Четырехместная шачка: модификация трехмерной шапочка для изучения комбинаций лекарств

Резюме

Этот протокол описывает, как изучить все возможные комбинации, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте. Этот метод основан на стандартном анализе микроразбавления пластинок 96 скважин и расчете фракционных ингибирующих концентраций (FIC) для оценки результатов.

Аннотация

Концепция лекарственно-комбинированной терапии приобретает очень важное значение в основном с резким повышением резистентности к лекарственным препаратам. Четверная шашь, также называемая Q-checkerboard, направлена на максимизацию количества возможных комбинаций, которые могут быть получены между четырьмя препаратами в одном эксперименте, чтобы минимизировать время и работу, необходимые для достижения тех же результатов с другими протоколами. Этот протокол основан на простой технике микроразбавления, где препараты разбавляются и объединяются вместе в нескольких 96-скважинных пластинах.

В первый набор 96-скважинных пластин добавляется бульон Мюллера-Хинтона, за которым следует первый необходимый препарат (например, цефотаксим здесь), чтобы последовательно разбавлять его. После того, как первая ступень выполнена, другой набор 96-скважинных пластин используется для разбавления второго лекарственного средства (например, Amikaci), который будет перенесен путем удаления определенного объема лекарственного средства 2 и помещен в соответствующие колодцы в первый набор пластин из 96-скважин, который содержит лекарственный один. Третий этап делают путем добавления требуемых концентраций третьего лекарственного средства (например, Левофлоксацина) к соответствующим пластинам в исходном наборе, содержащему комбинацию препарата 1 и 2. Четвертый этап делают путем добавления требуемых концентраций четвертого лекарственного средства (например, Триметоприма-сульфаметоксазола) в соответствующие пластины в первом наборе. Затем будет приготовлен и добавлен бактериальный инокулят E. coli ESBL.

Этот метод важен для оценки всех возможных комбинаций и имеет более широкий спектр возможностей для дальнейшего тестирования in vivo. Несмотря на то, что это утомительная техника, требующая большого внимания, результаты замечательны и экономят время, когда множество комбинаций может быть проверено в одном эксперименте.

Введение

С увеличением резистентности из-за чрезмерного и неправильного использования^{антибиотиков 1,2,}необходимость разработки новых лекарств и средств для лечения бактериальных инфекций стала решающей. Новые подходы, такие как разработка новых лекарств, очень важны для преодоления кризиса резистентности. Однако фармацевтическая промышленность не заинтересована в разработке новых противомикробных средств. Более того, если будут разработаны новые лекарства, бактерии будут продолжать развиваться и развивать устойчивость к этим новым^{препаратам3,4.} Таким образом, проблема резистентности не будет решена, что делает необходимость другого подхода обязательным, который следует рассмотреть и изучить для преодоления бактериальной резистентности.

Комбинация препаратов является очень важным понятием для лечения бактериальных инфекций преимущественно тех, которые вызваны мультилекарственными возбудителями^5,6. Уменьшает курс лечения, уменьшает дозу, вводимую; Таким образом, уменьшая токсичность данного препарата, способствует снижению скорости развития резистентности и, в некотором роде, сенсибилизирует бактерии к данным препаратам, как описано в концепции коллатеральной^{чувствительности 5,7,8,9.}

Развитие резистентности к одному препарату требует одной мутации; однако развитие резистентности к комбинации препаратов, нацеленных на несколько путей, требует нескольких независимых мутаций, которые замедляются этой комбинацией. Примером снижения резистентности при использовании комбинированной терапии является снижение скорости резистентности к рифампину у Микобактерий^{Туберкулеза 10.} Другим примером является исследование, проведенное Gribble et al., которое показало, что скорость появления резистентных штаммов у пациентов, принимающих только Пиперациллин, выше, чем у тех, кто принимал комбинацию карбоксипенициллина и аминогликозид^10. Исследования показали, что развитие устойчивости к аминогликозидам у эволюционирующих бактерий сделало эти штаммы чувствительными к различным другим препаратам^5. Комбинация между препаратом класса бета-лактам амоксициллином и ингибитором лактамазы клавулановой кислотой показала успех в лечении резистентных бактериальных штаммов^8.

Сокращение времени лечения является хорошим преимуществом, полученным в результате комбинаций препаратов. Например, терапия комбинированным пенициллином или цефтриаксоном с гентамицином в течение 2 недель даст такую же эффективность, как и пенициллин или цефтриаксон в одиночку при 4 неделях^11. Комбинирование лекарств позволяет использовать более низкие дозы лекарств, которые не эффективны при одном применении, такие как Суб-МИК. Пример сульфаниламидов может быть приведен там, где применение тройных сульфаниламидов минимизирует при более низких дозах токсичность, возникает кристаллообразование или кристаллурия при использовании нерастворимых сульфаниламидов в полных дозах^12.

Таким образом, уменьшение дозировки и времени лечения в конечном итоге уменьшит токсичность лекарств для организма. Идея разработки методов оценки взаимодействия между комбинированными препаратами очень важна. В одном исследовании результаты показали, что комбинированная терапия более эффективна для лечения резистентных видов Acinetobacter и P. aeruginosa^8.

Давать препараты в комбинации
Существуют различные методы, с помощью которых мы можем изучать комбинации лекарств, такие как метод шашечки, метод кривой временного убийства и метод^{E-теста 13.} Метод шашек может изучить все возможные комбинации между двумя рассматриваемыми препаратами в одном эксперименте. Кроме того, он был разработан для изучения комбинации трех препаратов^14. Теперь мы расширяем это для изучения комбинации четырех препаратов в основном для лечения патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Анализ кривой временного убийства обычно выполняется для проверки бактерицидного эффекта определенного препарата. Он также использовался для проверки эффекта комбинаций лекарств, где несколько препаратов объединяются в определенных концентрациях. Этот протокол требует приготовления нескольких стерильных пробирок или чашек, куда в каждую чашку мы добавляем бульон, комбинацию препаратов и необходимый бактериальный штамм. После инкубации и регистрации оптической плотности в нескольких временных точках результаты сравнивают с нормальной скоростью роста используемого штамма, чтобы увидеть, увеличилась ли скорость роста, уменьшилась или не изменилась^13.

Метод E-теста обычно проводится для проверки минимальной ингибирующей концентрации (MIC), когда полоска, содержащая градиентную концентрацию рассматриваемого лекарственного средства, наносится на инокулированную пластину. Он также использовался для тестирования комбинации между двумя препаратами, где две полоски добавляются к пластине перпендикулярным образом, пересекаясь на их МИК^13.

Согласно литературе, не существует золотого стандарта для определения и изучения синергии; Таким образом, трудно оценить, какой из методов, используемых для изучения комбинации, лучше, а какой дает лучшие и более достоверные результаты, главным образом^13. Тем не менее, анализ Time-kill является трудоемким, трудоемким и дорогим^15,16,в то время как метод E-test разработан для изучения комбинации только между двумя препаратами. Шачка может изучать все возможные комбинации между двумя протестированными препаратами, и именно поэтому эта методика была выбрана для разработки.

протокол

1. Этапы подготовки

1. Приготовьте бульон Мюллера-Хинтона (MHB), добавив 25 г бульона MH в 1 л дистиллированной воды и перемешайте. Автоклав при 121 °C в течение 2,5 ч. Затем храните автоклавные среды при комнатной температуре или в холодильнике.
2. Субкультура рассматриваемых бактерий(E. coli ESBL) на агаровой среде с использованием метода четырехквадрантного стрейкинга и инкубируется в течение ночи при 37 °C.
   1. Используя стерильную петлю, возьмите одну колонию и распределите ее в первой половине агартовой пластины Макконки, сделав близкие параллельные полосы.
   2. Используя петлю, распространите бактерии во втором квадранте, вытесняя их из первого квадранта.
   3. Из второго квадранта расширяйте полосы в третьем квадранте, используя близкие параллельные полосы.
   4. Распространите бактерии в центре четвертого квадранта, вытесняя их из третьего квадранта.

2. Подготовка панели

1. Поместите четыре 96-колодезные плиты рядом друг с другом, чтобы сформировать квадрат. Используя ленту, скрепите их дно вместе.
2. Повторите этот шаг, чтобы получить четыре панели, каждая из которых содержит 4 пластины, и назовите их A1, A2, A3 и A4.
3. Добавьте 50 мкл MH бульона в скважины между колонной 2 и колонной 11 в 16 96-ю плитах четырех панелей.
4. Добавьте 200 мкл MH бульона в скважину H12, служащей отрицательной контрольной скважиной в 16 96-ю плитах четырех панелей.
5. Добавьте 150 мкл MH бульона в скважины A1 и H1, служащие положительными контрольными скважинами в 16 96-скважинных плитах четырех панелей.

3. Препарат 1, Цефотаксим, серийное разведение

1. К конической трубке добавляют 15 мл стерильного dH₂O.
   1. Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С₁В₁ = С₂В_2. Таким образом, V₁ = (C₂ x 15 мл) / C₁.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае стандартный раствор цефотаксима составляет 10⁵ мкг/мл, а_C2 - 256 мкг/мл; таким образом, V₁ = 38,4 мкл.
2. Удаляют рассчитанный объем из 15 мл стерильного dH₂O, а затем добавляют препарат.
3. Пипетка 50 мкл приготовленного раствора лекарственного средства в каждую скважину в колонке 11 и колонке 12, кроме Н12.
4. Начните последовательное разбавление, удалив 50 мкл из колонки 11 и поместив его в соответствующие скважины в колонке 10, а затем с 10 до достижения колонки 2, где 50 мкл, взятые из колонки 2, будут выброшены.
5. Повторите шаги 3.4 и 3.5 для всех 16 96-скважинных плит четырех панелей.

4. Препарат 2, Амкацин, серийное разведение

1. К конической трубке добавляют 10 мл стерильного dH₂O.
2. Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С₁В₁ = С₂В_2. Таким образом, V₁ = (C₂ x 10 мл) / C₁.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае стандартный раствор амикацина составляет 10³ мкг/мл, а_C2 - 64 мкг/мл; таким образом, V₁ = 64 мкл.
3. Извлекают рассчитанный объем из 10 мл стерильного dH_2О,а затем добавляют препарат.
4. Возьмем восемь отдельных плит из 96 скважин.
5. К каждой пластине добавьте 100 мкл MHB в скважины между рядами G и B.
6. Добавляют 100 мкл предварительно приготовленного раствора препарата 2 в колодцы ряда G.
7. Разбавляйте последовательно из ряда G в ряд B, беря 100 мкл из каждой скважины, и, наконец, отбрасывайте 100 мкл из скважин ряда B.
8. Повторите шаги 4.5, 4.6 и 4.7, чтобы подготовить восемь пластин.

5. Перенос препарата 2 на четыре панели

1. Пипетка 50 мкл препарата 2 из скважин между рядами G и B в соответствующие колодцы в каждой пластине в четырех панелях. Одна подготовленная 96-скважинная пластина содержит 100 мкл препарата 2, чего достаточно для двух пластин в одной панели.

6. Препарат 3, Левофлоксацин, дополнение

1. К четырем различным коническим трубкам добавить 14 мл стерильного dH₂O.
2. Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С₁В₁ = С₂В_2. Таким образом, V₁ = (C₂ x 14 мл) / C₁.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае Левофлоксацин получают в четырех различных концентрациях из запасного раствора 5 х 10³ мкг/мл.
   C₁ = 2 мкг/мл, V₁ = 5,6 мкл
   C₂ = 4 мкг/мл, V₁ = 11,2 мкл
   C₃ = 8 мкг/мл, V₁ = 22,4 мкл
   C₄ = 16 мкг/мл, V₁ = 44,8 мкл
3. Из каждой пробирки удаляют рассчитанный объем из 14 мл стерильного dH₂O, а затем добавляют препарат.
4. После получения требуемых концентраций третьего лекарственного средства берут 50 мкл и добавляют его в соответствующие колодцы между рядами B и G и колонками 2 и 12 в соответствующей пластине в каждой панели, где C1 соответствует четырем пластинам P1 в четырех панелях, C2 соответствует четырем пластинам P2 в четырех панелях. , C3 соответствует четырем пластинам P3 в четырех панелях, а C4 соответствует четырем пластинам P4 в четырех панелях.

7. Препарат 4, Триметоприм-сульфаметоксазол, добавление

1. К конической трубке добавляют 14 мл стерильного dH₂O.
2. Рассчитайте объем, который необходимо удалить из запаса раствора лекарственного средства, следуя формуле С₁В₁ = С₂В_2. Таким образом, V₁ = (C₂ x 14 мл) / C₁.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае триметоприм-сульфаметоксазол получают в четырех различных концентрациях из запасного раствора 48 х^{10 3} мкг/мл.
   C₁ = 512 мкг/мл, V₁ = 149,33 мкл
   C₂ = 1024 мкг/мл, V₁ = 298,66 мкл
   C₃ = 2048 мкг/мл, V₁ = 597,33 мкл
   C₄ = 4096 мкг/мл, V₁ = 1 194,66 мкл
3. Извлекают рассчитанный объем из 14 мл стерильного dH₂O каждого пробирки, а затем добавляют препарат.
4. После получения требуемых концентраций четвертого лекарственного средства берут 50 мкл и добавляют его в соответствующие колодцы между рядами B и G и колонками 2 и 12 в четырех пластинах в соответствующей панели, где C1 соответствует панели 1, C2 соответствует панели 2, C3 соответствует панели 3, а C4 соответствует панели 4.

8. Получение и добавление бактериального инокулятного E. coli ESBL

1. Используя стерильную петлю, перенесите одну колонию бактериального изолята E. coli ESBL, предварительно культивированного на пластине, в 2 мл стерильного MHB и вихря.
2. Проверьте мутность там, где она должна быть 0,5 Макфарланда с помощью денситометра.
3. Добавьте 80 мл стерильного бульона MH в стерильную чашку для мочи.
4. Добавьте бактериальный инокулят из инокулята 0,5 Макфарланда в чашку для мочи после C₁V₁ = C 2 V₂, где V₁ =^{(10 6} x 80 мл) / 10⁸ = 800 мкл.
5. Пипетка 50 мкл раствора инокулята 10⁶ КОЕ/мл в каждую скважину, кроме H12, которая является скважиной контроля стерильности.
6. Инкубировать панели при 37 °C в течение ночи.
7. После инкубации добавляют 50 мкл йодотетразолия для регистрации роста в скважинах.

9. Протокол для шаблона FIC (Дополнительный файл)

1. Напишите самую высокую концентрацию препарата 1 (Цефотаксима) в желтой клетке на панели А.
2. Напишите наибольшую концентрацию препарата 2 (амикацина) в желтой клетке на панели В.
3. Напишите самую высокую концентрацию препарата 3 (Левофлоксацин) в желтой клетке в панели С.
4. Напишите наибольшую концентрацию препарата 4 (Триметоприм-сульфаметоксазол) в панели D.
5. Проследите красную линию (интерфейс «Рост/отсутствие роста»), выделив скважины с ростом красным цветом.
6. Запишите МИК препарата 1 в таблице препарата 1 (АТБ1).
7. Впишите МИК препарата 2 в таблицу препарата 2 (АТБ2).
8. Впишите МИК препарата 3 в таблицу препарата 3 (АТБ3).
9. Впишите МИК препарата 4 в таблицу препарата 4 (АТБ4).
10. Расчет СИИ для ATB1
    1. Определите скважины на интерфейсе «Рост/отсутствие роста».
    2. В таблице ATB1 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели A к первому выбранному колодецу.
    3. Повторите шаг 9.10.2 для каждой выбранной скважины, где скважина 1 соответствует FIC1, скважина 2 соответствует FIC2 и так далее.
11. Рассчитать СИИ для ATB2
    1. В таблице ATB2 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели B к первому предварительно выбранному колодецу.
    2. Повторите шаг 9.11.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
12. Рассчитать СИИ для ATB3
    1. В таблице ATB3 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели C к первому предварительно выбранному колодецу.
    2. Повторите шаг 9.12.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
13. Расчет СИИ для ATB4
    1. В таблице ATB4 дважды щелкните ячейку рядом с FIC1 и перетащите желтую ячейку слева от панели D к первому предварительно выбранному колодецу.
    2. Повторите шаг 9.13.1 для каждой предварительно выбранной скважины.
14. В таблице ATB1+2+3+4 суммируйте FIC1 каждого ATB автоматически. То же самое произойдет и с другими FIC (FIC2, FIC3 и т. д.).
    1. В ячейке, содержащей FIC и выделенной желтым цветом, дважды щелкните по ней и выберите суммированные ΣФИК из таблицы ATB1+2+3+4.
15. Повторите эти шаги для каждого из девяти листов, представляющих девять пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В листе FIC all, таблица покажет окончательный суммированный FIC с интерпретацией полученного значения.

10. Определение МИК с использованием микроразведывного анализа для четырех препаратов

1. Маркируйте четыре разных ряда с аббревиатурой каждого тестируемого препарата. Например, CTX для Цефотаксима, AMK для амикацина, LEVO для Левофлоксацина и SXT для Триметоприма-сульфаметоксазола.
2. Пипетка 200 мкл стерильного бульона Мюллера Хинтона в скважину No1 и скважину No12 в каждом используемом ряду. Скважина No12 будет служить отрицательным контрольным колодец.
3. Пипетка 100 мкл стерильного бульона Мюллера Хинтона в колодцы от 2 до 11 в каждом использованном ряду.
4. Рассчитайте объем каждого добавляемого лекарственного средства по формуле С₁В₁ =_С2В_2. Таким образом, V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V₂ - конечный объем в скважинах, который составляет 200 мкл, C₁ - концентрация запасного раствора, а C₂ - начальная концентрация, которую мы должны иметь в первой скважине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем следующее:
   Цефотаксим:_С1 = 10⁵ мкг/мл, где мы разбавляем его до 10⁴ мкг/мл,_С2 = 256 мкг/мл; таким образом, V₁ = 20,48 мкл
   Амикацин: C₁ =^{10 3} мкг/мл, C₂ = 64 мкг/мл; таким образом, V₁ = 51,2 мкл
   Левофлоксацин:_С1 = 5 х 10³ мкг/мл, где мы разбавляем его до 5^{х 10 2} мкг/мл,_С2 = 16 мкг/мл; таким образом, V₁ = 25,6 мкл
   Триметоприм-сульфаметоксазол:_С1 = 48 х^{10 3} мкг/мл,_С2 = 4096 мкг/мл; таким образом, V₁ = 68,26 мкл
5. Пипетка необходимого объема для каждого лекарственного средства в первой скважине соответствующего ряда после удаления такого же объема из 200 мкл бульона для получения общего объема 200 мкл после добавления препарата.
6. Последовательно разбавляйте путем удаления 100 мкл из скважины 1 в скважину 2 и так далее до достижения скважины 10, где 100 мкл, удаленные из скважины 10, будут выброшены. Обратите внимание, что колодец 11 служит положительным контрольным колодец.
7. Пипетка 100 мкл из 10⁶ приготовленных бактериальных инокулята в каждую скважину в каждом используемом ряду, за исключением скважины No 12, служащей отрицательным контролем.
8. Инкубировать при 37 °C в течение ночи.

Результаты

Фиг.2А представляет результаты, полученные путем комбинирования цефотаксима и амикацина со специфическими концентрациями левофлоксацина и триметоприма-сульфаметоксазола. Мы можем видеть в левой части рисунка четыре пластины, которые схематично представлены с концен...

Обсуждение

Метод четверной шаховой доски напоминает в своем протоколе шаховую доску и трехмерную шакерную доску. Тем не менее, некоторые важные шаги должны быть приняты во внимание, чтобы избежать ошибок во время эксперимента.

Обязательно проверьте MIC каждого лекарственного средс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3