Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

Резюме

Стволовые клетки глиомы (GSC) представляют собой небольшую часть раковых клеток, которые играют важную роль в инициации опухоли, ангиогенезе и лекарственной устойчивости при глиобластоме (GBM), наиболее распространенной и разрушительной первичной опухоли головного мозга. Наличие ГСК делает GBM очень рефрактерным к большинству отдельных целевых агентов, поэтому для выявления потенциальных эффективных комбинированных терапевтических средств требуются высокопроизводительный скрининг. Протокол описывает простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить скрининг потенциальной комбинированной терапии с синергетическим взаимодействием. Общие этапы этого рабочего процесса состоят из установления ГСК, помеченных люциферазой, подготовки пластин с матригелевым покрытием, скрининга комбинированных препаратов, анализа и проверки результатов.

Аннотация

Стволовые клетки глиомы (GSC) представляют собой небольшую часть раковых клеток, которые играют важную роль в инициации опухоли, ангиогенезе и лекарственной устойчивости при глиобластоме (GBM), наиболее распространенной и разрушительной первичной опухоли головного мозга. Наличие ГСК делает GBM очень рефрактерным к большинству отдельных целевых агентов, поэтому для выявления потенциальных эффективных комбинированных терапевтических средств требуются высокопроизводительный скрининг. Протокол описывает простой рабочий процесс, позволяющий быстро проводить скрининг потенциальной комбинированной терапии с синергетическим взаимодействием. Общие этапы этого рабочего процесса состоят из установления ГСК, помеченных люциферазой, подготовки пластин с матригелевым покрытием, скрининга комбинированных препаратов, анализа и проверки результатов.

Введение

Глиобластома (ГБМ) является наиболее распространенным и агрессивным типом первичной опухоли головного мозга. В настоящее время общая выживаемость пациентов с ГБМ, получивших максимальное лечение (сочетание хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии), по-прежнему короче 15 месяцев; поэтому срочно необходимы новые и эффективные методы лечения ГБМ.

Наличие стволовых клеток глиомы (GSC) в GBM представляет собой значительную проблему для традиционного лечения, поскольку эти стволовые клетки играют ключевую роль в поддержании микроокружения опухоли, лекарственной устойчивости и рецидива опухоли^1. Таким образом, нацеливание на ГСК может быть многообещающей стратегией для лечения ГБМ^2. Тем не менее, основным недостатком эффективности препарата при ГБМ является его гетерогенетическая природа, включая, но не ограничиваясь, разницей в генетических мутациях, смешанных подтипах, эпигенетической регуляции и микроокружении опухоли, что делает их очень рефрактерными для лечения. После многих неудачных клинических испытаний ученые и клинические исследователи поняли, что таргетная терапия с одним агентом, вероятно, не способна полностью контролировать прогрессирование высоко гетерогенных видов рака, таких как GBM. Принимая во внимание, что тщательно отобранные комбинации лекарств были одобрены для их эффективности путем синергетического усиления эффекта друг друга, обеспечивая тем самым многообещающее решение для лечения ГБМ.

Хотя существует много способов оценки лекарственно-лекарственного взаимодействия лекарственной комбинации, таких как CI (комбинированный индекс), HSA (самый высокий одиночный агент) и значения Bliss и т. Д.^3,4,эти методы расчета обычно основаны на комбинациях нескольких концентраций. Действительно, эти методы могут обеспечить утвердительную оценку лекарственного взаимодействия, но могут быть очень трудоемкими, если они применяются при высокопроизводительном скрининге. Чтобы упростить процесс, был разработан процесс скрининга для быстрого выявления потенциальных комбинаций лекарств, которые ингибируют рост ГСК, полученных из хирургических биопсий пациента GBM. Индекс чувствительности (СИ), который отражает разницу ожидаемого комбинированного эффекта и наблюдаемого комбинированного эффекта, был введен в этот метод для количественной оценки синергетического эффекта каждого лекарственного средства, поэтому потенциальные кандидаты могут быть легко идентифицированы по рейтингу СИ. Между тем, этот протокол демонстрирует пример скрининга для идентификации потенциального кандидата (кандидатов), который может синергизировать эффект антиглиомы с темозоломидом, химиотерапией первой линии для лечения GBM, среди 20 малых молекулярных ингибиторов.

протокол

Образец GBM был получен от пациента во время обычной операции после получения полностью информированного согласия комитета по этике исследований человека Первой аффилированной больницы Нанкинскому медицинскому университету.

1. Выделение и культура ГСК, полученных от пациента

1. Поместите свежую хирургически резецированную ткань глиобластомы в центрифужную трубку объемом 15 мл, заполненную стерильным PBS, и храните ткань на льду до дальнейшей операции.
2. Измерните ткань GBM примерно на куски диаметром от 0,5 до 1 мм с помощью ножниц для рассечения и промывайте образцы тканей нейрональной базальной средой для удаления клеточного мусора в шкафу биобезопасности.
3. Переварить фрагменты тканей с 1 мг/мл коллагеназы А при 37 °C в течение 30 мин и центрифугировать при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
4. Удалите надносец и подвешивайте гранулу с пустой нейрональной базальной средой и диссоциируют гранулу механически путем повторного пипетирования на льду.
5. Культивирует смесь в 6-скважинных культуральная пластины со сверхнизким прикреплением, заполненные питательной средой GSC (см. Таблицу 1 для рецепта) в стерильном клеточном инкубаторе с 5% CO₂ и влажностью 90% при 37 °C до образования невросферы.
6. При достаточном образовании нейросферы собирают их с помощью пипетки в микропробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Повторно суспендируют гранулы и разделят их на несколько колбы, заполненных вышеуказанной питательной средой для поддержания первичных ГСК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ГСК, полученные от пациента, используемые в примере, были получены из хирургических биопсий 34-летнего пациента мужского пола с рецидивирующим ГБМ IV степени ВОЗ. GSC были названы XG387 для будущих экспериментов. Тесты на микоплазму на основе ПЦР были проведены для вышеуказанных ГСК, чтобы подтвердить отсутствие загрязнения микоплазмой. Все эксперименты с участием ГСК, используемые в этом протоколе, проводились <15 проходов.

2. Подготовка ГСК с метками люциферазы

1. Соберите ГСК из средней культуры и центрифугьте их при 70 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
2. Удалить надмное, переварить клетки с аккутазой в течение 4 мин при 37 °C. Используйте наконечник и пипетку емкостью 200 мкл несколько раз, чтобы диссоциировать и повторно суспендировать гранулу клетки.
3. Разбавьте клетки до 2 х 10⁵ клеток на скважину в 12-ю ямочную культурную пластину и культивируют клетки на ночь.
4. Добавьте 30 мкл супернатанта вируса люциферазы-EGFP (титр >10⁸ TU/мл) в каждую лунку в пластине, а затем центрифугируют клетки при 1000 х г в течение 2 ч при 25 °C. Культивь на ночь культивикуют клетки.
5. Обновите среду на следующий день и прокайте клетки еще 48 ч.
6. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить появление положительных клеток GFP.
7. Используйте сортировщик проточных клеток для сортировки и выбора GSC с высокой флуоресценцией GFP для дальнейшего культивирование клеток.

3. Измерение жизнеспособности клеток на основе биолюминесценции

1. Покрытие пластин смесью внеклеточного матрикса (ECM) (например, Matrigel): Добавьте 40 мкл смеси ECM 0,15 мг/мл в каждую скважину и инкубируем пластину в течение 1 ч при 37 °C. Удалите излишки смеси ECM и осторожно промойте один раз PBS.
2. Добавьте 100 мкл культуральная среда, содержащая 15 000, 10 000, 8000, 6000, 4000, 2000, 1000 и 500 клеток XG387-Luc вместе с пустой средой 100 мкл в качестве контрольной в каждую скважину для 6 реплиц в 96-скважинной оптической нижней пластине и культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C.
3. Удалить супернатант, добавить 50 мкл культуральная среда, содержащая 150 нг/мкл D-люциферина, в каждую лунку и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C.
4. Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых областей интересуемой области (ROI) и количественной оценки клеточной биолюминесценции.

4. Лечение темозоломидом и комбинированный скрининг

1. Предварительно обмазать четыре 96-скважинными пластинами, как описано выше, перед обработкой.
2. Засейте клетки XG387-Luc с плотностью 1000 клеток в 100 мкл культуральная среда в каждую скважину 96-скважинной оптической нижней пластины и культивированы клетки в течение ночи.
3. Заранее подготовьте темозоломид и целевые средства из запасного раствора. Готовят ряд концентраций, состоящий из 800 мкМ, 600 мкМ, 400 мкМ, 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ и 50 мкМ темозоломида в культуральная среда для одноагентной обработки. Разбавляют темозоломид и целевые агенты в стоковом растворе в культуральную среду, соответственно, для получения конечных концентраций 200 мкМ и 2 мкМ для скрининга комбинированных лекарственных средств(таблица 2).
4. Удалить питательную среду, когда большинство ГСК прилипают к нижней части пластин; добавляют вышеуказанную среду, содержащую темозоломид, в каждую скважину для трех технических реплик за обработку.
5. Для лечения Темозоломида и скрининга комбинаций лекарственных средств удаляют заготовленную среду и добавляют вышеприготовленную среду, содержащую либо 200 мкМ темозоломида, либо целевой агент 2 мкМ, либо комбинацию обоих в каждую скважину для трех технических реплик за лечение.
6. Инкубировать все пластины при 37 °C, 5% CO2 в течение 3 дней.
7. Удалить среду, содержащую лекарство, добавить в каждую скважину 50 мкл заготовки, содержащую 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C.
8. Сделайте снимки клеточной биолюминесценции в пластине с помощью системы визуализации спектра IVIS. Используйте встроенное программное обеспечение для создания нескольких круговых ROI и количественной оценки клеточной биолюминесценции.

5. Комбинированное лечение темозоломида и UMI-77 в клеточных линиях XG387-Luc и XG328-Luc

1. Предварительно обмазать три 96-скважинные пластины, как описано выше, перед обработкой.
2. Засейте клетки XG387-Luc и XG328-Luc с плотностью 1000 клеток соответственно в 100 мкл питательной среды в каждую скважину 96-скважинной оптической нижней пластины и культивированы клетки в течение ночи.
3. Готовят серию концентраций, состоящую из 600 мкМ, 400 мкМ, 300 мкМ, 200 мкМ, 100 мкМ, 50 мкМ и 0 мкМ темозоломида, и серию концентраций, состоящую из 6 мкМ, 4 мкМ, 3 мкМ, 2 мкМ, 1 мкМ, 0,5 мкМ и 0 мкМ UMI-77 в культуральная среда для матричной обработки шестью дозами.
4. Удалите пустой носитель, когда большинство ГСК прилипают к нижней части пластины; добавить выше подготовленную среду в каждую скважину для трех технических реплик за обработку.
5. Инкубируют эти пластины в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO_2.
6. Удалить лекарственно-содержащую среду; добавить в каждую скважину 50 мкл пустой среды, содержащей 150 нг/мкл D-люциферина, и инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C для измерения биолюминесценции.

6. Анализ данных

1. Рассчитайте показатель индекса чувствительности (СИ) темозоломида и целевого агента в соответствии с формулой на рисунке 2А.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка СИ предназначена для количественной оценки влияния добавления другого лекарственного средства. Он варьировался от -1 до +1, с положительными значениями, указывающими на синергетические эффекты темозоломида.
2. Рассчитайте значения комбинированного индекса (CI) между темозоломидом и UMI-77 с помощью программного обеспечения CompuSyn для анализа их комбинированных взаимодействий. Значение CI <1 указывает на синергию; Значение CI >1 указывает на антагонизм.
3. Рассчитайте высокие значения одного агента (HSA) между темозоломидом и UMI-77 с помощью программного обеспечения Combenefit. Значение HSA указывает на комбинированный ингибирующее действие. Значение HSA >0 указывает на синергию, а значение HSA <0 указывает на антагонизм.

Результаты

Клетки XG387 образовывали невросферы в питательной среде, описанной в таблице 1, в ультранизком прикреплении 6-скважинной культурной пластины или нешерстной пластины⁵ (фиг.1А). Во-первых, был проведен тест, чтобы проверить, была ли интенсивность биолюм?...

Обсуждение

В настоящем исследовании был описан протокол, который может быть применен для идентификации потенциальной комбинированной терапии ГБМ с использованием ГСК, полученных от пациента. В отличие от стандартной метрической модели синергии/аддитивности, такой как методы Loewe, BLISS или HSA, был и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.