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Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Resumo

Este protocolo identifica as proteínas de imunidade das enzimas bactericidas: colicina E3 e bacteriocina, produzidas por uma cepa patogênica de Escherichia coli usando indução de antibiótico, e identificada por espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. A proteína de imunidade da colicina E3 (Im3) e a proteína de imunidade da bacteriocina (Im-Bac) foram identificadas a partir de íons de fragmentos proeminentes do tipo b e/ou y gerados pelo decote da coluna vertebral (PBC) no lado terminal C do ácido aspartíaco, ácido glutamico e resíduos de asparagine pelo mecanismo de efeito de fragmento de ácido aspartílico. O software escaneia rapidamente em sequências proteicas sílicos derivadas de todo o sequenciamento do genoma da cepa bacteriana. O software também remove iterativamente resíduos de aminoácidos de uma sequência proteica no caso de a sequência proteica madura ser truncada. Uma única sequência proteica possuía massa e íons fragmentados consistentes com os detectados para cada proteína de imunidade. A sequência do candidato foi então inspecionada manualmente para confirmar que todos os íons de fragmento detectados poderiam ser atribuídos. A methionina n-terminal de Im3 foi removida pós-tradução, enquanto Im-Bac teve a sequência completa. Além disso, descobrimos que apenas dois ou três íons de fragmento não complementares formados pelo PBC são necessários para identificar a sequência proteica correta. Finalmente, um promotor (caixa SOS) foi identificado a montante dos genes antibacterianos e de imunidade em um genoma plasmídeo da cepa bacteriana.

Introdução

A análise e identificação de proteínas não digeridas por espectrometria de massa é referida como a análise proteômica de cima para baixo1,2,3,4. É agora uma técnica estabelecida que utiliza a ionização eletrospray (ESI)5 e analisadores de massa de alta resolução6, e técnicas sofisticadas de dissociação, por exemplo, dissociação de transferência de elétrons (ETD), dissociação de captura de elétrons (ECD)7,foto-dissociação ultravioleta (UV-PD)8, etc.

A outra técnica de ionização suave é a desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)9,10,11 que tem sido menos utilizada para a análise de cima para baixo, em parte porque está principalmente acoplada aos analisadores de massa tempo de voo (TOF), que têm resolução limitada em comparação com outros analisadores de massa. Apesar dessas limitações, os instrumentos MALDI-TOF e MALDI-TOF-TOF têm sido explorados para a rápida análise de cima para baixo de proteínas puras e misturas fracionadas e não fracionadas de proteínas. Para a identificação de proteínas puras, a decadência na fonte (ISD) é uma técnica particularmente útil porque permite a análise da espectrometria de massa (MS) de íons de fragmentos de ISD, bem como espectrometria de massa tandem (MS/MS) de fragmentos de íons proteicos que fornecem fragmentos específicos de sequência muitas vezes do N- e C-termini da proteína alvo, análogo ao sequenciamento de Edman12,13 . Uma desvantagem para a abordagem isd é que, como no sequenciamento de Edman, a amostra deve conter apenas uma proteína. A única exigência de proteína é devido à necessidade de atribuição inequívoca de íons fragmentários a um íon precursor. Se duas ou mais proteínas estiverem presentes em uma amostra, pode ser difícil atribuir quais íons fragmentários pertencem aos íons precursores.

A atribuição de íon/íon precursor pode ser tratada usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Como em qualquer experimento clássico de MS/MS, os íons precursores são selecionados em massa/isolados antes da fragmentação, e os íons de fragmento detectados podem ser atribuídos a um íon precursor específico. No entanto, as técnicas de dissociação disponíveis para esta abordagem estão restritas principalmente à dissociação induzida por colisão de alta energia (HE-CID)14 ou à decadência pós-fonte (PSD)15,16. HE-CID e PSD são mais eficazes na fragmentação de peptídeos e pequenas proteínas, e a cobertura de sequência pode, em alguns casos, ser limitada. Além disso, o PSD resulta em decote backbone polipeptídeo (PBC) principalmente no lado terminal C de resíduos de ácido aspônico e glutamico por um fenômeno chamado efeito ácido aspartílico17,18,19,20.

O MALDI-TOF-MS também encontrou uma aplicação de nicho na identificação taxonômica de microrganismos: bactérias21,fungos22e vírus23. Por exemplo, os espectros de MS são usados para identificar bactérias desconhecidas em comparação com uma biblioteca de referência de espectros de MS de bactérias conhecidas usando algoritmos de reconhecimento de padrões para comparação. Esta abordagem tem se mostrado altamente bem sucedida devido à sua velocidade e simplicidade, embora exija uma colheita noturna do isolado. Os íons proteicos detectados por esta abordagem (geralmente abaixo de 20 kDa) compreendem uma impressão digital em MS que permite a resolução taxonômica no nível do gênero e da espécie e, em alguns casos, na subespécie24 e no nível da cepa25,26. No entanto, ainda há a necessidade de classificar não apenas os microrganismos potencialmente patogênicos, mas também identificar fatores específicos de virulência, toxinas e fatores de resistência antimicrobiana (AMR). Para isso, a massa de peptídeos, proteínas ou pequenas moléculas são medidas por ESM e, posteriormente, isoladas e fragmentadas por MS/MS.

Bactérias patogênicas geralmente carregam pedaços circulares de DNA chamados plasmídeos. Plasmídeos, juntamente com prophagens, são um grande vetor de transferência de genes horizontais entre bactérias e são responsáveis pela rápida disseminação da resistência antimicrobiana e outros fatores de virulência entre as bactérias. Plasmídeos também podem transportar genes antibacterianos (AB), por exemplo, colicina e bacteriocina. Quando esses genes são expressos e as proteínas secretadas, eles agem para desativar a máquina de tradução de proteínas de bactérias vizinhas que ocupam o mesmo nicho ambiental27. No entanto, essas enzimas bactericida também podem representar um risco para o hospedeiro que as produziu. Em consequência, um gene é co-expresso pelo hospedeiro que inibe especificamente a função de uma enzima AB e é referido como sua proteína de imunidade (Im).

Antibióticos prejudiciais ao DNA, como mitomicina-C e ciprofloxacina, são frequentemente usados para induzir a resposta sos na E. coli (STEC) produtora de toxinas Shiga (STEC) cujo gene de toxina Shiga(stx) é encontrado dentro de um genoma de prophagem presente no genoma bacteriano28. Utilizamos indução de antibióticos, maldi-TOF-TOF-MS/MS e análise proteômica de cima para baixo anteriormente para detectar e identificar tipos e subtipos stx produzidos pelas cepas STEC29,30,31,32. No trabalho anterior, a cepa STEC O113:H21 RM7788 foi cultivada durante a noite na mídia ágar complementada com mitomicina-C. No entanto, em vez de detectar a subunidade B antecipada de Stx2a em m/z ~7816, um íon proteico diferente foi detectado em m/z ~7839 e identificado como uma proteína hipotética codificada por plasmídeos da função desconhecida33. No trabalho atual, identificamos duas proteínas AB-Im codificadas por plasmídeos produzidas por esta cepa usando indução de antibiótico, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, e análise proteômica de cima para baixo usando software autônomo desenvolvido para processar e digitalizar em sequências de proteína silico derivadas de sequenciamento de genoma inteiro (WGS). Além disso, a possibilidade de modificações pós-tradução (PTM) envolvendo truncação de sequência foram incorporadas ao software. As proteínas de imunidade foram identificadas utilizando-se este software a partir da massa medida do íon proteico maduro e íons de fragmentos específicos de sequência de PBC causados pelo efeito ácido aspartic e detectados por MS/MS-PSD. Finalmente, um promotor foi identificado a montante dos genes AB/Im em um genoma plasmídeo que pode explicar a expressão desses genes quando esta cepa é exposta a um antibiótico prejudicial ao DNA. Partes deste trabalho foram apresentadas na National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17 a 20 de agosto de 2020)34.

Protocolo

1. Preparação da amostra microbiológica

  1. Inocular 25 mL de caldo de Luria (LB) em um tubo cônico de 50 mL com estruoso O113:H21 cepa RM7788 (ou outra cepa bacteriana) de um estoque de glicerol usando um laço estéril de 1 μL. Tampe o tubo e a pré-cultura a 37 °C com agitação (200 rpm) por 4h.
  2. Aliquot 100 μL de caldo pré-cultivado e espalhe-se em uma placa de ágar LB suplementada com 400 ou 800 ng/mL de mitomicina-C. Placas de ágar de cultura estaticamente durante a noite em uma incubadora a 37 °C.
    ATENÇÃO: As cepas STEC são microrganismos patogênicos. Realize todas as manipulações microbiológicas, além de culminar, em um armário de biossegurança BSL-2.
  3. Colher células bacterianas de colônias visíveis únicas usando um laço estéril de 1 μL e transferir para um tubo de microcentrifus de tampa de parafuso forrado de 2,0 mL de o anel de parafuso contendo 300 μL de água de grau HPLC. Tampe o tubo, vórtice brevemente, e centrífuga a 11.337 x g por 2 min para pelotar as células.

2. Espectrometria de massa

  1. Ponto 0,75 μL aliquot da amostra sobrenatante sobre o alvo MALDI de aço inoxidável e permitir que ele seque. Sobreponha o ponto de amostra seca com alíquota de 0,75 μL de uma solução saturada de ácido sinapúrico em acetonitrilo de 33%, 67% de água e 0,2% ácido trifluoráctico. Deixe o local secar.
  2. Analise os pontos de amostra seca usando um espectrômetro de massa MALDI-TOF-TOF.
    1. Depois de carregar o alvo MALDI no espectrômetro de massa, clique no botão para aquisição do modo linear MS no software de aquisição. Digite a faixa m/z a ser analisada inserindo o m/z dos limites inferior e superior (por exemplo, 2 kDa a 20 kDa) em seus respectivos campos no software de método de aquisição.
    2. Clique no local de amostra para ser analisado no modelo de destino MALDI no software. Em seguida, pressione o botão esquerdo do mouse e arraste o cursor do mouse sobre o local da amostra para especificar a região retangular a ser amostrada para ablação/ionização a laser. Solte o botão do mouse e a aquisição será iniciada. Colete 1.000 tiros laser para cada ponto de amostra.
      NOTA: A aquisição de dados é exibida em tempo real na janela de aquisição de software.
    3. Se não forem detectados íons, aumente a intensidade do laser ajustando a Barra de Escala Deslizante sob intensidade laser no software até que o sinal de íon proteico seja detectado. Isso é referido como limiar.
      NOTA: Antes da análise da mancha amostral, calibrar externamente o instrumento no modo linear ms com calibrantes proteicos cujos m/z abrangem a faixa que está sendo analisada, por exemplo, os estados de carga +1 e +2 de calibrantes proteicos: citocromo-C, lysozyme e mioglobina cobrem uma faixa de massa de 2 kDa a 20 kDa. Uma massa intermediária dentro da faixa de massa especificada é usada como uma massa de foco, por exemplo, 9 kDa. A massa de foco é o íon cujo m/z é idealmente focado para detecção pelo detector de modo linear.
    4. Quando a aquisição do modo linear MS estiver concluída, clique no botão para aquisição do modo refletiron MS/MS no software de aquisição. Insira a massa precursora para ser analisada no campo de massa precursora. Em seguida, insira uma largura de isolamento (em Da) na Janela de Massa Precursora para o lado de massa baixa e alta da massa precursora, por exemplo, ±100 Da.
    5. Clique no botão CID Off. Clique no botão Supressor Metastable ON. Ajuste a intensidade do laser para pelo menos 90% de seu valor máximo ajustando a barra de escala deslizante sob a Intensidade laser no software.
    6. Clique no local de amostra para ser analisado no modelo de destino MALDI no software. Em seguida, pressione o botão esquerdo do mouse e arraste o cursor do mouse sobre o local da amostra para especificar a região retangular a ser amostrada para ablação/ionização a laser. Solte o botão do mouse e a aquisição será iniciada. Colete 10.000 tiros laser para cada ponto de amostra.
      NOTA: Antes da análise da mancha amostral, o instrumento deve ser calibrado externamente no modo MS/MS-reflectron utilizando os íons de fragmento da decadência pós-fonte (PSD) do estado de carga +1 da tiatoedoxina alquilada35.
  3. Não processe dados de MS brutos. Processo MS/MS-PSD dados brutos utilizando a seguinte sequência de etapas na ordem especificada: correção avançada da linha de base (32, 0.5, 0.0) seguido de remoção de ruído (dois desvios padrão) seguidos de suavização gaussiana (31 pontos).
  4. Inspecione manualmente os dados ms/MS-PSD para a presença de íons de fragmentos proeminentes gerados pelo PBC19,20.
  5. Avalie os dados de MS/MS em relação à abundância absoluta e relativa de íons fragmentado e seu sinal-para-ruído (S/N). Utilize apenas os íons de fragmento mais abundantes para identificação de proteínas, especialmente se os dados MS/MS-PSD forem barulhentos.

3. Na construção do banco de dados de proteína silico

  1. Gere um arquivo de texto contendo sequências de proteína silico da cepa bacteriana, que será escaneado pelo software Protein Biomarker Seeker para a identificação de proteínas. As sequências proteicas são derivadas do sequenciamento do genoma inteiro (WGS) da cepa que está sendo analisada (ou uma cepa intimamente relacionada).
  2. Acesse o site NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) para baixar aproximadamente 5.000 sequências proteicas da cepa bacteriana específica (por exemplo, Escherichia coli O113:H21 strain RM7788) sendo analisada. O tamanho máximo do download é de 200 sequências.
    1. Em consequência, copie e cole os 25 downloads em um único arquivo de texto. Selecione o formato FASTA (texto) para cada download.

4. Software de Busca de Biomarcadores de Proteína Operacional

  1. Clique duas vezes no arquivo executável Protein Biomarker Seeker. Uma janela de interface de usuário gráfica (GUI) aparecerá(Figura 1, painel superior).
  2. Digite a massa do biomarcador de proteínas (medida no modo MS-linear) no campo de massa de proteína madura. Em seguida, digite o erro de medição de massa no campo de tolerância em massa. O erro padrão de medição de massa é ±10 Da para uma proteína Da de 10.000.
  3. Opcionalmente, clique no botão Complementary b/y ion Protein Mass Calculator para calcular a massa proteica a partir de um par de íons de fragmento complementar putativo (CFIP ou b/y). Uma janela pop-up, Protein Mass Calculator Tool, aparecerá(Figura 1, painel inferior).
    1. Digite o m/z do CFIP putativo e clique no botão Adicionar par. A massa proteica calculada aparecerá.
    2. Copie e cole esse número no campo de massa de proteínas maduras e feche a janela da ferramenta de calculadora de massa de proteína.
  4. Selecione um comprimento de peptídeo de sinal n-terminal clicando na caixa de restrição de resíduo definido. Um pop-up com uma escala deslizante e cursor aparecerá. Mova o cursor para o comprimento do peptídeo de sinal desejado (máximo 50). Se nenhum comprimento de peptídeo de sinal for selecionado, uma truncação de sequência irrestrita será realizada pelo software.
  5. Sob a Condição de Íon fragmento na GUI, selecione resíduos para decote backbone de polipeptídeo (PBC). Clique nas caixas de um ou mais resíduos: D, E, N e/ou P.
    1. Clique no botão Enter Fragment Ions (+1) Para ser pesquisado. Uma página de fragmentos pop-up aparecerá. Em seguida, clique no botão Adicionar íon fragmento, que corresponde ao número de íons de fragmento a serem inseridos, ou seja, um clique para cada íon de fragmento. Um campo suspenso aparecerá para cada íon de fragmento a ser introduzido.
    2. Digite o m/z dos íons de fragmento e sua tolerância m/z associada. Quando for concluído, clique no botão Salvar e Fechar.
      NOTA: Uma tolerância razoável de m/z é ±1,5.
    3. Selecione o número mínimo de íons de fragmento que devem ser combinados para uma identificação, rolando para o número desejado na caixa à direita de Quantos íons de fragmento precisam ser correspondidos.
      NOTA: Três partidas devem ser adequadas.
    4. Selecione resíduos de cisteína para estar em seu estado oxidado clicando no círculo correspondente. Se não forem encontradas identificações proteicas após a busca, repita a busca com cisteínas em seu estado reduzido. Se não forem encontradas identificações após a busca, amplie a tolerância ao íon fragmento para ±3 e repita a busca.
  6. Na configuração de arquivo,clique no botão Selecionar ARQUIVO FASTA para navegar e selecione o arquivo FASTA (texto) contendo as sequências de proteína silico in da cepa bacteriana anteriormente construída nas etapas do protocolo 3.1 a 3.2. Em seguida, selecione uma pasta de saída e crie um nome de arquivo de saída.
  7. Clique no botão Executar pesquisar em entradas de arquivos. Uma janela pop-up aparecerá intitulada Confirmar parâmetros de pesquisa (Figura 1, painel inferior), exibindo os parâmetros de pesquisa antes que a pesquisa seja iniciada.
  8. Se os parâmetros de pesquisa estiverem corretos, clique no botão Iniciar pesquisa. Se os parâmetros de pesquisa não estiverem corretos, clique no botão Cancelar e reinsira os parâmetros corretos. Uma vez iniciada a pesquisa, a janela do parâmetro fecha, e uma nova janela pop-up com uma barra de progresso aparece(Figura 1, painel inferior) mostrando o progresso da pesquisa e uma contagem de execução do número de identificações encontradas.
  9. Após a conclusão da pesquisa (alguns segundos), a barra de progresso fecha automaticamente, e um resumo da pesquisa é exibido no campo Log da GUI (Figura 2, painel superior). Além disso, uma nova janela pop-up também aparecerá exibindo a identificação de proteínas se houver(Figura 2, painel inferior).
    NOTA: Em sequências de proteína silico que tenham resíduos não reconhecidos, por exemplo, U ou X, são automaticamente ignoradas da análise e essas sequências são posteriormente relatadas com uma janela pop-up separada para alertar o operador sobre quais (se houver) sequências foram ignoradas após a conclusão da pesquisa.

5. Confirmação pós-pesquisa da sequência proteica

  1. Confirme a correção de uma sequência de candidatos por análise manual.
    NOTA: O objetivo do software Protein Biomarker Seeker é identificar uma sequência de proteínas com alta precisão, eliminando muitas sequências proteicas obviamente incorretas da consideração e incorporando truncação sequencial como um possível PTM na proteína madura. Como o número de possíveis sequências de candidatos retornadas são poucos, a confirmação manual é gerenciável.
  2. Gere uma tabela de íons de fragmentos m/z médios do tipo b e y da sequência do candidato usando qualquer espectrometria de massa ou software proteômico com tal funcionalidade. Compare a média m/z de íons de fragmentos de sílico no lado terminal C de resíduos D-, E-, e N (e no lado N-terminal de resíduos P) com o m/z de íons de fragmento proeminentes dos dados MS/MS-PSD.
    NOTA: Os íons de fragmentos MS/MS-PSD mais proeminentes devem ser facilmente combinados com os íons de fragmentos de D-, E-e N associados em íons de fragmento silico. No entanto, o mecanismo de fragmentação do efeito ácido aspartílico é menos eficiente perto do N ou C-termini de uma sequência proteica36.

Resultados

A Figura 3 (painel superior) mostra o MS da cepa STEC O113:H21 RM7788 cultivada durante a noite na LBA suplementada com 400 ng/mL mitomicina-C. Picos em m/z 7276, 7337 e 7841 foram identificados anteriormente como proteína de choque frio C (CspC), proteína de choque frio E (CspE) e uma proteína transmitida por plasmídeos de função desconhecida,respectivamente 33. O íon proteico em m/z 9780 [M+H]+ foi analisado por MS/MS-PSD, conforme mostrado na

Discussão

Considerações protocolares
Os principais pontos fortes do protocolo atual são sua velocidade, simplicidade da preparação da amostra e uso de um instrumento relativamente fácil de operar, ser treinado e manter. Embora a análise proteômica de baixo para cima e de cima para baixo por cromatografia líquida-ESI-HR-MS seja onipresente e muito superior em muitos aspectos para de cima para baixo pelo MALDI-TOF-TOF, eles exigem mais tempo, trabalho e experiência. A complexidade do instrumento pode af...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

O software Protein Biomarker Seeker está livremente disponível (sem custo) entrando em contato com Clifton K. Fagerquist em clifton.fagerquist@usda.gov. Queremos reconhecer o apoio desta pesquisa por ARS, USDA, BOLSA CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4000 Series Explorer softwareAB SciexVersion 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA996-1
BSL-2 biohazard cabinetThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Data Explorer softwareAB SciexVersion 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersion 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ringFisher Scientific02-681-343
MiniSpin Plus CentrifugeEppendorf22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Sinapinic acidThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL loopsFisher Scientific22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)SigmaT0910-1MG
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537-100G
Water Optima LC/MS gradeFisher ChemicalW6-4

Referências

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