Quadruplicar-Checkerboard: Uma modificação do tabuleiro de xadrez tridimensional para estudar combinações de medicamentos

Resumo

Este protocolo descreve como estudar todas as combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um único experimento. Este método baseia-se no ensaio padrão de micro diluição de placas de 96 poços e no cálculo de concentrações inibitórias fracionárias (FICs) para avaliar os resultados.

Resumo

O conceito de terapia de combinação de drogas está se tornando muito importante principalmente com o aumento drástico da resistência às drogas. O tabuleiro de xadrez Quádruplo, também chamado de Q-checkerboard, visa maximizar o número de combinações possíveis que podem ser obtidas entre quatro drogas em um experimento para minimizar o tempo e o trabalho necessários para alcançar os mesmos resultados com outros protocolos. Este protocolo baseia-se na simples técnica de micro diluição onde as drogas são diluídas e combinadas em várias placas de 96 poços.

No primeiro conjunto de placas de 96 poços, o caldo Muller-Hinton é adicionado seguido pela primeira droga necessária (por exemplo, Cefotaxime aqui) para diluí-lo em série. Após o primeiro passo, outro conjunto de placas de 96 poços é usado para diluir a segunda droga (por exemplo, Amikaci), que será transferida removendo um volume específico de droga 2 e colocada nos poços correspondentes no primeiro conjunto de placas de 96 poços que contém uma droga. O terceiro passo é feito adicionando as concentrações necessárias da terceira droga (por exemplo, Levofloxacin), às placas apropriadas no conjunto inicial contendo combinação de droga 1 e 2. O quarto passo é feito adicionando as concentrações necessárias da quarta droga (por exemplo, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nas placas apropriadas no primeiro conjunto. Em seguida, o inóculo bacteriano E. coli ESBL será preparado e adicionado.

Este método é importante para avaliar todas as combinações possíveis e tem uma gama mais ampla de possibilidades a serem testadas além para testes in vivo. Apesar de ser uma técnica cansativa que requer muito foco, os resultados são notáveis e economizam tempo onde muitas combinações podem ser testadas em um único experimento.

Introdução

Com o aumento da resistência devido ao uso excessivo e uso indevido de antibióticos^1,2, a necessidade de desenvolver novos medicamentos e agentes para tratar infecções bacterianas tornou-se crucial. Novas abordagens como o desenvolvimento de novas drogas são muito importantes para superar a crise de resistência. No entanto, a indústria farmacêutica não está interessada em desenvolver novos agentes antimicrobianos. Além disso, se novas drogas forem desenvolvidas, as bactérias continuarão evoluindo e desenvolvendo resistência contra essas novas drogas^3,4....

Protocolo

1. Etapas de preparação

1. Prepare o caldo Muller-Hinton (MHB) adicionando 25 g de caldo MH a 1 L de água destilada e misture. Autoclave a 121 °C por 2,5 h. Em seguida, armazene a mídia autoclaved em temperatura ambiente ou na geladeira.
2. Subcultura as bactérias em questão (E. coli ESBL) na mídia ágar usando o método de listras de quatro quadrantes e incubar durante a noite a 37 °C.
   1. Usando um laço estéril, pegue uma colônia e espalhe-a na primeira metade da placa de ágar MacConkey fazendo listras paralelas próximas.
   2. Usando o laço, espalhe a bactéria no segundo quadrante, listrando-a do primeiro quadrante.
   3. A partir....

Resultados

A Figura 2A representa os resultados obtidos pela combinação de Cefotaxime e Amikacin com concentrações específicas de Levofloxacina e Trimetoprim-sulfametoxazol. Podemos ver na parte esquerda da figura as quatro placas que são esquemáticamente apresentadas com as concentrações das drogas na parte direita da figura. As setas representam os poços na interface Crescimento/sem Crescimento. Os poços coloridos são os poços que contêm crescimento. Notamos que a quarta placa não cont.......

Discussão

O método De checkerboard quádruplo se assemelha ao tabuleiro de xadrez e ao tabuleiro de damas tridimensional em seu protocolo. No entanto, certas medidas cruciais devem ser tomadas em consideração para evitar erros durante o experimento.

Certifique-se de testar para o MIC de cada droga contra o isolado testado antes de iniciar o protocolo para saber quais são as concentrações necessárias para iniciar as diluições com a droga 1 e a droga 2 que precisam ser diluídas em série nas pla.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3