Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

Riepilogo

Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.

Abstract

Le tecniche di microiniezione degli embrioni sono essenziali per molti studi molecolari e genetici sulle specie di insetti. Forniscono un mezzo per introdurre frammenti di DNA esogeni che codificano geni di interesse e tratti favorevoli nella linea germinale degli insetti in modo stabile ed ereditabile. I ceppi transgenici risultanti possono essere studiati per i cambiamenti fenotipici derivanti dall'espressione del DNA integrato per rispondere a domande di base o utilizzati in applicazioni pratiche. Sebbene la tecnologia sia semplice, richiede all'investigatore pazienza e pratica per raggiungere un livello di abilità che massimizzi l'efficienza. Mostrato qui è un metodo per la microiniezione di embrioni della zanzara africana della malaria, Anopheles gambiae. L'obiettivo è quello di fornire per microiniezione DNA esogeno all'embrione in modo che possa essere assorbito nelle cellule germinali (polo) in via di sviluppo. L'espressione dal DNA iniettato di trasposasi, integrasi, ricombinasi o altre nucleasi (ad esempio proteine associate a CRISPR, Cas) può innescare eventi che portano al suo inserimento covalente nei cromosomi. Transgenic An. gambiae generato da queste tecnologie sono stati utilizzati per studi di base di componenti del sistema immunitario, geni coinvolti nell'alimentazione del sangue ed elementi del sistema olfattivo. Inoltre, queste tecniche sono state utilizzate per produrre ceppi di An. gambiae con tratti che possono aiutare a controllare la trasmissione dei parassiti della malaria.

Introduzione

Le tecniche di microiniezione sono state utilizzate per manipolare sperimentalmente gli organismi fin dai primi anni del 1900¹. La microiniezione è stata utilizzata per studiare sia le funzioni biologiche di base che per introdurre importanti cambiamenti nella biologia di un organismo desiderato. La tecnica di microiniezione è stata di particolare interesse per i biologi vettori ed è stata ampiamente utilizzata per manipolare i genomi vettoriali^2-11. Gli esperimenti di transgenesi nei vettori di artropodi spesso mirano a rendere i vettori meno efficienti nella trasmissione di agenti patogeni attuando cambiamenti che diminuiscono l'idoneità di un vettore o aumentano la refrattarietà ai patogeni che trasmettono. Le zanzare trasmettono una varietà di agenti patogeni umani e hanno un impatto significativo sulla morbilità e sulla mortalità in tutto il mondo. Il genere Anopheles di zanzare trasmette i patogeni parassiti della malaria umana, Plasmodium spp. Gli esperimenti di ingegneria genetica con Anopheles hanno mirato a comprendere meglio la biologia e ridurre la capacità vettoriale di queste zanzare negli sforzi per sviluppare nuove strategie di eliminazione della malaria.

I vettori di zanzare che contribuiscono alla maggior parte delle infezioni da malaria in tutto il mondo si trovano nel complesso delle specie Anopheles gambiae. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti di transgenesi di successo sono stati eseguiti sul vettore della malaria del subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Mentre esistono molti ceppi di Anopheles gambiae adattati in laboratorio, il numero di linee transgeniche di Anopheles gambiae spp. riportate in letteratura non è paragonabile a quello di Anopheles stephensi. Si pensa che l'embrione di Anopheles gambiae sia più difficile da iniettare e ottenere una transgenesi di successo rispetto ad Anopheles stephensi, sebbene le ragioni di queste differenze siano sconosciute. Questo protocollo descrive un metodo che ha dimostrato di avere costantemente successo nel raggiungere la transgenesi degli embrioni di Anopheles gambiae tramite microiniezione. Il protocollo si basa su un metodo precedentemente sviluppato da Hervé Bossin e Mark Benedict¹² con alcuni dettagli aggiuntivi e modifiche aggiunte che sono state trovate per aumentare l'efficienza della transgenesi.

Protocollo

1. Preparare le zanzare per la microiniezione

1. Semina una gabbia¹³ (~ 5000 cm³) con ~ 100 maschi e 200-300 femmine 1-2 giorni zanzare adulte post-eclosion e lascia loro accoppiare per 2 giorni.
2. Dopo il periodo dell'accoppiamento, fornire alle zanzare un pasto di sangue utilizzando 2 ml di sangue con un dispositivo di alimentazione artificiale o animali vivi anestetizzati a seconda delle pratiche insetticide¹⁴. Il giorno seguente fornisci alle zanzare un secondo pasto di sangue per garantire che tutte le femmine accoppiate abbiano avuto l'opportunità di nutrirsi e che le zanzare parzialmente nutrite siano diventate completamente ingorgate.
3. Utilizzare le zanzare per la raccolta di embrioni 2-4 giorni dopo il secondo pasto di sangue.
   NOTA: La nutrizione larvale è importante per la robustezza degli adulti e l'idoneità riproduttiva. Vedi Benedict et al. (2020) per informazioni su come allevare insetti sani¹⁴. Non sono state osservate differenze significative nella deposizione delle uova quando le zanzare vengono alimentate con un alimentatore artificiale o animali vivi anestetizzati. Utilizzare qualsiasi metodo venga utilizzato abitualmente per Anopheles gambiae nell'insetto.

2. Preparazione degli embrioni

1. Utilizzare un aspiratore per posizionare 20-30 femmine in un tubo conico trasparente da 50 ml che è stato tagliato (con una sega a nastro) per essere aperto ad entrambe le estremità ed è coperto con pellicola dentale in lattice a un'estremità e rete di nylon e carta da filtro all'altra (Figura 1).
   NOTA: Le zanzare depositeranno le loro uova sulla carta da filtro e la rete di nylon manterrà la carta da filtro saldamente in posizione. Le uova di zanzara sono di forma cilindrica, ~ 500 μm di lunghezza, ~ 200 μm di diametro nel loro punto più largo e affusolate alle estremità anteriore e posteriore (Figura 2).
2. Posizionare il tubo pieno di zanzare in una piccola capsula di Petri (60 mm x 15 mm) riempita con acqua a doppio distillato (ddH₂O). Posizionare il tubo e il piatto in un'incubatrice a 28 °C per 45 minuti (Figura 3).
3. Rimuovere il tubo dall'incubatore e inserire il tubo in una gabbia vuota. Picchiettare delicatamente il tubo per consentire alle zanzare di volare fuori e rimuovere il tubo dalla gabbia una volta che tutte le zanzare sono volate fuori.
4. Quando il tubo è privo di zanzare, svitare l'anello inferiore, rimuovere il nylon e utilizzare una pinza per rimuovere con cura la carta da filtro con le uova dal tubo. Posizionare la carta da filtro in una capsula di Petri di plastica (100 mm x 15 mm) contenente uno strato di carta da filtro inumidita con ddH₂O.
5. Osserva le uova. Le uova che sono invecchiate fino al punto in cui sono di colore grigio chiaro (Figura 4) sono pronte per l'allineamento.
   1. Se le uova sono ancora bianche, restituiscile all'incubatrice e controlla il colore ogni 5 minuti. Le uova bianche sono fragili, si rompono facilmente e non sopravvivono bene dopo il processo di iniezione con conseguente bassa schiusa.
   2. Le uova che sono grigio scuro o nero sono invecchiate troppo. Non usarli.

3. Allineamento degli embrioni

1. Tagliare un pezzo di membrana di nylon (2 cm x 1 cm) con una lama di rasoio, assicurandosi che il bordo sia ben tagliato.
   NOTA: Se il bordo non è dritto, le uova non rimarranno fissate correttamente alla membrana durante il processo di iniezione.
2. Mettere una membrana su un vetrino e coprire la membrana con un pezzo di carta da filtro (2 cm x 2 cm), lasciando scoperto ~1 mm del filtro a membrana (Figura 5).
   NOTA: assicurarsi che i vetrini del microscopio siano puliti prima dell'uso e utilizzare pinze pulite per manipolare il filtro a membrana.
3. Bagnare la carta da filtro con H₂O deionizzato poiché le uova moriranno se essiccate per periodi di tempo prolungati.
   NOTA: Non mettere troppa acqua sulla carta perché gli embrioni si muoveranno durante il processo di iniezione, ma assicurarsi che ce ne sia abbastanza per evitare che l'embrione si secchi (Figura 6A, B). L'acqua in eccesso può essere rimossa assorbendola con un pezzo di carta dafiltro.
4. Trasferire delicatamente 30-50 embrioni sul bordo della membrana con un pennello (taglia #0). Utilizzare il pennello per allineare le uova verticalmente lungo la membrana facendole rotolare delicatamente sul vetrino in modo che il lato ventrale (convesso) sia rivolto verso l'alto.
5. Orientare tutte le uova nella stessa direzione in modo che quando le uova vengono osservate al microscopio a microiniezione, l'estremità posteriore (più appuntita, Figura 6A,B)sia in posizione verso il basso e formi un angolo di ~ 15 ° con l'ago (Figura 6C). Rivestire l'intero bordo della membrana con uova (30-50) e posizionare il vetrino sotto il microscopio per l'iniezione.
   NOTA: Scegli le uova con attenzione. Scartare quelli bianchi (troppo giovani o non sviluppati) o grigio scuro (troppo vecchi e romperanno l'ago) e quelli anormali (Figura 7). Assicurati che la carta da filtro rimanga sempreumida.

4. Preparazione del DNA

1. Purificare i DNA plasmidici per iniezione, come minimo, con un kit maxiprep plasmide a DNA privo di endotossine seguendo i protocolli del produttore.
2. Sospendere il DNA in acqua di grado PCR e centrifugare a 17.100 x g in una centrifuga refrigerata per 30 minuti a 4 °C. Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico pulito da 1,5 ml. Micro-pipetta con attenzione per evitare di trasferire particolato indesiderato dalla colonna.
3. Eseguire una seconda precipitazione del DNA utilizzando un decimo di volume di acetato di sodio 3M e un volume doppio di etanolo al 100%.
4. Sospendere il DNA in 300-500 μL di acqua di grado PCR per una concentrazione finale di plasmide di 1000 ng/μL. Mescolare il cocktail di plasmidi nel tampone di iniezione per una concentrazione finale di plasmide di 300-400 ng/μL e produrre aliquote da 10-20 μL.
   NOTA: il DNA può essere conservato a -20 °C. Le aliquote di microiniezione del DNA possono essere conservate a -20 °C o a -80 °C se si utilizzano componenti di RNA. Non superare 800 ng/μL di DNA nella miscela di iniezione perché la viscosità causerà l'intasamento degli aghi.

5. Preparazione dell'ago

1. Realizzare gli aghi tirando capillari di quarzo da 10 cm utilizzando un estrattore di micropipette programmabile.
2. Esaminare l'ago al microscopio per assicurarsi che la punta sia formata bene. Assicurarsi che l'impostazione dell'ago sull'estrattore programmabile produca una punta che inizia a rastremare a circa 0,5 mm dall'estremità terminale e termina in un punto fine (vedere Figura 6). Gli aghi che si rompono facilmente di solito hanno un cono troppo lungo.
   NOTA: Le condizioni possono variare a seconda dell'estrattore dell'ago (gli autori metteranno a disposizione su richiesta le impostazioni per l'estrattore programmabile che utilizzano. Le restrizioni del diario ci impediscono di citare un marchio specifico). Gli aghi possono essere tirati a mano, ma ciò richiede un set di abilità non disponibile nella maggior parte dei laboratori.

6. Microiniezione di embrioni

1. Utilizzare una punta micro-caricatore per riempire gli aghi con 2 μL di miscela di DNA. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e collegare il tubo automatico della pompa a pressione (Figura 8).
2. Importante: allineare l'ago in modo che faccia un angolo di 15° con il piano del vetrino (Figura 8).
3. Aprire la punta dell'ago toccando con attenzione il primo uovo e iniettarlo inserendo la punta dell'ago ≤ 10 μm nel polo posteriore. Un'iniezione di successo porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'uovo.
4. Utilizzare i controlli dello stadio coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo per continuare l'iniezione.
   1. Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non si sia intasata, premere il pulsante Inietta prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola goccia all'apertura dell'ago.
   2. Se l'ago si intasa, premere il pulsante Cancella per liberare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline. Regolare la pressione secondo necessità se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per garantire che la dimensione della goccia rimanga piccola.
   3. Iniettare ~ 40-50 uova con un ago.
      NOTA: Assicurarsi che la carta da filtro rimanga sempre umida. Mantenere una contropressione sufficiente sull'ago per mantenerlo pulito. Un ago che non può essere sganciato deve essere sostituito con un nuovo ago. Il posizionamento dell'embrione, l'inserimento dell'ago e l'iniezione sono resi più facili con microscopi che hanno controlli coassiali per il movimento orizzontale dello stadio (Figura 9).
5. Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito con carta da filtro e riempito con 50 ml di H₂O deionizzato (Figura 10).
   NOTA: gli embrioni inizieranno a schiudersi 2 giorni dopo l'iniezione e potrebbero richiedere fino a 3-5 giorni. Le prime larve di instar schiuse devono essere trasferite immediatamente (controllare 2 volte al giorno) in un contenitore pulito con acqua e cibo.

Risultati

Un esempio rappresentativo dell'applicazione del protocollo di microiniezione descritto può essere trovato in Carballar-Lejarazú et al⁵. L'intento qui era quello di inserire un sistema autonomo di gene-drive nella linea germinale di un ceppo di laboratorio, G3, di An. gambiae. Il sistema è stato progettato per colpire il locus ortologo cardinale (Agcd) sul terzo cromosoma in questa specie, che codifica per un'eme perossidasi che catalizza la conversione della 3-idross...

Discussione

Con la maggiore disponibilità di tecnologie di ingegneria genetica precise e flessibili come CRISPR / Cas9, gli organismi transgenici possono essere sviluppati in modo più semplice e stabile di quanto fosse possibile in precedenza. Questi strumenti hanno permesso ai ricercatori di creare ceppi transgenici di vettori di zanzare che sono molto vicini a raggiungere le proprietà desiderate di refrattarietà ai patogeni (modifica della popolazione) o sterilità ereditaria (soppressione della popolazione). Tuttavia, per svi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Microinjection Buffer	-	-	1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)	Fisher Brand		Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)	Mili-Q		In a wash bottle
Dissecting microscope	Leica	Leica MZ12	For embryo alignment
Forceps			No. 5 size
Glass container	Pyrex	No. 3140	125 x 65
Glass slide	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubator	Barnsted Lab-line	Model No. 150	28 °C
KCl			50 mM
Latex dental film	Crosstex International	No. 19302
Microinjector	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips	Eppendorf		20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	Rainin		20 µL
Micropipette puller	Sutter Instrument	Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope	Leica	DM 1000 LED or M165 FC	For microinjection
Minimum fiber filter paper	Fisher Brand	No. 05-714-4	Chromatography Paper, Thick
Mosquitoes	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush	Blick	No. 05831-7040	Fine, size 4/0
Petri dish			Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)
Sodium acetate			3M
Quartz glass capillaries	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade	Roche	No. 03315843001