JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

Abstract

פרוטוקול זה מזהה את חלבוני החסינות של אנזימי החיידקים: קוליצין E3 ובקטריוצין, המיוצר על ידי זן Escherichia coli פתוגניים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה דו-מושבית MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. חלבון החסינות של קוליצין E3 (Im3) וחלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) זוהו מיונים בולטים מסוג b ו/או y שנוצרו על ידי מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC) בצד ה- C-מסוף של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית ושאריות אספרגין על ידי מנגנון הפיצול של אפקט חומצה אספרטית. התוכנה סורקת במהירות רצפי חלבון סיליקו שמקורם ברצף הגנום כולו של זן החיידקים. התוכנה גם מסירה באופן איטרטיבי שאריות חומצת אמינו של רצף חלבון במקרה שרצף החלבון הבוגר נחתך. רצף חלבונים יחיד היה בעל מסה ורסיסים בקנה אחד עם אלה שזוהו עבור כל חלבון חסינות. לאחר מכן נבדק רצף המועמדים באופן ידני כדי לאשר שניתן להקצות את כל יונים הרסיסים שזוהו. המתיונין N-terminal של Im3 הוסר לאחר התרגום, ואילו לאים-באק היה את הרצף המלא. בנוסף, מצאנו כי רק שניים או שלושה יונים שבר לא משלימים שנוצרו על ידי PBC נחוצים כדי לזהות את רצף החלבון הנכון. לבסוף, מקדם (תיבת SOS) זוהה במעלה הזרם של הגנים האנטיבקטריאליים והחסינות בגנום פלסמיד של זן החיידקים.

Introduction

ניתוח וזיהוי של חלבונים לא מעוכאים על ידי ספקטרומטריית מסה מכונה ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה1,2,3,4. זוהי כעת טכניקה מבוססת המשתמשת יינון אלקטרו-ספריי (ESI)5 ומנתחי מסה ברזולוציה גבוהה6, וטכניקות דיסוציאציה מתוחכמות, למשל, דיסוציאציה להעברת אלקטרונים (ETD), דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD)7, דיסוציאציה פוטו-דיסוציאציה אולטרה סגולה (UV-PD)8,וכו '.

טכניקת היוניזציה הרכה האחרת היא desorption/ יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)9,10,11 כי כבר פחות נרחב בשימוש לניתוח מלמעלה למטה, בין היתר משום שהוא מצמיד בעיקר מנתחי מסה זמן טיסה (TOF), אשר יש רזולוציה מוגבלת לעומת מנתחי מסה אחרים. למרות מגבלות אלה, מכשירי MALDI-TOF ו- MALDI-TOF-TOF נוצלו לניתוח מהיר מלמעלה למטה של חלבונים טהורים ותערובות מופרדות ולא מופות של חלבונים. לזיהוי חלבונים טהורים, ריקבון במקור (ISD) היא טכניקה שימושית במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) של יונים של שברי ISD, כמו גם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (MS/MS) של שברי יון חלבון המספקים שבר ספציפי לרצף לעתים קרובות מה- N- ו- C-termini של חלבון היעד, בדומה לרצף אדמן12,13 . החיסרון בגישת ISD הוא, כמו ברצף אדמן, המדגם חייב להכיל רק חלבון אחד. דרישת החלבון האחת נובעת מהצורך בייחוס חד משמעי של יונים מקובעים ליון מקדים. אם שני חלבונים או יותר נמצאים במדגם, ייתכן שיהיה קשה להקצות אילו יונים מקדים שייכים לאיזה יונים קודמים.

ניתן לטפל בייחוס יון יון/מבשר באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS. כמו בכל ניסוי קלאסי של MS/MS, יונים קודמים נבחרים/מבודדים במסה לפני הפיצול, וניתן לייחס את יונים השברים שזוהו ליון מקדים ספציפי. עם זאת, טכניקות הניתוק הזמינות לגישה זו מוגבלות בעיקר לניתוק המושרה בהתנגשות אנרגיה גבוהה (HE-CID)14 או ריקבון לאחר המקור (PSD)15,16. HE-CID ו PSD הם היעילים ביותר בפיצול פפטידים וחלבונים קטנים, ואת כיסוי הרצף יכול, במקרים מסוימים, להיות מוגבל. בנוסף, PSD תוצאות מחשוף עמוד השדרה פוליפפטיד (PBC) בעיקר בצד C-מסוף של שאריות חומצה אספרטית וגלוטמית על ידי תופעה הנקראת אפקט חומצה אספרטית17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS מצא גם יישום נישה בזיהוי טקסונומי של מיקרואורגניזמים: חיידקים21, פטריות22, ווירוסים23. לדוגמה, ספקטרום MS משמש לזיהוי חיידקים לא ידועים בהשוואה לספריית ייחוס של ספקטרום MS של חיידקים ידועים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי דפוסים לשם השוואה. גישה זו הוכיחה את עצמה כמוצלחת מאוד בגלל המהירות והפשטות שלה, אם כי דורשת פולחן בן לילה של הבידוד. יונים חלבון שזוהו על ידי גישה זו (בדרך כלל תחת 20 kDa) מורכב טביעת אצבע MS המאפשר רזולוציה טקסונומית ברמת הסוג והמינים ובמקרים מסוימים בתת מינים24 ורמתזן 25,26. עם זאת, עדיין יש צורך לא רק לסווג טקסונומית מיקרואורגניזמים פתוגניים, אלא גם לזהות גורמי וירוליציה ספציפיים, רעלים, וגורמי התנגדות מיקרוביאלית (AMR). כדי להשיג זאת, המסה של פפטידים, חלבונים, או מולקולות קטנות נמדדים על ידי MS ולאחר מכן מבודדים ומפוצלים על ידי MS / MS.

חיידקים פתוגניים נושאים לעתים קרובות חתיכות עגולות של DNA הנקראות פלסמידים. פלסמידים, יחד עם פרופג'ים, הם וקטור מרכזי של העברת גנים אופקית בין חיידקים ואחראים להתפשטות המהירה של עמידות מיקרוביאלית וגורמי אלימות אחרים על פני חיידקים. פלסמידים עשויים גם לשאת גנים אנטיבקטריאליים (AB), למשל, קוליצין ובקטריוצין. כאשר גנים אלה באים לידי ביטוי והחלבונים מופרשים, הם פועלים כדי להשבית את מכונות תרגום החלבון של חיידקים שכנים הכובשים את אותה נישה סביבתית27. עם זאת, אנזימים חיידקיים אלה יכולים גם להוות סיכון לפונדקאי שייצר אותם. כתוצאה מכך, גן מתבטא במשותף על ידי המארח המעכב באופן ספציפי את תפקודו של אנזים AB ומכונה חלבון החסינות שלו (Im).

אנטיביוטיקה מזיקה לדנ"א כגון mitomycin-C וציפרופלוקסצין משמשות לעתים קרובות כדי לגרום לתגובת SOS ב- E. coli המייצר רעלן Shiga (STEC) שהגן שלו רעלן שיגה(STX) נמצא בתוך גנום פרופג 'הנמצא בגנום החיידקי28. השתמשנו באינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה בעבר כדי לזהות ולזהות סוגי Stx וסוגי משנה המיוצרים על ידי זני STEC29,30,31,32. בעבודה הקודמת, STEC O113:H21 זן RM7788 היה תרבותי בן לילה על תקשורת אגר בתוספת mitomycin-C. עם זאת, במקום לזהות את B-subunit הצפוי של Stx2a ב m / z ~7816, יון חלבון שונה זוהה ב m / z ~ 7839 וזוהה כחלבון היפותטי מקודד פלסמיד של פונקציה לא ידועה33. בעבודה הנוכחית, זיהינו שני חלבוני AB-Im מקודדים פלסמיד המיוצרים על ידי זן זה באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה באמצעות תוכנה עצמאית שפותחה לעיבוד וסריקה ברצפי חלבון סיליקו המופקים מרצף גנום שלם (WGS). בנוסף, האפשרות של שינויים לאחר התרגום (PTM) מעורבים truncation רצף שולבו בתוכנה. חלבוני החסינות זוהו באמצעות תוכנה זו מהמסה הנמדדת של יון החלבון הבוגר ויוני שבר ספציפיים לרצף מ- PBC שנגרמו על ידי אפקט החומצה אספרטית וזוהו על ידי MS/ MS-PSD. לבסוף, מקדם זוהה במעלה הזרם של הגנים AB / Im בגנום plasmid שעשוי להסביר את הביטוי של גנים אלה כאשר זן זה נחשף לאנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA. חלקים מעבודה זו הוצגו בכנס הווירטואלי של האגודה האמריקנית הלאומית לכימיה בסתיו 2020 (17-20 באוגוסט 2020)34.

Protocol

1. הכנת דגימה מיקרוביולוגית

  1. לחסן 25 מ"ל של מרק לוריא (LB) בצינור חרוט 50 מ"ל עם E. coli O113:H21 זן RM7788 (או זן חיידקי אחר) ממלאי גליצל באמצעות לולאת μL סטרילית. מכסים את הצינור ואת טרום התרבות ב 37 °C (37 °F) עם רועד (200 סל"ד) עבור 4 שעות.
  2. Aliquot 100 μL של מרק מתורבת מראש להתפשט על צלחת אגר LB בתוספת 400 או 800 ng/mL של mitomycin-C. צלחות אגר תרבות סטטיות לילה באינקובטור ב 37 °C (50 °F).
    זהירות: זני STEC הם מיקרואורגניזמים פתוגניים. בצע את כל המניפולציות המיקרוביולוגיות, מעבר לכת, בארון בטיחות ביולוגית BSL-2.
  3. קציר תאים חיידקיים ממושבות גלויות בודדות באמצעות לולאת μL סטרילית של 1 μL ועבר לצינור מיקרוצנטריפוגה מצופה טבעת O בגודל 2.0 מ"ל המכיל 300 μL של מים באיכות HPLC. כיפה הצינור, מערבולת בקצרה, וצנטריפוגה ב 11,337 x g במשך 2 דקות כדי כדורי התאים.

2. ספקטרומטריית מסה

  1. ספוט 0.75 μL aliquot של supernatant מדגם על היעד MALDI נירוסטה ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובש עם a0.75 μL aliquot של פתרון רווי של חומצה סינפינית ב 33% acetonitrile, 67% מים, 0.2% חומצה טריפלואורסטית. אפשר למקום להתייבש.
  2. לנתח את כתמי המדגם היבש באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF-TOF.
    1. לאחר טעינת יעד MALDI לספקטרומטר המסה, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב ליניארי של MS בתוכנת הרכישה. הזן את טווח m/z שיש לנתח על-ידי הזנת m/z של הגבול התחתון והעליון (למשל, 2 kDa עד 20 kDa) לשדות המתאימים שלהם בתוכנת שיטת הרכישה.
    2. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן, הלחצו על לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 1,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם.
      הערה: רכישת נתונים מוצגת בזמן אמת בחלון רכישת התוכנה.
    3. אם לא מזוהים יונים, הגדל את עוצמת הלייזר על-ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר בתוכנה עד לזיהוי אות החלבון יון. זה נקרא סף.
      הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, כייל חיצונית את המכשיר במצב ליניארי MS עם כיול חלבון אשר m / z משתרע על פני הטווח מנותח, למשל, +1 ו + 2 מטען מצבים של כיול חלבון: cytochrome-C, ליזוזים, ומיוגלובין לכסות טווח מסה של 2 kDa עד 20 kDa. מסת ביניים בטווח המסה שצוין משמשת כמסה ממוקדת, למשל, 9 kDa. מסת המיקוד היא היון שמ"ק שלו ממוקד באופן אופטימלי לזיהוי על ידי גלאי המצב הליניארי.
    4. לאחר השלמת רכישת המצב הליניארי של MS, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב רפלקטורון MS/MS בתוכנת הרכישה. הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד (ב- Da) לתוך חלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת, למשל, ±100 Da.
    5. לחץ על כפתור כיבוי CID. לחץ על לחצן מדכא Metastable ON. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מערכה המרבי על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה מתחת לעוצמת הלייזר בתוכנה.
    6. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 10,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם.
      הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, המכשיר צריך להיות מכויל חיצונית במצב MS / MS-רפלקטורון באמצעות יונים קטע מריקבון לאחר המקור (PSD) של מצב הטעינה +1 של thioredoxin אלקילסין35.
  3. אל תעבד נתוני MS גולמיים. עבד נתונים גולמיים MS/MS-PSD באמצעות רצף השלבים הבא בסדר שצוין: תיקון בסיסי מתקדם (32, 0.5, 0.0) ואחריו הסרת רעש (שתי סטיות תקן) ואחריו החלקה גאוסית (31 נקודות).
  4. בדוק באופן ידני נתוני MS/MS-PSD לנוכחות של יונים בולטים שנוצרו על-ידי PBC19,20.
  5. להעריך נתוני MS/MS ביחס לשפע המוחלט והיחסי של יונים מקוטעים והאות לרעש שלהם (S/N). השתמש רק ביונים השופעים ביותר לזיהוי חלבונים, במיוחד אם נתוני MS/MS-PSD רועשים.

3. בבניית מסד נתונים של חלבון סיליקו

  1. צור קובץ טקסט המכיל רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים, אשר יסרק על ידי תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון לזיהוי החלבון. רצפי חלבונים נגזרים ריצוף גנום שלם (WGS) של הזן המנותח (או זן קשור קשר הדוק).
  2. גש לאתר NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) כדי להוריד כ-5,000 רצפי חלבונים של זן החיידקים הספציפי (למשל, Escherichia coli O113:H21 זן RM7788) מנותח. גודל ההורדה המרבי הוא 200 רצפים.
    1. כתוצאה מכך, העתק והדבק את 25 ההורדות בקובץ טקסט יחיד. בחר בתבנית FASTA (טקסט) עבור כל הורדה.

4. הפעלת תוכנה למחפש סמנים ביולוגיים של חלבון

  1. לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון. חלון ממשק משתמש גרפי (GUI) יופיע(איור 1, החלונית העליונה).
  2. הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון (כפי שהוא נמדד במצב MS-ליניארי) לשדה מסת חלבון בוגרת. לאחר מכן, הזן את שגיאת מדידת המסה בשדה 'רגישות למסה'. שגיאת מדידת המסה הסטנדרטית היא ±10 Da עבור חלבון 10,000 Da.
  3. לחלופין, לחץ על לחצן מחשבון מסת חלבון יון משלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים משלים של שברים (CFIP או b/y). חלון מוקפץ, כלי מחשבון מסת חלבון, יופיע(איור 1, החלונית התחתונה).
    1. הזן את m/z של CFIP putative ולחץ על לחצן הוסף זוג. מסת החלבון המחושבת תופיע.
    2. העתק והדבק מספר זה בשדה 'מסת חלבון בוגרת' וסגור את החלון 'הכלי מחשבון מסת חלבון'.
  4. בחר אורך פפטיד של אות N-מסוף על-ידי לחיצה על התיבה הגדר הגבלת שאריות. יופיע חלון מוקפץ עם קנה מידה וסמן הזזה. הזז את הסמן לאורך פפטיד האות הרצוי (מקסימום 50). אם לא נבחר אורך פפטיד של אותות, התוכנה תבצע רצף בלתי מוגבל.
  5. תחת מצב Ion שבר ב- GUI, בחר שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC). לחץ על הקופסאות של שאריות אחת או יותר: D, E, N ו/או P.
    1. לחץ על לחצן הזן יונים של קטעים (+1) לחיפוש. יופיע עמוד קטעים מוקפץ. לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף קטע יון, התואם למספר יונים מקטעים שיש להזין, כלומר, לחיצה אחת עבור כל יון קטע. יופיע שדה נפתח עבור הזנת כל יון קטע.
    2. הזן את m/z של יונים שבר ואת הסבילות m/z הקשורים שלהם. לאחר השלמת, לחץ על לחצן שמור וסגור.
      הערה: סובלנות סבירה m / z היא ±1.5.
    3. בחר את המספר המינימלי של יונים מקוטעים שיש להתאים לזיהוי על-ידי גלילה למספר הרצוי בתיבה שמימין למספר Ions קטעים שיש להתאים.
      הערה: שלושה משחקים צריכים להיות מספיקים.
    4. בחר שאריות ציסטאין להיות במצבם החמוץ על ידי לחיצה על המעגל המתאים. אם לא נמצאו זיהויי חלבון לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. אם לא נמצאו זיהויים לאחר החיפוש, הרחב את הסבילות ליונים של הקטע ל- ±3 וחזור על החיפוש.
  6. תחת הגדרת הקובץ, לחץ על לחצן בחר קובץ FASTA כדי לעיין ולבחור את הקובץ FASTA (טקסט) המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר בשלבי פרוטוקול 3.1 עד 3.2. לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט.
  7. לחץ על לחצן הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש (איור 1, החלונית התחתונה), המציג את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.
  8. אם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על לחצן התחל חיפוש. אם פרמטרי החיפוש אינם נכונים, לחץ על לחצן ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר נסגר ומופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות(איור 1, החלונית התחתונה) המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.
  9. עם השלמת החיפוש (מספר שניות), מד ההתקדמות נסגר באופן אוטומטי וסיכום החיפוש מוצג בשדה יומן הרישום של ה- GUI (איור 2, החלונית העליונה). בנוסף, יופיע גם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהוי החלבון אם בכלל (איור 2, החלונית התחתונה).
    הערה: ברצפי חלבון סיליקו בעלי שאריות לא מזוהות, למשל, U או X, מדלגים באופן אוטומטי מהניתוח ורצפים אלה מדווחים לאחר מכן עם חלון מוקפץ נפרד כדי להתריע בפני המפעיל על אילו רצפים (אם בכלל) דילגו עם השלמת החיפוש.

5. אישור לאחר החיפוש של רצף החלבון

  1. אשר את הנכונות של רצף מועמדים על ידי ניתוח ידני.
    הערה: מטרת התוכנה מחפש סמן ביולוגי חלבון היא לזהות רצף חלבון עם דיוק גבוה על ידי ביטול רצפי חלבון שגויים רבים מן השיקול ושילוב רצף גיזום כ- PTM אפשרי בחלבון הבוגר. מכיוון שמספר רצפי המועמדים האפשריים המוחזרים הוא מעט, ניתן לניהול באישור ידני.
  2. צור טבלה של m/z הממוצע של ions קטע מסוג b ו- y של רצף המועמדים באמצעות כל ספקטרומטריית מסה או תוכנה פרוטאומית בעלת פונקציונליות כזו. השווה את m/z הממוצע של יונים שבר סיליקו בצד C-מסוף של D-, E-, ו- N-שאריות (ועל צד N-מסוף של שאריות P) כדי m /z של יונים שבר בולטים מנתוני MS / MS-PSD.
    הערה: יש להתאים בקלות את יוני הרסיסים הבולטים ביותר של MS/MS-PSD ל- D-, E-ו- N המשויכים ליונים של שבר סיליקו. עם זאת, מנגנון פיצול אפקט חומצה אספרטית הוא פחות יעיל ליד N- או C-termini של רצף חלבון36.

תוצאות

איור 3 (פאנל עליון) מציג את MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 400 ng / mL mitomycin-C. פסגות ב m/ z 7276, 7337, ו 7841 זוהו בעבר כמו חלבון הלם קר C (CspC), חלבון הלם קר E (CspE), וחלבון נישא פלסמיד של פונקציה לא ידועה, בהתאמה33. יון החלבון ב-m/z 9780 [M+H]+ נותח על-ידי MS/MS-PSD כפי שמוצג ...

Discussion

שיקולי פרוטוקול
החוזקות העיקריות של הפרוטוקול הנוכחי הן המהירות, הפשטות של הכנת המדגם, ושימוש במכשיר קל יחסית לתפעול, להיות מאומן ולתחזק. למרות שניתוח פרוטאומי מלמטה למעלה ולמעלה למטה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ESI-HR-MS נמצאים בכל מקום ועליונות בהרבה במובנים רבים מלמעלה למטה על יד...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון זמינה באופן חופשי (ללא עלות) על ידי יצירת קשר עם קליפטון ק. פג'רקוויסט בשעה clifton.fagerquist@usda.gov. אנו רוצים להכיר בתמיכה במחקר זה על ידי ARS, USDA, מענק CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4000 Series Explorer softwareAB SciexVersion 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA996-1
BSL-2 biohazard cabinetThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Data Explorer softwareAB SciexVersion 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersion 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ringFisher Scientific02-681-343
MiniSpin Plus CentrifugeEppendorf22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Sinapinic acidThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL loopsFisher Scientific22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)SigmaT0910-1MG
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537-100G
Water Optima LC/MS gradeFisher ChemicalW6-4

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved