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Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Résumé

Ce protocole identifie les protéines immunitaires des enzymes bactéricides : la colicine E3 et la bactériocine, produites par une souche pathogène d’Escherichia coli à l’aide d’une induction antibiotique, et identifiées par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. La protéine d’immunité de la colicine E3 (Im3) et la protéine d’immunité de la bactériocine (Im-Bac) ont été identifiées à partir d’ions fragments proéminents de type b et/ou y générés par le clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) sur le côté C-terminal de l’acide aspartique, de l’acide glutamique et des résidus d’asparagine par le mécanisme de fragmentation de l’effet de l’acide aspartique. Le logiciel scanne rapidement les séquences protéiques in silico dérivées du séquençage du génome entier de la souche bactérienne. Le logiciel élimine également de manière itérative les résidus d’acides aminés d’une séquence protéique dans le cas où la séquence protéique mature est tronquée. Une seule séquence protéique possédait des ions de masse et de fragment cohérents avec ceux détectés pour chaque protéine d’immunité. La séquence candidate a ensuite été inspectée manuellement pour confirmer que tous les ions fragments détectés pouvaient être attribués. La méthionine N-terminale d’Im3 a été enlevée post-traductionnellement, tandis que Im-Bac avait la séquence complète. De plus, nous avons constaté que seulement deux ou trois ions fragments non complémentaires formés par la CBP sont nécessaires pour identifier la séquence protéique correcte. Enfin, un promoteur (SOS box) a été identifié en amont des gènes antibactériens et immunitaires dans un génome plasmidique de la souche bactérienne.

Introduction

L’analyse et l’identification des protéines non digérées par spectrométrie de masse sont appelées analyse protéomique descendante1,2,3,4. C’est maintenant une technique établie qui utilise l’ionisation par électropulvérisation (ESI)5 et les analyseurs de masse à haute résolution6,ainsi que des techniques de dissociation sophistiquées, par exemple la dissociation par transfert d’électrons (ETD), la dissociation par capture d’électrons (ECD)7,la photo-dissociation ultraviolette (UV-PD)8,etc.

L’autre technique d’ionisation douce est la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)9,10,11 qui a été moins largement utilisée pour l’analyse descendante, en partie parce qu’elle est principalement couplée à des analyseurs de masse à temps de vol (TOF), qui ont une résolution limitée par rapport aux autres analyseurs de masse. Malgré ces limitations, les instruments MALDI-TOF et MALDI-TOF-TOF ont été exploités pour l’analyse descendante rapide de protéines pures et de mélanges de protéines fractionnés et non fractionnés. Pour l’identification des protéines pures, la désintégration à la source (ISD) est une technique particulièrement utile car elle permet l’analyse par spectrométrie de masse (MS) des ions fragments ISD, ainsi que la spectrométrie de masse en tandem (MS /MS) de fragments d’ions protéiques fournissant un fragment spécifique à la séquence souvent à partir des N- et C-termini de la protéine cible, analogue au séquençage d’Edman12,13 . Un inconvénient de l’approche ISD est que, comme dans le séquençage d’Edman, l’échantillon ne doit contenir qu’une seule protéine. Le seul besoin en protéines est dû à la nécessité d’attribuer sans ambiguïté des ions fragments à un ion précurseur. Si deux protéines ou plus sont présentes dans un échantillon, il peut être difficile d’attribuer quels ions fragments appartiennent à quels ions précurseurs.

L’attribution d’ions fragments/ions précurseurs peut être traitée à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Comme pour toute expérience MS/MS classique, les ions précurseurs sont sélectionnés en masse/isolés avant la fragmentation, et les ions fragments détectés peuvent être attribués à un ion précurseur spécifique. Cependant, les techniques de dissociation disponibles pour cette approche se limitent principalement à la dissociation induite par collision à haute énergie (HE-CID)14 ou à la désintégration post-source (PSD)15,16. HE-CID et PSD sont les plus efficaces pour fragmenter les peptides et les petites protéines, et la couverture de séquence peut, dans certains cas, être limitée. De plus, la DSIP entraîne un clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) principalement du côté C-terminal des résidus d’acide aspartique et glutamique par un phénomène appelé effet acide aspartique17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS a également trouvé une application de niche dans l’identification taxonomique des micro-organismes : bactéries21,champignons22et virus23. Par exemple, les spectres MS sont utilisés pour identifier les bactéries inconnues par rapport à une bibliothèque de référence des spectres MS des bactéries connues à l’aide d’algorithmes de reconnaissance de formes à des fins de comparaison. Cette approche s’est avérée très efficace en raison de sa rapidité et de sa simplicité, bien qu’elle nécessite une culture nocturne de l’isolat. Les ions protéiques détectés par cette approche (généralement inférieurs à 20 kDa) comprennent une empreinte MS permettant une résolution taxonomique au niveau du genre et de l’espèce et dans certains cas au niveau de la sous-espèce24 et de la souche25,26. Cependant, il reste nécessaire non seulement de classer taxonomiquement les micro-organismes potentiellement pathogènes, mais aussi d’identifier des facteurs de virulence, des toxines et des facteurs de résistance aux antimicrobiens (RÉSISTANCE AUX ANTIMICROBIENS) spécifiques. Pour ce faire, la masse de peptides, de protéines ou de petites molécules est mesurée par la SEP, puis isolée et fragmentée par la SEP/SEP.

Les bactéries pathogènes portent souvent des morceaux circulaires d’ADN appelés plasmides. Les plasmides, ainsi que les prophages, sont un vecteur majeur de transfert horizontal de gènes entre les bactéries et sont responsables de la propagation rapide de la résistance aux antimicrobiens et d’autres facteurs de virulence à travers les bactéries. Les plasmides peuvent également être porteurs de gènes antibactériens (AB), par exemple la colicine et la bactériocine. Lorsque ces gènes sont exprimés et que les protéines sont sécrétées, ils agissent pour désactiver la machinerie de traduction des protéines des bactéries voisines occupant la même nicheenvironnementale 27. Cependant, ces enzymes bactéricides peuvent également poser un risque pour l’hôte qui les a produites. En conséquence, un gène est co-exprimé par l’hôte qui inhibe spécifiquement la fonction d’une enzyme AB et est appelé sa protéine d’immunité (Im).

Les antibiotiques endommageant l’ADN tels que la mitomycine-C et la ciprofloxacine sont souvent utilisés pour induire la réponse SOS chez E. coli producteur de toxine Shiga (STEC) dont le gène de la toxine Shiga(stx) se trouve dans un génome de prophage présent dans le génome bactérien28. Nous avons déjà utilisé l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS et l’analyse protéomique descendante pour détecter et identifier les types et sous-types Stx produits par les souches STEC29,30,31,32. Dans les travaux précédents, la souche RM7788 de STEC O113:H21 a été cultivée pendant la nuit sur un milieu d’agar supplémenté en mitomycine-C. Cependant, au lieu de détecter la sous-unité B anticipée de Stx2a à m/z ~7816, un ion protéique différent a été détecté à m/z ~7839 et identifié comme une protéine hypothétique codée par plasmide de fonction inconnue33. Dans les travaux actuels, nous avons identifié deux protéines AB-Im codées en plasmides produites par cette souche à l’aide de l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, et d’une analyse protéomique descendante à l’aide d’un logiciel autonome développé pour traiter et scanner des séquences de protéines in silico dérivées du séquençage du génome entier (WGS). En outre, la possibilité de modifications post-traduction (PTM) impliquant une troncature de séquence a été intégrée au logiciel. Les protéines immunitaires ont été identifiées à l’aide de ce logiciel à partir de la masse mesurée de l’ion protéique mature et des ions fragments spécifiques à la séquence de la CBP causés par l’effet de l’acide aspartique et détectés par MS/MS-PSD. Enfin, un promoteur a été identifié en amont des gènes AB/Im dans un génome plasmidique qui peut expliquer l’expression de ces gènes lorsque cette souche est exposée à un antibiotique endommageant l’ADN. Des parties de ce travail ont été présentées à la National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 août 2020)34.

Protocole

1. Préparation des échantillons microbiologiques

  1. Inoculer 25 mL de bouillon Luria (LB) dans un tube conique de 50 mL avec la souche RM7788 (ou une autre souche bactérienne) d’E. coli O113:H21 provenant d’un stock de glycérol à l’aide d’une boucle stérile de 1 μL. Bouchon du tube et pré-culture à 37 °C en agitant (200 tr/min) pendant 4 h.
  2. Aliquote 100 μL de bouillon pré-cultivé et étaler sur une plaque de gélose LB complétée par 400 ou 800 ng/mL de mitomycine-C. Plaques de gélose de culture statiquement pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C.
    ATTENTION : Les souches STEC sont des micro-organismes pathogènes. Effectuer toutes les manipulations microbiologiques, au-delà de la culture, dans une armoire de biosécurité BSL-2.
  3. Prélever des cellules bactériennes à partir de colonies visibles uniques à l’aide d’une boucle stérile de 1 μL et les transférer dans un tube de microcentrifuge à bouchon à vis de 2,0 mL contenant 300 μL d’eau de qualité HPLC. Bouchonner le tube, vortex brièvement et centrifuger à 11 337 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.

2. Spectrométrie de masse

  1. Repérez 0,75 μL d’aliquote du surnageant de l’échantillon sur la cible MALDI en acier inoxydable et laissez-la sécher. Superposer la tache de l’échantillon séché avec une aliquote de 0,75 μL d’une solution saturée d’acide sinapinique dans 33 % d’acétonitrile, 67 % d’eau et 0,2 % d’acide trifluoracétique. Laissez sécher l’endroit.
  2. Analyser les taches d’échantillon séchées à l’aide d’un spectromètre de masse MALDI-TOF-TOF.
    1. Après avoir chargé la cible MALDI dans le spectromètre de masse, cliquez sur le bouton d’acquisition du mode linéaire MS dans le logiciel d’acquisition. Entrez la plage m/z à analyser en entrant le m/z des limites inférieure et supérieure (par exemple, 2 kDa à 20 kDa) dans leurs champs respectifs dans le logiciel de méthode d’acquisition.
    2. Cliquez sur le point d’échantillon à analyser sur le modèle de cible MALDI dans le logiciel. Ensuite, appuyez sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur de la souris sur le point d’échantillonnage pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour l’ablation/ionisation au laser. Relâchez le bouton de la souris et l’acquisition sera initiée. Collectez 1 000 prises de vue laser pour chaque point d’échantillon.
      REMARQUE : L’acquisition de données est affichée en temps réel dans la fenêtre d’acquisition du logiciel.
    3. Si aucun ion n’est détecté, augmentez l’intensité du laser en ajustant la barre d’échelle mobile sous Intensité laser dans le logiciel jusqu’à ce que le signal d’ions protéiques soit détecté. C’est ce qu’on appelle le seuil.
      REMARQUE: Avant l’analyse ponctuelle de l’échantillon, calibrer l’instrument en mode linéaire MS avec des calibrants protéiques dont m/z couvrent la plage analysée, par exemple, les états de charge +1 et +2 des calibrants protéiques: cytochrome-C, lysozyme et myoglobine couvrent une gamme de masse de 2 kDa à 20 kDa. Une masse intermédiaire dans la plage de masse spécifiée est utilisée comme masse focale, par exemple 9 kDa. La masse focale est l’ion dont m/z est focalisé de manière optimale pour la détection par le détecteur en mode linéaire.
    4. Lorsque l’acquisition du mode linéaire MS est terminée, cliquez sur le bouton d’acquisition du mode réflectron MS/MS dans le logiciel d’acquisition. Entrez la masse précurseur à analyser dans le champ Masse précurseur. Ensuite, entrez une largeur d’isolement (en Da) dans la fenêtre Masse du précurseur pour le côté de masse faible et élevée de la masse du précurseur, par exemple, ±100 Da.
    5. Cliquez sur le bouton CID Off. Cliquez sur le bouton Metastable Suppressor ON. Réglez l’intensité du laser à au moins 90 % de sa valeur maximale en ajustant la barre d’échelle mobile sous l’intensité du laser dans le logiciel.
    6. Cliquez sur le point d’échantillon à analyser sur le modèle de cible MALDI dans le logiciel. Appuyez ensuite sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur de la souris sur le point d’échantillonnage pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour l’ablation /ionisation au laser. Relâchez le bouton de la souris et l’acquisition commencera. Collectez 10 000 prises de vue laser pour chaque point d’échantillonnage.
      REMARQUE: Avant l’analyse ponctuelle de l’échantillon, l’instrument doit être étalonné à l’extérieur en mode MS/MS-reflectron en utilisant les ions fragments provenant de la désintégration post-source (PSD) de l’état de charge +1 de la thiorédoxinealkylée 35.
  3. Ne traitez pas les données brutes de la SEP. Traiter les données brutes MS/MS-PSD en utilisant la séquence d’étapes suivante dans l’ordre spécifié : correction avancée de la ligne de base (32, 0,5, 0,0) suivie de l’élimination du bruit (deux écarts-types) suivie d’un lissage gaussien (31 points).
  4. Inspectez manuellement les données MS/MS-PSD pour la présence d’ions fragments proéminents générés par PBC19,20.
  5. Évaluer les données MS/MS en ce qui concerne l’abondance absolue et relative des ions fragments et leur rapport signal-bruit (S/N). N’utilisez que les ions fragments les plus abondants pour l’identification des protéines, surtout si les données MS/MS-PSD sont bruyantes.

3. Construction d’une base de données sur les protéines in silico

  1. Générez un fichier texte contenant des séquences protéiques in silico de la souche bactérienne, qui seront scannées par le logiciel Protein Biomarker Seeker pour l’identification des protéines. Les séquences protéiques sont dérivées du séquençage du génome entier (WGS) de la souche analysée (ou d’une souche étroitement apparentée).
  2. Accédez au site Web NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) pour télécharger environ 5 000 séquences protéiques de la souche bactérienne spécifique (p. ex., Escherichia coli O113:H21 souche RM7788) analysée. La taille maximale du téléchargement est de 200 séquences.
    1. En conséquence, copiez et collez les 25 téléchargements dans un seul fichier texte. Sélectionnez le format FASTA (texte) pour chaque téléchargement.

4. Utilisation du logiciel Protein Biomarker Seeker

  1. Double-cliquez sur le fichier exécutable Protein Biomarker Seeker. Une fenêtre d’interface utilisateur graphique (GUI) apparaîtra(Figure 1, panneau supérieur).
  2. Entrez la masse du biomarqueur protéique (mesurée en mode linéaire MS) dans le champ Masse protéique mature. Ensuite, entrez l’erreur de mesure de masse dans le champ Tolérance de masse. L’erreur de mesure de masse standard est de ±10 Da pour une protéine 10 000 Da.
  3. Si vous le souhaitez, cliquez sur le bouton Calculateur de masse protéique ionique b/y complémentaire afin de calculer la masse protéique à partir d’une paire d’ions de fragment complémentaire putatif (CFIP ou b/y). Une fenêtre contextuelle, Protein Mass Calculator Tool, apparaîtra(Figure 1,panneau inférieur).
    1. Entrez le m/z du CFIP putatif et cliquez sur le bouton Ajouter une paire. La masse protéique calculée apparaîtra.
    2. Copiez et collez ce nombre dans le champ Masse protéique mature et fermez la fenêtre Outil calculateur de masse protéique.
  4. Sélectionnez une longueur de peptide de signal N-terminal en cliquant sur la case Définir la restriction des résidus. Une fenêtre contextuelle avec une échelle mobile et un curseur apparaîtra. Déplacez le curseur sur la longueur de peptide de signal souhaitée (maximum 50). Si aucune longueur de peptide de signal n’est sélectionnée, une troncature de séquence sans restriction sera effectuée par le logiciel.
  5. Sous la condition d’ion fragment dans l’interface graphique, sélectionnez les résidus pour le clivage de l’épine dorsale polypeptidique (PBC). Cliquez sur les cases d’un ou plusieurs résidus : D, E, N et/ou P.
    1. Cliquez sur le bouton Entrer les ions fragments (+1) à rechercher. Une page de fragments contextuelle apparaîtra. Ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un fragment d’ion, qui correspond au nombre d’ions de fragment à saisir, c’est-à-dire un clic pour chaque ion de fragment. Un champ déroulant apparaîtra pour chaque fragment d’ion à saisir.
    2. Entrez le m/z des ions fragment et leur tolérance m/z associée. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur le bouton Enregistrer et fermer.
      REMARQUE: Une tolérance m/z raisonnable est ±1,5.
    3. Sélectionnez le nombre minimal d’ions de fragment qui doivent être mis en correspondance pour une identification en faisant défiler jusqu’au nombre souhaité dans la zone à droite de Combien d’ions de fragment doivent être appariés.
      REMARQUE: Trois correspondances devraient être adéquates.
    4. Sélectionnez les résidus de cystéine à oxyder en cliquant sur le cercle correspondant. Si aucune identification de protéine n’est trouvée après la recherche, répétez la recherche avec des cystéines dans leur état réduit. Si aucune identification n’est trouvée après la recherche, élargissez la tolérance aux ions fragments à ±3 et répétez la recherche.
  6. Sous Configuration du fichier, cliquez sur le bouton Sélectionner le fichier FASTA pour parcourir et sélectionner le fichier FASTA (texte) contenant les séquences de protéines in silico de la souche bactérienne précédemment construite dans les étapes de protocole 3.1 à 3.2. Sélectionnez ensuite un dossier de sortie et créez un nom de fichier de sortie.
  7. Cliquez sur le bouton Exécuter la recherche sur les entrées de fichier. Une fenêtre contextuelle apparaîtra intitulée Confirmer les paramètres de recherche (Figure 1,panneau inférieur), affichant les paramètres de recherche avant le lancement de la recherche.
  8. Si les paramètres de recherche sont corrects, cliquez sur le bouton Commencer la recherche. Si les paramètres de recherche ne sont pas corrects, cliquez sur le bouton Annuler et entrez à nouveau les paramètres corrects. Une fois la recherche lancée, la fenêtre des paramètres se ferme et une nouvelle fenêtre contextuelle avec une barre de progression apparaît(Figure 1,panneau inférieur) montrant la progression de la recherche et un décompte en cours du nombre d’identifications trouvées.
  9. Une fois la recherche terminée (quelques secondes), la barre de progression se ferme automatiquement et un résumé de la recherche s’affiche dans le champ Journal de l’interface graphique(Figure 2,panneau supérieur). De plus, une nouvelle fenêtre contextuelle apparaîtra également affichant la ou les identifications de protéines, le cas échéant(Figure 2,panneau inférieur).
    REMARQUE : Les séquences de protéines in silico contenant des résidus non reconnus, par exemple U ou X, sont automatiquement ignorées de l’analyse et ces séquences sont ensuite signalées avec une fenêtre contextuelle distincte pour alerter l’opérateur des séquences (le cas échéant) qui ont été ignorées à la fin de la recherche.

5. Confirmation post-recherche de la séquence protéique

  1. Confirmer l’exactitude d’une séquence candidate par une analyse manuelle.
    REMARQUE: Le but du logiciel Protein Biomarker Seeker est d’identifier une séquence protéique avec une grande précision en éliminant de nombreuses séquences protéiques manifestement incorrectes et en incorporant la troncature de séquence comme PTM possible dans la protéine mature. Comme le nombre de séquences candidates possibles renvoyées est peu nombreux, la confirmation manuelle est gérable.
  2. Générez un tableau de la moyenne m/z d’ions fragments de type b et y de la séquence candidate à l’aide de tout logiciel de spectrométrie de masse ou de protéomique ayant une telle fonctionnalité. Comparer la moyenne m/z d’ions fragments in silico du côté C-terminal des résidus D-, E et N(et du côté N-terminal des résidus P) au m/z des ions fragments proéminents des données MS/MS-PSD.
    REMARQUE: Les ions de fragment MS/MS-PSD les plus importants doivent être facilement associés aux ions de fragment in silico associés à D, E et N. Cependant, le mécanisme de fragmentation par effet acide aspartique est moins efficace près des N- ou C-termini d’une séquence protéique36.

Résultats

La figure 3 (panneau supérieur) montre le MS de la souche RM7788 de STEC O113:H21 cultivée pendant la nuit sur LBA supplémenté de 400 ng/mL de mitomycine-C. Les pics à m/z 7276, 7337 et 7841 avaient été identifiés précédemment comme étant la protéine C (CspC) du choc froid, la protéine E (CspE) et une protéine transmise par le plasmide de fonction inconnue, respectivement33. L’ion protéique à m/z 9780 [M+H]+ a été analysé par MS/MS-PSD ...

Discussion

Considérations relatives au protocole
Les principaux points forts du protocole actuel sont sa rapidité, la simplicité de préparation des échantillons et l’utilisation d’un instrument relativement facile à utiliser, à former et à entretenir. Bien que l’analyse protéomique ascendante et descendante par chromatographie liquide-ESI-HR-MS soit omniprésente et de loin supérieure à bien des égards à l’analyse descendante par MALDI-TOF-TOF, elle nécessite plus de temps, de travail et d?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le logiciel Protein Biomarker Seeker est disponible gratuitement (sans frais) en contactant Clifton K. Fagerquist à clifton.fagerquist@usda.gov. Nous tenons à reconnaître le soutien de cette recherche par ARS, USDA, bourse CRIS: 2030-42000-051-00-D.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4000 Series Explorer softwareAB SciexVersion 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA996-1
BSL-2 biohazard cabinetThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Data Explorer softwareAB SciexVersion 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersion 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ringFisher Scientific02-681-343
MiniSpin Plus CentrifugeEppendorf22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Sinapinic acidThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL loopsFisher Scientific22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)SigmaT0910-1MG
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537-100G
Water Optima LC/MS gradeFisher ChemicalW6-4

Références

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