Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Résumé

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Résumé

Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.

Introduction

Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 1900^1. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels^2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre les agents pathogènes en adoptant des changements qui diminuent la capacité physique d’un vecteur ou augmentent la réfractaireté des agents pathogènes qu’ils transmettent. Les moustiques transmettent une variété d’agents pathogènes humains et ont un impact significatif sur la morbidité et la mortalité dans le monde entier. Le genre de moustiques Anopheles transmet les agents pathogènes parasites du paludisme humain, Plasmodium spp. Les expériences de génie génétique avec les anophèles ont visé à mieux comprendre la biologie et à réduire la capacité vectorielle de ces moustiques dans le but de développer de nouvelles stratégies d’élimination du paludisme.

Les moustiques vecteurs qui contribuent le plus au nombre d’infections palustres dans le monde se trouvent dans le complexe d’espèces Anopheles gambiae. Cependant, la majorité des expériences de transgénèse réussies ont été réalisées sur le vecteur du paludisme du sous-continent indien, Anopheles stephensi. Bien qu’il existe de nombreuses souches d’Anopheles gambiae adaptées en laboratoire, le nombre de lignées transgéniques d’Anopheles gambiae spp. rapportées dans la littérature ne se compare pas à celui d’Anopheles stephensi. On pense que l’embryon d’Anophèle gambie est plus difficile à injecter et à réussir la transgénèse que Anopheles stephensi,bien que les raisons de ces différences soient inconnues. Ce protocole décrit une méthode qui s’est avérée toujours efficace pour réaliser la transgénèse des embryons d’Anophèles gambiae par micro-injection. Le protocole est basé sur une méthode précédemment développée par Hervé Bossin et Mark Benedict¹² avec quelques détails et modifications supplémentaires qui ont été trouvés pour augmenter l’efficacité de la transgénèse.

Protocole

1. Préparation des moustiques à la micro-injection

1. Ensemencez une cage¹³ (~5000 cm³⁾avec ~100 moustiques mâles et 200-300 femelles adultes de 1-2 jours après l’éclosion et laissez-les s’accoupler pendant 2 jours.
2. Après la période d’accouplement, fournir aux moustiques un repas de sang en utilisant soit 2 mL de sang avec un dispositif d’alimentation artificielle, soit des animaux anesthésiés vivants selon les pratiques insectaires¹⁴. Le lendemain, fournissez aux moustiques un deuxième repas de sang pour s’assurer que toutes les femelles accouplées ont eu l’occasion de se nourrir et que les moustiques partiellement nourris sont devenus complètement engorgés.
3. Utilisez les moustiques pour les collectes d’embryons 2 à 4 jours après le deuxième repas de sang.
   REMARQUE: La nutrition larvaire est importante pour la robustesse et la capacité de reproduction de l’adulte. Voir Benedict et al. (2020) pour plus d’informations sur la façon d’élever des insectes en bonne santé¹⁴. Aucune différence significative dans la ponte n’a été observée lorsque les moustiques sont nourris sur une mangeoire artificielle ou des animaux anesthésiés vivants. Utilisez la méthode couramment utilisée pour Anopheles gambiae dans l’insectaire.

2. Préparation de l’embryon

1. Utilisez un aspirateur pour placer 20 à 30 femelles dans un tube conique transparent de 50 mL qui a été coupé (avec une scie à ruban) pour être ouvert aux deux extrémités et recouvert d’un film dentaire en latex à une extrémité et d’un maillage en nylon et de papier filtre à l’autre(Figure 1).
   REMARQUE: Les moustiques déposeront leurs œufs sur le papier filtre et le maillage en nylon maintiendra le papier filtre en place en toute sécurité. Les œufs de moustiques ont une forme cylindrique, une longueur d’environ 500 μm, un diamètre d’environ 200 μm à leur point le plus large et s’effilent aux extrémités antérieure et postérieure(figure 2).
2. Placez le tube rempli de moustiques dans une petite boîte de Petri (60 mm x 15 mm) remplie d’eau double distillée (ddH₂O). Placer le tube et la parabole dans un incubateur à 28 °C pendant 45 min(Figure 3).
3. Retirez le tube de l’incubateur et insérez-le dans une cage vide. Tapotez doucement le tube pour permettre aux moustiques de s’envoler et retirez le tube de la cage une fois que tous les moustiques se sont envolés.
4. Lorsque le tube est exempt de moustiques, dévissez l’anneau inférieur, retirez le nylon et utilisez une pince pour retirer soigneusement le papier filtre avec les œufs du tube. Placez le papier filtre dans une boîte de Petri en plastique (100 mm x 15 mm) contenant une couche de papier filtre humidifiée avec du ddH₂O.
5. Observez les œufs. Les œufs qui ont vieilli au point d’être de couleur gris clair(Figure 4)sont prêts pour l’alignement.
   1. Si les œufs sont encore blancs, retournez-les à l’incubateur et vérifiez la couleur toutes les 5 minutes. Les œufs blancs sont fragiles, se rompent facilement et ne survivent pas bien après le processus d’injection, ce qui entraîne une faible éclosion.
   2. Les œufs gris foncé ou noirs ont trop vieilli. Ne les utilisez pas.

3. Alignement des embryons

1. Coupez un morceau de membrane de buvard en nylon (2 cm x 1 cm) avec une lame de rasoir, en vous assurant que le bord est bien coupé.
   REMARQUE: Si le bord n’est pas droit, les œufs ne resteront pas correctement fixés à la membrane pendant le processus d’injection.
2. Placez une membrane sur une lame de verre et recouvrez la membrane d’un morceau de papier filtre (2 cm x 2 cm), en laissant environ 1 mm du filtre à membrane découvert (Figure 5).
   REMARQUE: Assurez-vous que les lames de microscope sont propres avant utilisation et utilisez des pinces propres pour manipuler le filtre à membrane.
3. Mouillez le papier filtre avec du H₂O désionisé, car les œufs mourront s’ils sont desséchés pendant de longues périodes.
   REMARQUE: Ne mettez pas trop d’eau sur le papier car les embryons se déplaceront pendant le processus d’injection, mais assurez-vous qu’il y en a assez pour empêcher l’embryon de sécher (Figure 6A, B). L’excès d’eau peut être éliminé en l’absorbant avec un morceau de papierfiltre.
4. Transférez doucement 30 à 50 embryons sur le bord de la membrane avec un pinceau (taille #0). Utilisez la brosse pour aligner les œufs verticalement le long de la membrane en les roulant doucement sur la glissière afin que la face ventrale (convexe) soit tournée vers le haut.
5. Orienter tous les œufs dans la même direction de sorte que lorsque les œufs sont observés au microscope à micro-injection, l’extrémité postérieure (plus pointue, Figure 6A, B) est en position basse et forme un angle d’environ 15° avec l’aiguille ( Figure6C). Tapisser tout le bord de la membrane avec des œufs (30-50) et placer la lame sous le microscope pour injection.
   REMARQUE: Choisissez les œufs avec soin. Jetez ceux qui sont blancs (trop jeunes ou peu développés) ou gris foncé (trop vieux et qui casseront l’aiguille), et les anormaux(Figure 7). Assurez-vous que le papier filtre reste humide en touttemps.

4. Préparation de l’ADN

1. Purifier les ADN plasmidiques pour injection, au minimum, avec un kit maxiprep de plasmide plasmidique sans endotoxine en suivant les protocoles du fabricant.
2. Remettre l’ADN dans de l’eau de qualité PCR et centrifuger à 17 100 x g dans une centrifugeuse réfrigérée pendant 30 min à 4 °C. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube conique propre de 1,5 mL. Micro-pipette soigneusement pour éviter de transférer des particules indésirables de la colonne.
3. Effectuer une deuxième précipitation d’ADN en utilisant un dixième de volume d’acétate de sodium 3M et un volume deux fois plus important d’éthanol à 100%.
4. Remettre l’ADN en suspension dans 300-500 μL d’eau de qualité PCR pour une concentration finale en plasmides de 1000 ng/μL. Mélanger le cocktail de plasmides dans le tampon d’injection pour obtenir une concentration finale de plasmide de 300-400 ng/μL et faire des aliquotes de 10-20 μL.
   REMARQUE: L’ADN peut être stocké à -20 ° C. Les aliquotes de microinjection d’ADN peuvent être stockées à -20 ° C ou à -80 ° C si vous utilisez des composants d’ARN. Ne pas dépasser 800 ng/μL d’ADN dans le mélange d’injection, car la viscosité entraînera le colmatage des aiguilles.

5. Préparation de l’aiguille

1. Fabriquez les aiguilles en tirant des capillaires de quartz de 10 cm à l’aide d’un extracteur de micropipette programmable.
2. Examinez l’aiguille au microscope pour vous assurer que la pointe est bien formée. Assurez-vous que le réglage de l’aiguille sur l’extracteur programmable donne une pointe qui commence à se rétrécir à environ 0,5 mm de l’extrémité terminale et se termine en un point fin (voir Figure 6). Les aiguilles qui se cassent facilement ont généralement une conicité trop longue.
   REMARQUE: Les conditions peuvent différer en fonction de l’extracteur d’aiguilles (les auteurs mettront à disposition sur demande les paramètres de l’extracteur programmable qu’ils utilisent. Les restrictions de journal nous empêchent de citer une marque spécifique). Les aiguilles peuvent être tirées à la main, mais cela nécessite un ensemble de compétences qui ne sont pas disponibles dans la plupart des laboratoires.

6. Microinjection d’embryons

1. Utilisez une pointe de micro-chargeur pour remplir les aiguilles avec 2 μL de mélange d’ADN. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez le tube de pompe à pression automatisé (Figure 8).
2. Important : Alignez l’aiguille de manière à ce qu’elle fasse un angle de 15° avec le plan de la diapositive (Figure 8).
3. Ouvrez la pointe de l’aiguille en touchant soigneusement le premier œuf et injectez-la en insérant la pointe de l’aiguille ≤ 10 μm dans le pôle postérieur. Une injection réussie entraînera un petit mouvement du cytoplasme dans l’œuf.
4. Utilisez les commandes de l’étape coaxiale du microscope pour passer à l’œuf suivant afin de poursuivre l’injection.
   1. Pour vous assurer que la pointe de l’aiguille reste ouverte et ne s’est pas bouchée, appuyez sur le bouton Injecter avant d’entrer dans un autre embryon et visualisez la petite gouttelette à l’ouverture de l’aiguille.
   2. Si l’aiguille est bouchée, appuyez sur le bouton Effacer pour effacer l’aiguille et répétez le test de visualisation des gouttelettes. Ajustez la pression au besoin si l’ouverture de la pointe de l’aiguille devient légèrement plus grande pour vous assurer que la taille de la gouttelette reste petite.
   3. Injecter environ 40 à 50 œufs avec une aiguille.
      REMARQUE: Assurez-vous que le papier filtre reste humide en tout temps. Maintenez une contre-pression suffisante sur l’aiguille pour la garder dégagée. Une aiguille qui ne peut pas être débouchée doit être remplacée par une nouvelle aiguille. Le placement de l’embryon, l’insertion de l’aiguille et l’injection sont facilités par des microscopes dotés de contrôles coaxiaux pour le mouvement horizontal de la scène (Figure 9).
5. Une fois les injections terminées, rincer les œufs dans un récipient en verre tapissé de papier filtre et rempli de 50 mL de H_2Odésionisé(figure 10).
   REMARQUE: Les embryons commenceront à éclore 2 jours après l’injection et peuvent prendre jusqu’à 3-5 jours. Les larves du premier stade éclos doivent être transférées immédiatement (vérifier 2 fois par jour) dans un récipient propre avec de l’eau et de la nourriture.

Résultats

Un exemple représentatif de l’application du protocole de microinjection décrit peut être trouvé dans Carballar-Lejarazú et al⁵. L’intention ici était d’insérer un système de forçage génétique autonome dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire, G3, d’An. gambiae. Le système a été conçu pour cibler le locus orthologue cardinal (Agcd)sur le troisième chromosome de cette espèce, qui code une peroxydase hémique qui catalyse la conversi...

Discussion

Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la populati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)	Mili-Q		In a wash bottle
Dissecting microscope	Leica	Leica MZ12	For embryo alignment
Forceps			No. 5 size
Glass container	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Glass slide	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Model No. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex dental film	Crosstex International	No. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	Rainin		20 µL
Micropipette puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope	Leica	DM 1000 LED or M165 FC	For microinjection
Minimum fiber filter paper	Fisher Brand	No. 05-714-4	Chromatography Paper, Thick
Mosquitoes	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush	Blick	No. 05831-7040	Fine, size 4/0
Petri dish			Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodium acetate			3M
Quartz glass capillaries	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade	Roche	No. 03315843001