולט חיידקי E. coli ESBL בעבר תרבית על צלחת לתוך 2 מ"ל של MHB סטרילי ומערבולת.
  2. בדוק את עכירות שבו זה צריך להיות 0.5 מקפרלנד באמצעות מד צפיפות.
  3. מוסיפים 80 מ"ל של מרק MH סטרילי לתוך כוס שתן סטרילית.
  4. הוסף inoculum חיידקי מן 0.5 מקפרלנד inoculum לתוך כוס השתן בעקבות C1V1 = C2V2, שבו V1 = (106 x 80 מ"ל) / 108 = 800 μL.
  5. פיפטה 50 μL של פתרון inoculum 106 CFU / mL לתוך כל באר למעט H12, שהוא בקרת סטריליות היטב.
  6. דגירה הלוחות ב 37 °C (60 °F) לילה.
  7. לאחר הדגירה, להוסיף 50 μL של Iodotetrazolium כדי לרשום את הצמיחה בבארות.

9. פרוטוקול עבור התבנית FIC (קובץ משלים)

  1. כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 1 (Cefotaxime) בתא הצהוב בלוח A.
  2. כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 2 (Amikacin) בתא הצהוב בלוח B.
  3. כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 3 (Levofloxacin) בתא הצהוב בלוח C.
  4. כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) בפאנל D.
  5. עקוב אחר הקו האדום (ממשק צמיחה/ללא צמיחה) על-ידי הדגשת הבארות שיש להן צמיחה באדום.
  6. כתוב את המיקרופון של תרופה 1 בטבלה של תרופה 1 (ATB1).
  7. כתוב את המיקרופון של תרופה 2 בטבלה של תרופה 2 (ATB2).
  8. כתוב את המיקרופון של תרופה 3 בטבלה של תרופה 3 (ATB3).
  9. כתוב את המיקרופון של תרופה 4 בטבלה של תרופה 4 (ATB4).
  10. כדי לחשב FIC עבור ATB1
    1. קבע את הבארות בממשק הצמיחה/ללא צמיחה.
    2. בטבלה ATB1, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב בצד שמאל של לוח A לבאר הראשונה שנבחרה.
    3. חזור על שלב 9.10.2 עבור כל באר שנבחרה כאשר גם 1 מתאים FIC1, גם 2 מתאים FIC2, וכן הלאה.
  11. כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB2
    1. בטבלה ATB2, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח B לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
    2. חזור על שלב 9.11.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
  12. כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB3
    1. בטבלה ATB3, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח C לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
    2. חזור על שלב 9.12.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
  13. כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB4
    1. בטבלה ATB4, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח D לבאר הראשונה שנבחרה מראש.
    2. חזור על שלב 9.13.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.
  14. בטבלה הנקראת ATB1+2+3+4, סכם את ה- FIC1 של כל ATB באופן אוטומטי. אותו הדבר יתרחש עבור FICs האחרים (FIC2, FIC3 וכן הלאה).
    1. בתא המכיל FIC ומודגש בצהוב, לחץ עליו פעמיים ובחר את ה- ΣFICs המסוכמת מהטבלה ATB1+2+3+4.
  15. חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתשעת הגליונות המייצגים את תשעת הלוחות.
    הערה: בגיליון FIC כל, הטבלה תציג את FIC סיכם הסופי עם הפרשנות של הערך המתקבל.

10. קביעת מיקרופון באמצעות מבחני microdilution עבור ארבע התרופות

  1. תווית ארבע שורות שונות עם הקיצור של כל תרופה נבדקה. לדוגמה, CTX עבור Cefotaxime, AMK עבור אמיקצין, LEVO עבור Levofloxacin, ו SXT עבור Trimethoprim-sulfamethoxazole.
  2. פיפטה 200 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לתוך מספר טוב 1 וגם מספר 12 בכל שורה משומשת. ובכן מספר 12 ישמש כשליטה שלילית היטב.
  3. פיפטה 100 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לבארות 2 עד 11 בכל שורה משומשת.
  4. לחשב את הנפח של כל תרופה שיש להוסיף באמצעות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 הוא הנפח הסופי בבארות שהוא 200 μL, C1 הוא הריכוז של פתרון המניה, ו C2 הוא הריכוז הראשוני שאנחנו צריכים להיות בבאר הראשונה.
    הערה: כאן, אנו משתמשים במילים הבאות:
    Cefotaxime: C1 = 105 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 104 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 20.48 μL
    אמיקצין: C1 = 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 51.2 μL
    Levofloxacin: C1 = 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 5 x 102 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 16 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 25.6 μL
    טרימתופרים-סולפטוקסזול: C1 = 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 68.26 μL
  5. פיפטה את הנפח הנדרש עבור כל תרופה בבאר הראשונה של השורה המתאימה לאחר הסרת אותו נפח מן מרק 200 μL כדי להשיג נפח כולל של 200 μL לאחר הוספת התרופה.
  6. באופן סדרתי לדלל על ידי הסרת 100 μL מבאר 1 לתוך גם 2 וכן הלאה עד להגיע גם 10 שבו 100 μL הוסר מבאר 10 יושלכו. שים לב כי גם 11 משמש היטב שליטה חיובית.
  7. פיפטה 100 μL של 106 inoculum חיידקי מוכן לתוך כל באר בכל שורה משומשת למעט גם מספר 12 המשמש כפקד שלילי.
  8. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.

תוצאות

איור 2A מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוני...

Discussion

שיטת לוח השחמט המרובע דומה ללוח השחמט ולוח השחמט התלת-ממדי בפרוטוקול שלו. עם זאת, יש לקחת בחשבון צעדים חיוניים מסוימים כדי למנוע שגיאות במהלך הניסוי.

הקפד לבדוק את ה- MIC של כל תרופה נגד איזולט נבדק לפני תחילת הפרוטוקול כדי לדעת מה הם הריכוזים הדרושים כדי להתחיל את הדילול עם תר...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

ללא.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL tipsCitotest4330000402
200 µL tipsCitotest4330-0013-17
50 mL centrifuge tubecorning430828For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom TubeFalcon352058For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishesJRZ PlastilabAs bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well platescorning3596For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazoleBy CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France10177403Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)PHARCO Pharmaceuticals24750/2006Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strainRetreived as a medical strain from the Saint-George Hospital LebanonBacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agarBIO-RAD64169508For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)HIKMA Pharmaceuticals2BXMIA56N-AEFDrug 2
Muller-Hinton BrothBIO-RAD69444For making bacterial media
Multichannel PipetteThermo ScientificGJ54761For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettesThermo ScientificOH19855 HH40868For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)sanofi aventis221937/2009Drug 3

References

  1. Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
  2. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  3. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
  4. Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
  5. Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
  6. Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
  7. Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
  8. Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
  9. Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
  10. Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
  11. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  12. Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
  13. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  14. Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
  15. Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
  16. Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
  17. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved