שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

Summary

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.

Abstract

טכניקות מיקרו-הנדסה עובריות חיוניות למחקרים מולקולריים וגנטיים רבים של מיני חרקים. הם מספקים אמצעי להכניס שברי DNA אקסוגניים קידוד גנים של עניין, כמו גם תכונות חיוביות לתוך נבט חרקים בצורה יציבה תורשתית. זנים מהונדסים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד עבור שינויים פנוטיפיים הנובעים הביטוי של ה- DNA המשולב כדי לענות על שאלות בסיסיות או בשימוש ביישומים מעשיים. למרות שהטכנולוגיה פשוטה, היא דורשת מהחוקר סבלנות ותרגול כדי להשיג רמה של מיומנות שממקסמת את היעילות. מוצג כאן שיטה למיקרו-ג'ק-קציה של עוברים של יתוש המלריה האפריקאי, אנופלס גמביה. המטרה היא לספק על ידי DNA אקסוגניים מיקרו-אינטג'ק לעובר, כך שניתן יהיה לקחת אותו בתאי הנבט המתפתחים (מוט). ביטוי מהדנ"א המוזרק של טרנספוזות, integrases, רקומבינות או גרעינים אחרים (לדוגמה חלבונים הקשורים CRISPR, Cas) יכול לעורר אירועים שמובילים להכנסה קוולנטית שלה לכרומוזומים. גמביה מהונדסת שנוצרה מטכנולוגיות אלה שימשה למחקרים בסיסיים של רכיבי מערכת החיסון, גנים המעורבים בהאכלת דם ואלמנטים של מערכת הריח. בנוסף, טכניקות אלה שימשו לייצור זני An. gambiae עם תכונות שעשויות לעזור לשלוט בהעברת טפילים מלריה.

Introduction

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה שימשו לתפעול ניסיוני של אורגניזמים מאז תחילת המאה^{ה-20 .} Microinjection שימש כדי ללמוד הן פונקציות ביולוגיות בסיסיות ו /או להציג שינויים חשובים בביולוגיה של אורגניזם הרצוי. טכניקת המיקרו-שיתוף הייתה מעניינת במיוחד ביולוגים וקטורים, והיא נמצאת בשימוש נרחב לתפעול גנומים וקטוריים^2-11. ניסויי Transgenesis בווקטורים פרוקי רגליים לעתים קרובות שואפים להפוך וקטורים פחות יעילים בהעברת פתוגנים על ידי חקיקת שינויים שמקטינים את הכושר של וקטור או מגבירים את השחלה לפתוגנים שהם משדרים. יתושים מעבירים מגוון פתוגנים אנושיים ויש להם השפעה משמעותית על התחלואה והתמותה ברחבי העולם. סוג אנופלס של יתושים מעביר את הפתוגנים טפילים מלריה האנושית, פלסמודיום spp. ניסויים בהנדסה גנטית עם אנופלים נועדו להבין טוב יותר את הביולוגיה ולהפחית את היכולת הווקטורית של יתושים אלה במאמצים לפתח אסטרטגיות לחיסול מלריה חדשניות.

וקטורים יתושים התורמים ביותר זיהומים מלריה ברחבי העולם הם במתחם מינים אנופלס גמביה. עם זאת, רוב הניסויים הטרנסגנזה המוצלחים בוצעו על וקטור המלריה של תת היבשת ההודית, אנופלס סטיבנסי. בעוד שפע של זני אנופלס גמביה מותאמי מעבדה קיימים, מספר הקווים המהותניים של אנופלס גמביה spp. שדווחו בספרות אינו משתווה לזה של אנופלס סטיבנסי. הוא חשב כי אנופלס גמביה עובר קשה יותר להזריק ולהשיג טרנסגנזה מוצלחת מאשר אנופלס stephensi, אם כי הסיבות להבדלים אלה אינם ידועים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוכח כי היא מצליחה בעקביות בהשגת טרנסגנזה של עוברים אנופלס גמביה באמצעות מיקרו-ינון. הפרוטוקול מבוסס על שיטה שפותחה בעבר על ידי הרה בוסין ומארק בנדיקט¹² עם כמה פרטים נוספים ושינויים שנוספו שנמצאו כמגבירים את היעילות של transgenesis.

Protocol

1. הכנת יתושים למיקרו-ינון

1. זרע כלוב¹³ (~ 5000 ס"מ³) עם ~ 100 זכר ו 200-300 נקבה 1-2 יום מבוגר יתושים לאחר אקסלציה ולאפשר להם להזדווג במשך 2 ימים.
2. לאחר תקופת ההזדווגות, לספק יתושים ארוחת דם באמצעות 2 מ"ל של דם עם מכשיר האכלה מלאכותי או בעלי חיים חיים מרדים בהתאם לשיטות חרקים¹⁴. למחרת לספק יתושים ארוחת דם שנייה כדי להבטיח כי כל הנקבות המזדויפות היו הזדמנות להאכיל וכי יתושים האכלה חלקית הפכו שקועים לחלוטין.
3. השתמש יתושים עבור אוספי עוברים 2-4 ימים לאחר ארוחת הדם השנייה.
   הערה: תזונה זחלית חשובה לחוסן למבוגרים וכושר הרבייה. ראה בנדיקט ואח ' (2020) לקבלת מידע על איך לגדל חרקים בריאים¹⁴. לא נצפו הבדלים משמעותיים בהטלת ביצים כאשר יתושים ניזונים ממאכיל מלאכותי או מאכילים חיים של חיות מרדים. השתמש בשיטה שבה נעשה שימוש שגרתי עבור אנופלס גמביה בחרקים.

2. הכנת עוברים

1. השתמש בשאיפה למקם 20-30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מ"ל שנחתך (עם מסור להקה) כדי להיות פתוח בשני קצות ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני(איור 1).
   הערה: היתושים יפקידו את ביציהם על נייר המסנן ורשת הניילון תשמור על נייר המסנן במקומו. ביצי יתושים הן גליליות בצורתן, באורך של כ-500 מיקרומטר, בקוטר של כ-200 מיקרומטר בנקודה הרחבה ביותר שלהן, ומתחדדות בקצוות הקדמיים והאחוריים(איור 2).
2. מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) מלאה במים מזוקקים כפולים (ddH₂O). מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 °C (איור3).
3. הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה ולהסיר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.
4. כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הסינון בצלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה שכבה של נייר סינון לח עם ddH₂O.
5. שים לב לביצים. ביצים שהזדקנו עד לנקודה שבה הן בצבע אפור בהיר(איור 4)מוכנות ליישור.
   1. אם הביצים עדיין לבנות, החזירו אותן לאינקובטור ובדקו את הצבע כל 5 דקות. ביצים לבנות שבירות, נקרעות בקלות, ואינן שורדות היטב לאחר תהליך ההזרקה וכתוצאה מכך בקיעה נמוכה.
   2. ביצים אפורות או שחורות כהות הזדקנו יותר מדי. אל תשתמש בהם.

3. יישור עובר

1. חותכים חתיכת קרום ניילון (2 ס"מ על 1 ס"מ) עם סכין גילוח, מוודאים שהקצה נחתך בצורה מסודרת.
   הערה: אם הקצה אינו ישר, הביצים לא יישארו מודבקות על הממברנה כראוי במהלך תהליך ההזרקה.
2. שים קרום על שקופית זכוכית לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן (2 ס"מ x 2 ס"מ), משאיר ~ 1 מ"מ של מסנן הממברנה חשוף (איור 5).
   הערה: ודאו כי שקופיות מיקרוסקופ נקיות לפני השימוש והשתמשו במלקחיים נקיים כדי לתפעל את מסנן הממברנה.
3. הרטיבו את נייר המסנן עם H₂O דה-או דה-יונים, שכן הביצים ימותו אם יתייבשו לפרקי זמן ממושכים.
   הערה: אל תשימו יותר מדי מים על הנייר מכיוון שהעוברים יזוזו במהלך תהליך ההזרקה, אך ודאו שיש מספיק כדי למנוע מהעובר להתייבש (איור 6A, B). מים עודפים ניתן להסיר על ידי ספיגת אותו עם פיסת נייר מסנן.
4. מעבירים בעדינות 30-50 עוברים לקצה הממברנה בעזרת מברשת צבע (מידה מס' 0). השתמש במברשת כדי ליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה על ידי גלגול עדין עליהם על השקופית, כך שהצד הגחוני (קמור) פונה כלפי מעלה.
5. כוון את כל הביצים באותו כיוון כך שכאשר הביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי (מחודד יותר, איור 6A, B) נמצא במצב למטה ויוצר זווית של ~ 15° עם המחט ( איור6C). מרפדים את כל הקצה של הממברנה בביצים (30-50) ומניחים את השקופית מתחת למיקרוסקופ להזרקה.
   הערה: בחר את הביצים בקפידה. השליכו את הלבנים (צעירים מדי או לא מפותחים) או אפור כהה (זקנים מדי וישברו את המחט), ואת האבנורמלים(איור 7). ודא שנייר הסינון נשאר לח בכל עת.

4. הכנת DNA

1. טהרו DNAs פלסמיד להזרקה, לכל הפחות, עם ערכת MAXIprep DNA נטולת אנדוטוקסין בעקבות פרוטוקולי היצרן.
2. resuspend ה- DNA במים באיכות PCR וצנטריפוגה ב 17,100 x גרם בצנטריפוגה בקירור במשך 30 דקות ב 4 °C (7 °F). לאחר מכן, להעביר את supernatant חדש, נקי 1.5 mL צינור חרוט. בזהירות מיקרו-pipette כדי למנוע העברת חומר חלקיקי לא רצוי מהעמודה.
3. בצע משקעים שניים של DNA באמצעות נפח עשירית של 3M נתרן אצטט ונפח כפול של 100% אתנול.
4. Resuspend ה- DNA ב 300-500 μL של מים כיתה PCR לריכוז פלסמיד סופי של 1000 ng / μL. לערבב את קוקטייל plasmid במאגר ההזרקה לריכוז פלסמיד סופי של 300-400 ng / μL ולעשות 10-20 עליקות μL.
   הערה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 °C. aliquots מיקרו-ערך DNA ניתן לאחסן ב -20 °C (50 °F), או ב -80 °C (80 °F) אם משתמשים ברכיבי RNA. אין לחרוג מ- 800 ננוגרם/ μL של DNA בתערובת ההזרקה מכיוון שצמיגות תגרום למחטים לסתום.

5. הכנת מחט

1. הפוך את המחטים על ידי משיכת נימי קוורץ 10 ס"מ באמצעות משיכת מיקרופיט לתכנות.
2. בדוק את המחט מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הקצה נוצר היטב. ודאו שהגדרת המחט במשיכה הניתנת לתכנות מניבה קצה שמתחיל להתחדד ~ 0.5 מ"מ מקצה המסוף ומסתיים בנקודה עדינה (ראו איור 6). מחטים שנשברות בקלות בדרך כלל יש יותר מדי זמן של מתחדד.
   הערה: התנאים עשויים להשתנות בהתאם למשיכת המחט (המחברים יהיו זמינים על פי בקשה את ההגדרות עבור מושך לתכנות הם משתמשים. הגבלות יומן מונעות מאיתנו לצטט מותג מסוים). מחטים ניתן למשוך ביד, אבל זה דורש מיומנות להגדיר לא זמין ברוב המעבדות.

6. מיקרו-נסיגה עוברית

1. השתמש קצה מיקרו-מטעין כדי למלא את המחטים עם 2 μL של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטיים(איור 8).
2. חשוב: יישר את המחט כך שהיא תגיע לזווית של 15° עם מישור השקופית (איור 8).
3. פתח את קצה המחט על ידי נגיעה בזהירות בביצה הראשונה והזריק אותה על ידי החדרת קצה המחט ≤ 10 מיקרומטר בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה.
4. השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.
   1. כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט.
   2. אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.
   3. להזריק ~ 40-50 ביצים עם מחט אחת.
      הערה: ודאו שנייר הסינון נשאר לח בכל עת. שמור מספיק לחץ גב על המחט כדי לשמור אותו פינה. מחט שלא ניתן לפתוח חייבת להיות מוחלפת במחט חדשה. מיקום העובר, החדרת המחט והזרקה נעשים קלים יותר עם מיקרוסקופים בעלי פקדים קואקסיאליים לתנועה אופקית של השלב (איור 9).
5. לאחר השלמת הזריקות, יש לשטוף את הביצים במיכל זכוכית מרופד בנייר פילטר ומלא ב-50 מ"ל של H₂O(איור 10).
   הערה: עוברים יתחילו לבקוע יומיים לאחר ההזרקה ועשויים להימשך עד 3-5 ימים. יש להעביר זחלי instar הראשונים בקעה מיד (בדוק 2 פעמים ביום) למיכל נקי עם מים ומזון.

תוצאות

דוגמה מייצגת ליישום פרוטוקול המיקרו-בייג'ן המתואר ניתן למצוא ב Carballar-Lejarazú et al⁵. הכוונה כאן הייתה להכניס מערכת הנעת גנים אוטונומית לתוך הנבט של זן מעבדה, G3, של An. gambiae. המערכת תוכננה למקד את הלוקוס האורתולוגי הקרדינל (Agcd)על הכרומוזום השלישי במין זה, המקודד heme peroxidase ה...

Discussion

עם הזמינות המוגברת של טכנולוגיות הנדסה גנטית מדויקות וגמישות כגון CRISPR/Cas9, ניתן לפתח אורגניזמים מהונדסים בצורה פשוטה ויציבה יותר ממה שאפשר בעבר. כלים אלה אפשרו לחוקרים ליצור זנים מהונדסים של וקטורים יתושים שקרובים מאוד להשגת התכונות הרצויות של השחלה לפתוגנים (שינוי אוכלוסין) או סטריליות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)	Mili-Q		In a wash bottle
Dissecting microscope	Leica	Leica MZ12	For embryo alignment
Forceps			No. 5 size
Glass container	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Glass slide	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Model No. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex dental film	Crosstex International	No. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	Rainin		20 µL
Micropipette puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope	Leica	DM 1000 LED or M165 FC	For microinjection
Minimum fiber filter paper	Fisher Brand	No. 05-714-4	Chromatography Paper, Thick
Mosquitoes	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush	Blick	No. 05831-7040	Fine, size 4/0
Petri dish			Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodium acetate			3M
Quartz glass capillaries	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade	Roche	No. 03315843001