Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Résumé

Ce protocole identifie les protéines immunitaires des enzymes bactéricides : la colicine E3 et la bactériocine, produites par une souche pathogène d’Escherichia coli à l’aide d’une induction antibiotique, et identifiées par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. La protéine d’immunité de la colicine E3 (Im3) et la protéine d’immunité de la bactériocine (Im-Bac) ont été identifiées à partir d’ions fragments proéminents de type b et/ou y générés par le clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) sur le côté C-terminal de l’acide aspartique, de l’acide glutamique et des résidus d’asparagine par le mécanisme de fragmentation de l’effet de l’acide aspartique. Le logiciel scanne rapidement les séquences protéiques in silico dérivées du séquençage du génome entier de la souche bactérienne. Le logiciel élimine également de manière itérative les résidus d’acides aminés d’une séquence protéique dans le cas où la séquence protéique mature est tronquée. Une seule séquence protéique possédait des ions de masse et de fragment cohérents avec ceux détectés pour chaque protéine d’immunité. La séquence candidate a ensuite été inspectée manuellement pour confirmer que tous les ions fragments détectés pouvaient être attribués. La méthionine N-terminale d’Im3 a été enlevée post-traductionnellement, tandis que Im-Bac avait la séquence complète. De plus, nous avons constaté que seulement deux ou trois ions fragments non complémentaires formés par la CBP sont nécessaires pour identifier la séquence protéique correcte. Enfin, un promoteur (SOS box) a été identifié en amont des gènes antibactériens et immunitaires dans un génome plasmidique de la souche bactérienne.

Introduction

L’analyse et l’identification des protéines non digérées par spectrométrie de masse sont appelées analyse protéomique descendante^1,2,3,4. C’est maintenant une technique établie qui utilise l’ionisation par électropulvérisation (ESI)⁵ et les analyseurs de masse à haute résolution^6,ainsi que des techniques de dissociation sophistiquées, par exemple la dissociation par transfert d’électrons (ETD), la dissociation par capture d’électrons (ECD)^7,la photo-dissociation ultravio....

Protocole

1. Préparation des échantillons microbiologiques

1. Inoculer 25 mL de bouillon Luria (LB) dans un tube conique de 50 mL avec la souche RM7788 (ou une autre souche bactérienne) d’E. coli O113:H21 provenant d’un stock de glycérol à l’aide d’une boucle stérile de 1 μL. Bouchon du tube et pré-culture à 37 °C en agitant (200 tr/min) pendant 4 h.
2. Aliquote 100 μL de bouillon pré-cultivé et étaler sur une plaque de gélose LB complétée par 400 ou 800 ng/mL de mitomycine-C. Plaques de gélose de culture statiquement pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C.
   ATTENTION : Les souches STEC sont des micro-organismes pathogènes. Effectuer toutes les man....

Résultats

La figure 3 (panneau supérieur) montre le MS de la souche RM7788 de STEC O113:H21 cultivée pendant la nuit sur LBA supplémenté de 400 ng/mL de mitomycine-C. Les pics à m/z 7276, 7337 et 7841 avaient été identifiés précédemment comme étant la protéine C (CspC) du choc froid, la protéine E (CspE) et une protéine transmise par le plasmide de fonction inconnue, respectivement³³. L’ion protéique à m/z 9780 [M+H]⁺ a été analysé par MS/MS-PSD .......

Discussion

Considérations relatives au protocole
Les principaux points forts du protocole actuel sont sa rapidité, la simplicité de préparation des échantillons et l’utilisation d’un instrument relativement facile à utiliser, à former et à entretenir. Bien que l’analyse protéomique ascendante et descendante par chromatographie liquide-ESI-HR-MS soit omniprésente et de loin supérieure à bien des égards à l’analyse descendante par MALDI-TOF-TOF, elle nécessite plus de temps, de travail et d?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4000 Series Explorer software	AB Sciex	Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer	AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	A996-1
BSL-2 biohazard cabinet	The Baker Company	SG403A-HE
Cytochrome-C	Sigma	C2867-10MG
Data Explorer software	AB Sciex	Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit	G-Biosciences	786-231
GPMAW software	Lighthouse Data	Version 10.0
Incubator	VWR	9120973
LB Agar	Invitrogen	22700-025
Luria Broth	Invitrogen	12795-027
Lysozyme	Sigma	L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring	Fisher Scientific	02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge	Eppendorf	22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)	Sigma-Aldrich	M0440-5MG
Myoglobin	Sigma	M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420	Thermo Scientific	Model 420
Sinapinic acid	Thermo Scientific	1861580
Sterile 1 uL loops	Fisher Scientific	22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)	Sigma	T0910-1MG
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537-100G
Water Optima LC/MS grade	Fisher Chemical	W6-4