זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

Summary

תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג'ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.

Abstract

תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג'ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.

Introduction

גליובלסטומה (GBM) הוא הסוג הנפוץ והאגרסיבי ביותר של גידול ראשוני במוח. נכון לעכשיו, ההישרדות הכוללת של חולי GBM שקיבלו טיפול מקסימלי (שילוב של ניתוח, כימותרפיה והקרנות) עדיין קצרה מ -15 חודשים; אז טיפולים חדשניים ויעילים עבור GBM נדרשים בדחיפות.

נוכחותם של תאי גזע גליומה (GSCs) ב- GBM מהווה אתגר ניכר לטיפול הקונבנציונלי שכן תאים דמויי גזע אלה ממלאים תפקידי מפתח בשמירה על מיקרו-סביבה של גידול, עמידות לתרופות והישנות גידול¹. לכן, מיקוד GSCs יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול GBM². עם זאת, חיסרון משמעותי ליעילות התרופה ב- GBM הוא אופיה ההטרוגנטי, כולל אך לא רק ההבדל במוטציות גנטיות, תת-סוגים מעורבים, ויסות אפיגנטי ומיקרו-סביבה של גידולים מה שהופך אותם עקשניים מאוד לטיפול. לאחר ניסויים קליניים כושלים רבים, מדענים וחוקרים קליניים הבינו כי טיפול ממוקד סוכן יחיד הוא כנראה מסוגל שליטה מלאה על ההתקדמות של סרטן הטרוגניים מאוד כגון GBM. בעוד, שילובי תרופות שנבחרו בקפידה אושרו ליעילותם על ידי שיפור סינרגטי את ההשפעה אחד של השני, ובכך לספק פתרון מבטיח לטיפול GBM.

למרות שיש דרכים רבות להעריך את האינטראקציות בין תרופתיות של שילוב סמים, כגון CI (אינדקס קומבינציה), HSA (הסוכן הבודד הגבוה ביותר) וערכי בליס וכו^'3,4, שיטות חישוב אלה מבוססות בדרך כלל על שילובי ריכוז מרובים. אכן, שיטות אלה יכולות לספק הערכה חיובית של אינטראקציה בין סמים לתרופות, אך יכולות להיות מייגעות מאוד אם הן מיושמות בהקרנת תפוקה גבוהה. כדי לפשט את התהליך, זרימת עבודה סינון לזיהוי מהיר של שילובי תרופות פוטנציאליים המעכבים את הצמיחה של GSCs שמקורם ביופסיות כירורגיות של GBM החולה פותח. מדד רגישות (SI) המשקף את ההבדל של האפקט המשולב הצפוי ואת האפקט המשולב שנצפו הוכנס לשיטה זו כדי לכמת את ההשפעה הסינרגית של כל תרופה, כך המועמדים הפוטנציאליים ניתן לזהות בקלות על ידי דירוג SI. בינתיים, פרוטוקול זה מדגים מסך לדוגמה כדי לזהות את המועמדים הפוטנציאליים שיכולים לסנן את אפקט האנטי-גליומה עם טמוזולומייד, הכימותרפיה בשורה הראשונה לטיפול GBM, בין 20 מעכבים מולקולריים קטנים.

Protocol

דגימת GBM נרכשה ממטופל במהלך ניתוח שגרתי לאחר שקיבלה הסכמה מדעת מלאה על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג.

1. בידוד ותרבות של GSCs שמקורם בחולים

1. מניחים רקמת גליובלסטומה טרייה שנקטפה בניתוח בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא PBS סטרילי ולאחסן את הרקמה על קרח עד לפעולה נוספת.
2. טחון את רקמת GBM לכ 0.5 עד 1 מ"מ קוטר חתיכות באמצעות מספריים ביתור לשטוף את דגימות הרקמה עם מדיום בזאלי עצבי כדי להסיר פסולת הסלולר בארון בטיחות ביולוגית.
3. לעכל את שברי הרקמה עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase A ב 37 °C במשך 30 דקות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (7 °F).
4. הסר את supernatant ולהשעות את הכדור עם בינוני בסיס עצבי ריק לנתק את הכדור באופן מכני על ידי צינור חוזר על הקרח.
5. תרבות התערובת בצלחות תרבות אולטרה-נמוכות 6-באר מלאות במדיום תרבות GSC (ראה טבלה 1 למתכון) באינקובטור תאים סטרילי עם 5% CO₂ ו 90% לחות ב 37 °C (37 °F) עד היווצרות נוירוספירה.
6. על היווצרות נוירוספירה מספקת, לאסוף אותם באמצעות pipette ב microtube 1.5 מ"ל צנטריפוגה ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. resuspend הכדור לפצל אותו למספר צלוחיות מלא עם המדיום התרבות לעיל לשמירה על GSCs העיקרי.
   הערה: GSCs נגזר המטופל בשימוש בדוגמה נגזר ביופסיות כירורגיות של חולה זכר בן 34 עם כיתה IV חוזרת של WHO GBM. GSCs נקראו XG387 לניסויים העתידיים. בדיקות mycoplasma מבוסס PCR בוצעו עבור GSCs לעיל כדי לאשר אין זיהום mycoplasma קיים. כל הניסויים הקשורים GSCs בשימוש בפרוטוקול זה בוצעו <15 קטעים.

2. הכנת GSCs מתויג לוציפראז

1. לאסוף את GSCs מהתרבות הבינונית צנטריפוגות אותם ב 70 x g במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הסר את supernatant, לעכל את התאים עם accutase במשך 4 דקות ב 37 °C (77 °F). השתמש 200 μL קצה ו pipette שוב ושוב כדי לנתק מחדש את גלולה התא.
3. לדלל את התאים ל 2 x 10⁵ תאים לבאר בצלחת תרבית 12-well ותרבות התאים בן לילה.
4. הוסף 30 μL לוציפראז-EGFP וירוס supernatant (titer >10⁸ TU / mL) לתוך כל באר בצלחת ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 1,000 x גרם עבור 2 שעות ב 25 °C (70 °F). תרבית התאים בן לילה.
5. רענן את המדיום למחרת ותרבות התאים לעוד 48 שעות.
6. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ פלורסנט כדי לאשר את המראה של תאים חיוביים GFP.
7. השתמש בממיין תאי זרימה כדי למיין ולבחור את GSCs עם פלואורסצנטיות GFP גבוהה כדי לתרבות את התאים עוד יותר.

3. מדידה מבוססת ביו-זוהר של כדאיות התא

1. לוחות ציפוי עם תערובת מטריצה חוץ תאית (ECM) (למשל, מטריג'ל): מוסיפים 40 μL של תערובת 0.15 מ"ג / מ"ל ECM לכל באר ודגרת הצלחת במשך שעה אחת ב 37 °C (37 °C). הסר את תערובת ECM עודף ולשטוף בעדינות פעם אחת עם PBS.
2. הוסף 100 μL תרבות מדיום המכיל 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000, ו 500 XG387-לוק תאים יחד עם 100 μL מדיום ריק כמו שליטה לתוך כל באר עבור 6 משכפלים בצלחת תחתונה אופטית 96 היטב ותרבית התאים לילה ב 37 °C (57 °F).
3. הסר את supernatant, להוסיף 50 μL תרבות מדיום המכיל 150 ng / μL D-לוציפרין לתוך כל באר ולדגירה על התאים במשך 5 דקות ב 37 °C (57 °F).
4. צלם תמונות של הביו-אור התאי בצלחת באמצעות מערכת ההדמיה בספקטרום IVIS. השתמש בתוכנה המובנית כדי ליצור אזורים מעגליים מרובים של אזור העניין (ROI) ולכומת את הביו-לומינציה התאית.

4. טיפול טמוזולומייד והקרנה משולבת

1. יש לפנות לארבע צלחות 96-באר כמתואר לעיל, לפני הטיפול.
2. זרע XG387-Luc תאים בצפיפות של 1,000 תאים ב 100 μL תרבית בינוני לתוך כל באר של צלחת תחתונה אופטית 96 היטב ותרבית התאים בן לילה.
3. הכן temozolomide ואת הסוכנים הממוקדים מפתרון המלאי מראש. הכן סדרת ריכוז המורכבת 800 מיקרומטר, 600 מיקרומטר, 400 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, ו 50 μM טמוזולומייד במדיום תרבות לטיפול סוכן יחיד. לדלל temozolomide ואת הסוכנים הממוקדים פתרון מלאי במדיום התרבות, בהתאמה, כדי להשיג ריכוזים סופיים של 200 μM ו 2 μM עבור הקרנת סמים משולבת (טבלה 2).
4. הסר את המדיום התרבותי כאשר רוב GSCs לדבוק בתחתית הלוחות; מוסיפים את המדיום המוכן לעיל המכיל טמוזולומייד לכל באר עבור שלושה שכפולים טכניים לכל טיפול.
5. כדי לטפל Temozolomide כדי לסנן את שילובי התרופה להסיר את המדיום הריק ולהוסיף את המדיום מוכן לעיל המכיל או 200 μM temozolomide, או 2 סוכן ממוקד μM, או שילוב של שניהם לתוך כל באר עבור שלושה שכפולים טכניים לכל טיפול.
6. לדגור על כל הצלחות ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 במשך 3 ימים.
7. הסר את המדיום המכיל סמים, להוסיף 50 μL מדיום ריק המכיל 150 ng / μL D-לוציפרין לתוך כל באר ולדגירה על התאים במשך 5 דקות ב 37 °C (57 °F).
8. צלם תמונות של הביו-אור התאי בצלחת באמצעות מערכת ההדמיה בספקטרום IVIS. השתמש בתוכנה המובנית כדי ליצור ROIs מעגלי מרובים ולכימת את הביו-לומינציה התאית.

5. טיפול משולב של טמוזולומייד ו- UMI-77 בקווי התא XG387-לוק ו- XG328-Luc

1. יש לפנות לשלוש צלחות 96-באר כמתואר לעיל, לפני הטיפול.
2. זרע XG387-לוק ו XG328-לוק תאים בצפיפות של 1,000 תאים בהתאמה ב 100 μL של תרבות בינוני לתוך כל באר של צלחת תחתונה אופטית 96 היטב ותרבית התאים בן לילה.
3. הכן סדרת ריכוז המורכבת מ 600 מיקרומטר, 400 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 200 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, ו 0 μM temozolomide וסדרת ריכוז המורכבת מ 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, ו 0 μM UMI-77 במדיום התרבות עבור שישה על שישה מנות מטריצת טיטציה טיפולים.
4. הסר את המדיום הריק כאשר רוב GSCs לדבוק בתחתית הצלחת; מוסיפים את המדיום שהוכן לעיל לכל באר לשלושה שכפולים טכניים לכל טיפול.
5. לדגור על לוחות אלה במשך 3 ימים ב 37 °C (5 °F), 5% CO_2.
6. הסר את המדיום המכיל סמים; להוסיף 50 μL של מדיום ריק המכיל 150 ng / μL D-לוציפרין לתוך כל באר ולדגירה את התאים במשך 5 דקות ב 37 °C למדידת ביולומינציה.

6. ניתוח נתונים

1. חשב את ציון מדד הרגישות (SI) של טמוזולומייד וסוכן ממוקד בהתאם לנוסחה באיור 2A.
   הערה: ציון SI הוא לכמת את ההשפעה של תוספת של תרופה אחרת. זה נע בין -1 ל +1, עם ערכים חיוביים המצביעים על אפקטים סינרגטיים temozolomide.
2. חשב את ערכי האינדקס המשולב (CI) בין temozolomide ו- UMI-77 באמצעות תוכנת CompuSyn כדי לנתח את האינטראקציות המשולבות שלהם. ערך CI <1 מציין סינרגיה; ערך CI >1 מצביע על אנטגוניזם.
3. חשב את ערכי הסוכן הבודד הגבוהים (HSA) בין טמוזולומייד ל- UMI-77 באמצעות תוכנת Combenefit. ערך HSA מציין את האפקט המעכב המשולב. ערך HSA >0 מציין סינרגיה וערך HSA <0 מציין אנטגוניזם.

תוצאות

תאי XG387 יצרו נוירוספירות במדיום התרבותי המתואר בטבלה 1 בצלחת תרבות אולטרה-נמוכה של 6 בארות או בצלחת לא מצופה⁵ (איור 1A). ראשית, בוצעה בדיקה כדי לבדוק אם עוצמת הביו-אור מתאי XG387-Luc הייתה פרופורציונלית למספר התא. כפי שניתן לראות באיור 1B, עוצמת...

Discussion

במחקר הנוכחי תואר פרוטוקול שניתן ליישם כדי לזהות טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות GSCs שמקורם במטופל. שלא כמו המודל המדדי הסטנדרטי של סינרגיה/תוספות כגון Loewe, BLISS או HSA, נעשה שימוש בזרימת עבודה פשוטה ומהירה שאינה דורשת שילוב של זוג תרופות בריכוזים מרובים באופן פקטורלי מלא כשיטות המסורתי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.