Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

Resumo

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Resumo

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Introdução

Glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral primário. Atualmente, a sobrevida geral de pacientes com GBM que receberam tratamento máximo (uma combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia) ainda é menor que 15 meses; por isso terapias novas e eficazes para GBM são urgentemente necessárias.

A presença de células-tronco de glioma (GSCs) no GBM constitui um desafio considerável para o tratamento convencional, uma vez que essas células-tronco desempenham papéis pivôs na manutenção do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e recorrência do tumor¹. Portanto, direcionar GSCs pode ser uma estratégia promissora para o tratamento GBM². No entanto, uma grande desvantagem para a eficácia da droga no GBM é sua natureza heterogenética, incluindo, mas não se limitando à diferença de mutações genéticas, subtipos mistos, regulação epigenética e microambiente tumoral, o que os torna muito refratários para o tratamento. Depois de muitos testes clínicos fracassados, cientistas e pesquisadores clínicos perceberam que a terapia-alvo de um único agente é provavelmente incapaz de controlar totalmente a progressão de cânceres altamente heterogêneos, como o GBM. Considerando que, combinações de medicamentos cuidadosamente selecionadas foram aprovadas para sua eficácia, aumentando sinérgicamente o efeito uns dos outros, fornecendo assim uma solução promissora para o tratamento de GBM.

Embora existam muitas maneiras de avaliar as interações medicamentosa-droga de uma combinação de drogas, como o CI (Índice de Combinação), HSA (Highest Single Agent) e os valores bliss, etc.^3,4, esses métodos de cálculo são geralmente baseados em múltiplas combinações de concentração. De fato, esses métodos podem fornecer avaliação afirmativa da interação medicamentosa-droga, mas podem ser muito trabalhosos se forem aplicados na triagem de alto rendimento. Para simplificar o processo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho de triagem para identificar rapidamente as combinações potenciais de medicamentos que inibem o crescimento de GSCs originados de biópsias cirúrgicas do GBM do paciente. Um Índice de Sensibilidade (SI) que reflete a diferença do efeito combinado esperado e o efeito combinado observado foi introduzido neste método para quantificar o efeito sinérgico de cada droga, de modo que os candidatos potenciais podem ser facilmente identificados pelo ranking SI. Enquanto isso, este protocolo demonstra uma tela de exemplo para identificar os potenciais candidatos que podem sinergizar o efeito anti-glioma com temozolomide, a quimioterapia de primeira linha para o tratamento de GBM, entre 20 pequenos inibidores moleculares.

Protocolo

A amostra GBM foi adquirida de um paciente durante uma operação de rotina após obter o consentimento totalmente informado pelo comitê de ética em pesquisa humana do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing.

1. Isolamento e cultura de GSCs derivados do paciente

1. Coloque tecido glioblastoma ressecado cirurgicamente fresco em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PBS estéril e armazene o tecido no gelo até uma nova operação.
2. Pique o tecido GBM em peças de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diâmetro usando uma tesoura de dissecção e lave as amostras de tecido com meio basal neuronal para remover detritos celulares em um armário de biossegurança.
3. Digerir os fragmentos de tecido com colagenase de 1 mg/mL A 37 °C por 30 min e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.
4. Remova o supernatante e suspenda a pelota com meio basal neuronal em branco e dissocia a pelota mecanicamente por tubos repetitivos no gelo.
5. Cultura a mistura em ultra-baixo apego 6-bem placas de cultura preenchidas com meio de cultura GSC (ver Tabela 1 para a receita) em uma incubadora celular estéril com 5% de CO₂ e 90% de umidade a 37 °C até a formação da neurosfera.
6. Em formação de neurosfera suficiente, colete-os usando uma pipeta em um microtubo de 1,5 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente.
7. Resuspenque a pelota e divida-a em vários frascos preenchidos com o meio de cultura acima para manter os GSCs primários.
   NOTA: Os GSCs derivados do paciente utilizados no exemplo foram derivados de biópsias cirúrgicas de um paciente do sexo masculino de 34 anos com GBM recorrente grau IV da OMS. Os GSCs foram nomeados como XG387 para os experimentos futuros. Foram realizados testes de mycoplasma baseados em PCR para os GSCs acima para confirmar que não há contaminação por micoplasma. Todos os experimentos envolvendo GSCs utilizados neste protocolo foram realizados <15 passagens.

2. Preparando GSCs com marca de luciferase

1. Colete os GSCs da cultura média e centrifuá-los a 70 x g por 3 min a temperatura ambiente.
2. Retire o supernasce, digera as células com accutase por 4 min a 37 °C. Use uma ponta de 200 μL e pipeta repetidamente para dissociar e resuspensar a pelota celular.
3. Diluir as células para 2 x 10⁵ células por poço em uma placa de cultura de 12 poços e cultivar as células durante a noite.
4. Adicione 30 μL de luciferase-EGFP vírus supernante (titer >10⁸ TU /mL) em cada poço na placa e, em seguida, centrifugar as células a 1.000 x g por 2 h a 25 °C. Cultume as células da noite para o dia.
5. Refrescar o meio no dia seguinte e cultivar as células por mais 48 h.
6. Observe as células sob um microscópio florescente para confirmar o aparecimento das células positivas do GFP.
7. Use um classificador de células de fluxo para classificar e selecionar os GSCs com alta fluorescência de GFP para cultivar ainda mais as células.

3. Medição baseada em biolumescência da viabilidade celular

1. Placas de revestimento com a mistura de matriz extracelular (ECM) (por exemplo, Matrigel): Adicione 40 μL de mistura de 0,15 mg/mL ECM a cada poço e incubar a placa por 1 h a 37 °C. Retire o excesso de mistura de ECM e enxágue delicadamente uma vez com PBS.
2. Adicionar 100 μL meio de cultura contendo 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000, e 500 células XG387-Luc juntamente com 100 μL médio em branco como controle em cada poço para 6 réplicas em uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura as células durante a noite a 37 °C.
3. Remova o supernasciante, adicione 50 μL de cultura média contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C.
4. Tire imagens da biolumescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software incorporado para criar múltiplas áreas circulares da região de interesse (ROI) e quantificar a biolumescência celular.

4. Tratamento temozolomide e triagem de combinação

1. Precoat quatro placas de 96 poços como descrito acima, antes do tratamento.
2. Células sementes XG387-Luc a uma densidade de 1.000 células em 100 μL cultura média em cada poço de uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura as células durante a noite.
3. Prepare a temozolomide e os agentes-alvo da solução de estoque com antecedência. Prepare uma série de concentração composta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM temozolomide em meio de cultura para o tratamento de um único agente. Temozolomida diluída e os agentes-alvo em solução de estoque no meio da cultura, respectivamente, para obter concentrações finais de 200 μM e 2 μM para triagem combinada de medicamentos(Tabela 2).
4. Remova o meio de cultura quando a maioria dos GSCs aderir à parte inferior das placas; adicione o meio acima preparado contendo temozolomida em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
5. Para tratar temozolomide e para tela as combinações de drogas removam o meio em branco e adicionem o meio acima preparado contendo temozolomida de 200 μM, ou 2 μM agente-alvo, ou uma combinação de ambos em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
6. Incubar todas as placas a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias.
7. Remova o meio contendo a droga, adicione 50 μL de meio em branco contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C.
8. Tire imagens da biolumescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software incorporado para criar VÁRIOS ROIs circulares e quantificar a biolumescência celular.

5. Tratamento combinado de temozolomida e umi-77 em linhas celulares XG387-Luc e XG328-Luc

1. Precoat três placas de 96 poços como descrito acima, antes do tratamento.
2. Células seed XG387-Luc e XG328-Luc a uma densidade de 1.000 células, respectivamente, em 100 μL de cultura média em cada poço de uma placa de fundo óptica de 96 poços e cultura das células durante a noite.
3. Prepare uma série de concentração composta de 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, e 0 μM temozolomide e uma série de concentração composta por 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM e 0 μM UMI-77 no meio de cultura para tratamentos de matriz de mama de seis por seis doses.
4. Remova o meio em branco quando a maioria dos GSCs aderir à parte inferior da placa; adicione o meio acima preparado em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
5. Incubar essas placas por 3 dias a 37 °C, 5% de CO₂.
6. Remover o meio contendo drogas; adicionar 50 μL de meio em branco contendo 150 ng/μL D-luciferin em cada poço e incubar as células por 5 min a 37 °C para medição de bioluminescência.

6. Análise de dados

1. Calcular o escore de Índice de Sensibilidade (SI) de temozolomida e agente-alvo de acordo com a fórmula da Figura 2A.
   NOTA: A pontuação si é quantificar a influência da adição de outra droga. Variou de -1 a +1, com valores positivos indicando efeitos sinergísticos temozolomide.
2. Calcule os valores do índice de combinação (CI) entre temozolomide e UMI-77 usando o software CompuSyn para analisar suas interações combinadas. O valor de CI <1 indica sinergia; O valor de CI >1 indica antagonismo.
3. Calcule os altos valores de agente único (HSA) entre temozolomide e UMI-77 usando o software Combenefit. O valor do HSA indica o efeito inibidor combinado. O valor do HSA >0 indica sinergia e o valor HSA <0 indica antagonismo.

Resultados

As células XG387 formaram neuroesferas no meio de cultura descrito na Tabela 1 em uma placa de cultura de 6 poços de apego ultra-baixa ou uma placa não revestida⁵ (Figura 1A). Primeiro, foi realizado um teste para verificar se a intensidade de biolumescência das células XG387-Luc era proporcional ao número celular. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade da biolumescência aumentou proporcionalmente à densidade ce...

Discussão

No presente estudo, foi descrito um protocolo que pode ser aplicado para identificar uma potencial terapia de combinação para GBM usando GSCs derivados do paciente. Ao contrário do modelo métrico de sinergia/aditividade padrão, como os métodos Loewe, BLISS ou HSA, foi utilizado um fluxo de trabalho simples e rápido que não requer que um par de drogas seja combinado em múltiplas concentrações de forma fatorial completa como os métodos tradicionais. Neste fluxo de trabalho, o SI (índice de sensibilidade) que ?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.