Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Résumé

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Résumé

Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.

Introduction

Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 1900^1. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels^2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre le....

Protocole

1. Préparation des moustiques à la micro-injection

1. Ensemencez une cage¹³ (~5000 cm³⁾avec ~100 moustiques mâles et 200-300 femelles adultes de 1-2 jours après l’éclosion et laissez-les s’accoupler pendant 2 jours.
2. Après la période d’accouplement, fournir aux moustiques un repas de sang en utilisant soit 2 mL de sang avec un dispositif d’alimentation artificielle, soit des animaux anesthésiés vivants selon les pratiques insectaires¹⁴. Le lendemain, fournissez aux moustiques un deuxième repas de sang pour s’assurer que toutes les femelles accouplées ont eu l’occasion de se nourrir et que les m....

Résultats

Un exemple représentatif de l’application du protocole de microinjection décrit peut être trouvé dans Carballar-Lejarazú et al⁵. L’intention ici était d’insérer un système de forçage génétique autonome dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire, G3, d’An. gambiae. Le système a été conçu pour cibler le locus orthologue cardinal (Agcd)sur le troisième chromosome de cette espèce, qui code une peroxydase hémique qui catalyse la conversi.......

Discussion

Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la populati.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)	Mili-Q		In a wash bottle
Dissecting microscope	Leica	Leica MZ12	For embryo alignment
Forceps			No. 5 size
Glass container	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Glass slide	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Model No. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex dental film	Crosstex International	No. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	Rainin		20 µL
Micropipette puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope	Leica	DM 1000 LED or M165 FC	For microinjection
Minimum fiber filter paper	Fisher Brand	No. 05-714-4	Chromatography Paper, Thick
Mosquitoes	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush	Blick	No. 05831-7040	Fine, size 4/0
Petri dish			Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodium acetate			3M
Quartz glass capillaries	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade	Roche	No. 03315843001