JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול לאריזת פסאודו-וירוס ולמדידת פעילות נטרול נוגדנים.

Abstract

מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת בעופות ובעופות בר. לעיתים, גם בני אדם נופלים קורבן לכך, מה שמוביל לתמותה גבוהה. עם זאת, מחקר וירוס HPAI מעוכב לעתים קרובות, בהתחשב בכך שהוא חייב להיות מטופל בתוך מעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. Pseudoviruses להוכיח להיות הכלים האידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד וירוסים HPAI H5. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים והצעדים הקריטיים של ההכנות הפסאודו-וירוס H5 HPAI ומבחני נטרול פסאודו-וירוס. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה.

Introduction

מאז 1996, נגיפי H5 מסוג A/goose/Guangdong/1/96-lineage מאוד פתוגניים של שפעת העופות (HPAI) גורמים להתפרצויות שפעת מתמשכות בעופות ובעופות בר, ואחראים להפסדים סוציו-אקונומיים עצומים בתעשיית העופות העולמית. לפעמים, בני אדם גם נדבקים בו, מתמודדים עם שיעור תמותה גבוה 1,2. עם זאת, מחקר וירוס HPAI הוא לעתים קרובות מעוכב, בהתחשב בכך שזה לא יכול להיות מטופל מחוץ למעבדות בטיחות ביולוגית רמה 3. כדי לטפל בבעיה זו, פסאודו-וירוסים מאומצים כחלופה לנגיפים מסוג פרא בחלק מהניסויים של מחקרי H5 HPAI. פסאודו-וירוסים בטוחים מספיק כדי להתאמן במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2.

פסאודו-וירוסים H5 HPAI שייכים לנגיפים כימריים המורכבים מליבות וירוסים חלופיים, מעטפות שומנים עם פני השטח של גליקופרוטאינים מנגיפי שפעת, וגנים מדווחים. ליבות פסאודו-וירוס נגזרות בדרך כלל מנגיף הכשל החיסוני האנושי הלנטי-ויראלי (HIV), רטרו-וירוסים כגון וירוס לוקמיה מורין (MLV) ונגיף סטומטיטיס שלפוחית השתן (VSV)3. באופן ספציפי, מערכת האריזה של HIV-1 נמצאת בשימוש נרחב לייצור פסאודו-וירוס שפעת, שבו הגנים העיקריים שסופקו הם gag ו- pol. גן ה- HIV gag מבטא חלבוני ליבה. הגן pol מבטא את האינטגראז ואת השעתוק ההפוך, שניהם נחוצים לביטוי הגן המדווח בתאים מותמרים. תוך חיקוי הגנום של הנגיף החלופי, הגן המדווח מאומץ לתוך ליבת הפסאודו-וירוס בצורת RNA. גן הכתב יבטא את החלבון בתאים המארחים. ניתן להשתמש ברמות ביטוי הגנים של גנים מדווחים כדי למדוד יעילות זיהום פסאודו-וירוס 3,4. המדווח העיקרי הוא לוציפראז גחלילית כדי למדוד את יחידות הלומינסנציה היחסית (RLU) או פעילות הלוציפראז היחסית (RLA) בתאים מותמרים. כתבים אחרים כגון lacZ, Gaussia, ו Renilla luciferase משמשים גם, רק במידה פחותה5.

פסאודו-וירוסים הם כלים אידיאליים לחקר נוגדנים מנטרלים נגד נגיפי H5 HAPI. כדי למדוד את עוצמת הנוגדנים המנטרלים, נעשה שימוש במבחני ניטרול פסאודו-וירוס (PN)6. Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם גליקופרוטאינים על פני השטח של שפעת A וירוס 7,8. ה-HA מורכב מתחום ראש כדורי לקשירת קולטנים ותחום גזע לאיחוי ממברנה. חלבון NA יש את פעילות sialidase כדי להקל על שחרור וירוס 7,8. בדיקת נוירופתיה היקפית יכולה למדוד נוגדנים מנטרלים המופנים לחלבוני HA. נוגדנים מנטרלים המכוונים לאזור הראש והגזע של HA יכולים להיות מזוהים גם על ידי התקשרות נגיפית ומבחני כניסה. בהשוואה לנגיפים מסוג פראי, לניסויי נטרול פסאודו-וירוסים יש ערכי זיהוי רגישים יותר, ניתן לטפל בהם בבטחה במעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 2, ובדרך כלל קלים יותר לתפעול בפועל.

פרוטוקול זה מציג בפירוט את הנהלים והצעדים הקריטיים של H5 HPAI pseudovirus ההכנות ומבחני PN. כמו כן, הוא דן בפתרון בעיות, הגבלה ושינויים של בדיקות אלה. במחקר זה, זן A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) מנגיפי H5N1 HPAI שימש כדוגמה. כדי להשיג את סרה החיסון המשמשת בבדיקות, פרוטוקול זה בחר בחלבון HA שמקורו בזן TH כאימונוגן לחיסון עכברים.

Protocol

כל פעולות הניסוי הקשורות לפסאודו-וירוס בוצעו בתנאי ABSL2 במכון פסטר של האקדמיה הסינית למדעים בשנחאי (IPS, CAS). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתבסס על פרוטוקולים מוסדיים של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של IPS, CAS.

1. אריזה Pseudovirus עם transfection סידן פוספט

  1. צור תרחיפים חד-תאיים של HEK293FT תאים (9 x 10,5 למ"ל) בתווך DMEM מלא (טבלה 1). הוסף 10 מ"ל של תרחיפים חד-תאיים לצלוחית T75, דגר את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני (CO2) במשך 20 שעות לפני הטרנספקציה.
    הערה: מומלץ HEK293FT מעבר נמוך (<20 קטעים). ודא כי monolayer התא הוא 80-90% confluent.
  2. החלף את המדיום עם 10 מ"ל של מדיום שלם טרי המכיל כלורוקין (100 מיקרומטר) 2 שעות לפני transfection.
  3. ערבבו את הריאגנטים ואת הדנ"א של פלסמיד כפי שמוצג בטבלה 2 ובאיור 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M CaCl2ו-2x HEPES buffer. פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים בעדינות, לדגור על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
  4. מעבירים את התערובת לתווך שמעל התאים, ומנדנדים את הבקבוק בעדינות. לדגור על התאים באינקובטור התא במשך 15 שעות.
  5. החלף את המדיום עם 15 מ"ל של מדיום DMEM שלם טרי. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 65 שעות.
    הערה: צבע התווך יהיה כתום בהיר או צהוב מעט, ולפחות 80% מהתא צריך להראות את האפקט הציטופתי (CPE) תחת מיקרוסקופ האור ההפוך.
  6. קצור את supernatant, וצנטריפוגה אותו ב 2095 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant, aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -80 ° C.

2. זיהוי ביטוי חלבון HA, NA ו- HIV-1 p24 של פסאודו-וירוס שפעת

  1. זהה את ביטוי חלבון HA על ידי בדיקת Hemagglutinin (HA).
    1. הוסף 50 μL של PBS לעמודות 2-12, שורות A, B ו- C של לוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות.
      הערה: שורות A, B ו- C שייכות ל- 3 בדיקות שכפול עצמאיות, ועמודה 12 משמשת כפקד השלילי.
    2. הוסף 100 μL של pseudovirus לתוך הבארות של עמודה 1. מעבירים 50 μL מטור 1 לטור 2, מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה 5 פעמים, מבצעים את הדילולים הכפולים עד לטור 11 האחרון, ומשליכים את 50 μL הנוספים מטור 11.
    3. הוסף 50 μL של 0.5% אריתרוציטים לתוך כל באר, פיפטה אותו למעלה ולמטה בעדינות פעמיים. לדגור על הצלחת במשך 30-60 דקות ב RT או עד אריתרוציטים של בקרה שלילית טופס כתמים רגילים בתחתית הבאר.
    4. התבונן ורשום טיטרים HA של pseudovirus.
      הערה: יחידת HA של הפסאודו-וירוסים היא גורם הדילול הגבוה ביותר של הנגיף שיכול לגרום ל-100% המגלולציה של תאי הדם האדומים.
  2. זיהוי ביטוי חלבוני HA ו-NA על ידי בדיקת הכתם המערבי.
    הערה: כל שלבי הכתם המערבי מבוצעים על פי המדריך לשיבוט מולקולרי(מהדורה 4 ).
  3. זהה את ביטוי החלבון HIV-1 p24 על ידי ערכת ELISA של HIV-1 p24 (רשימת חומרים).
    1. הוסף 50 μL של חיץ lysis לתוך 450 μL של דגימה pseudovirus. מערבבים היטב.
    2. הוסף 300 μL של חיץ הכביסה לכל באר של microplate. הכו את הצלחת הפוכה כדי להסיר את חיץ הכביסה לחלוטין. חזרו על הכביסה 5 פעמים.
    3. הוסף 200 μL של התקן ודוגמאות לכל באר בנפרד. לדגור אותם ב 37 ° C במשך הלילה או במשך 2 שעות.
    4. שאפו את תכולת הצלחת ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
      הערה: השאר באר אחת של לוח הבדיקה ריקה לשימוש כמצע ריק.
    5. הוסף 200 μL של נוגדנים גלאי p24 לכל באר. לדגור אותם ב 37 ° C במשך 1 שעה. שאפו ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
    6. הוסף 100 μL של תמיסת עבודה סטרפטווידין-Peroxidase לכל באר, ודגר אותם ב 37 ° C במשך 30 דקות. שאפו ושטפו את הצלחת כמתואר בשלב 2.3.2.
    7. הוסף 100 μL של פתרון העבודה substate לכל באר, כולל המצע ריק היטב, ודגר אותם ב 37 ° C במשך 30 דקות.
      הערה: צבע כחול יתפתח בבארות.
    8. הוסף 100 μL של חיץ עצירה לכל באר.
      הערה: הצבע הכחול ישתנה לצהוב באופן מיידי.
    9. קרא את הצפיפות האופטית ב- 450 ננומטר תוך 15 דקות. רשום את titers p24 של pseudovirus

3. טיטרציה Pseudovirus

  1. צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, הוסף תאים 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 ו- 40000 לבארות שונות של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 20 שעות.
  2. הוציאו את הפסאודו-וירוס מהמקרר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותו על הקרח וערברו את הפסאודו-וירוס.
  3. הוסף 6 HAU (6x יחידות HA) pseudoviruses לכל באר של צלחת עגולה 96 באר וחדש כל באר עם DMEM מלא עד 120 μL.
  4. פיפטה מעלה ומטה את התערובת 5 פעמים כדי לערבב היטב. לדגור את צלחת תערובת ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור במשך 1 שעה.
  5. מעבירים 100 μL מהתערובת לתאים בצלחת 96 בארות. החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור למשך 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה בנגיף.
  6. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומבצעים את בדיקת הלוציפראז (טבלת חומרים).
  7. מוציאים את המדיום מבארות הצלחת בזהירות. לשטוף את התאים עם 200 μL של PBS ולהסיר את PBS ככל האפשר.
    הערה: הפוך את הצלחת והשלך את הסופרנאטנט על ידי סטירה הפוכה על נייר סופג. אם קו תאי הבדיקה לא הצליח להתחבר בחוזקה לתחתית, הסר את השאיפה הבינונית בזהירות.
  8. מוסיפים 50 μL של חיץ הליזיס לכל באר, ומנדנדים את צלחת התרבית מספר פעמים. אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
    הערה: יש לערבב נפח אחד של חיץ ליזיס 5x עם 4 נפחי מים כדי ליצור את מאגר הליזיס 1x. אזנו את מאגר הליזיס 1x ל-RT לפני השימוש. נענעו את הצלחת כדי להבטיח שהתאים מכוסים לחלוטין בחיץ הליזיס. תהליך ההקפאה-הפשרה היחיד יכול לעזור לתא להיות ליזה לחלוטין.
  9. מוציאים את הצלחת, מאזנים ב-RT למשך שעתיים.
    הערה: התא צריך להיות lysed לחלוטין.
  10. רוקדים את הצלחת מספר פעמים בעדינות, ומעבירים את כל הליזטים התאיים לצלחות אטומות בנות 96 בארות.
  11. מוסיפים 50 μL של המצע לכל באר, מנערים את הצלחת מספר פעמים בעדינות, ומערבבים היטב את המצע ואת חיץ הליזיס.
  12. מדוד את האור המופק תוך 5 דקות באמצעות לומינומטר. רשום את titers luciferase של pseudovirus.
    הערה: כאשר מוסיפים מצע תקין, האור נפלט כתוצר לוואי באמצעות תגובה כימית שבה לוציפרין מומר לאוקסילוציפרין על ידי האנזים לוציפראז. כמות האור המיוצרת פרופורציונלית לכמות האנזים לוציפראז.

4. הכנת סרה חיסונית

הערה: הסרום החיסוני ישמש לניסויים הקשורים לתאים, והפעולה הניסיונית צריכה להתבצע בתנאים אספטיים.

  1. הכינו 12 נקבות עכברי BALB/c בנות שמונה שבועות. חלקו את העכברים באופן שווה לשתי קבוצות.
    הערה: קבוצה אחת הייתה קבוצת DDV והשנייה הייתה קבוצת הביקורת השלילית.
  2. חיסון קבוצת DDV: פריים פעמיים תוך שרירית עם 100 מיקרוגרם של פלסמיד DNA ממוטב קודון המקודד A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) חלבון HA בשבוע 0 ובשבוע 3 ולהגביר פעם אחת תוך צפקית עם 512 חלקיקים דמויי וירוס TH HAU (VLP) בשבוע 6.
  3. חיסון קבוצת ביקורת: פריים פעמיים תוך שרירית עם 100 מיקרוגרם DNA פלסמיד וקטורי ריק בשבוע 0 ובשבוע 3 ולהגביר פעם אחת תוך צפקית עם HIV-1 gag VLP בשבוע 6.
  4. לאסוף את דם העכבר 2 שבועות לאחר החיסון האחרון.
    הערה: כאן, העכברים היו מורדמים עם נתרן pentobarbital (65 מ"ג / ק"ג) בזמן איסוף הדם. לאחר איסוף הדם מהווריד התת-לסתי, העכברים הומתו מיד עםCO2.
  5. שמור את הדם ב RT במשך 2 שעות, ולאחר מכן 4 ° C במשך הלילה. צנטריפוגה ב 900 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant. נטרלו את הסרה על ידי הצבתה בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות.
  6. אחסנו את סרה החיסון במקרר בטמפרטורה של -80°C לשימוש.
    הערה: עיין באיור משלים 1 עבור תרשים הזרימה המתאר את ההליכים העיקריים של חיסון עכברים.

5. בדיקת נטרול פסאודו-וירוס (PN)

  1. צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף 100 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים באינקובטור של 37°C, 5% CO2 למשך 20 שעות.
  2. מוציאים את הפסאודו-וירוס והסרה מהמקרר בטמפרטורה של -80°C, מפשירים אותו על הקרח ומערבלים היטב.
  3. לדלל את sera בתווך השלם 20 פעמים, ולהוסיף 100 μL של מדיום DMEM שלם לבארות של צלחת עגולה 96 באר תחתית מעמודות 2-10.
  4. הוסף 200 μL של הסרה המדוללת לבארות של טור 2, העבר 100 μL מטור 2 לטור 3, דלל את הסרה כ- 1:20, 1:40, 1:80 וכו ', ל- 1:10240 ברציפות מטור 2 לטור 10, והשלכת 100 μL מטור 10.
  5. הוסף 100 μL של מדיום שלם DMEM לבארות של עמודה 11 כבקרה השלילית.
  6. מוסיפים 100 מיקרוליטר של פסאודו-וירוסים לכל באר, פיפטה מעלה ומטה את התערובת 5 פעמים ביסודיות, ודגרים על צלחת התערובת בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך שעה אחת.
  7. מעבירים 100 μL של התערובת מהצלחת בעלת 96 הבאר בעלת תחתית עגולה לבאר המתאימה של צלחת תרבית התאים בעלת 96 הבארות. מחזירים את הצלחת לאינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 60 שעות.
  8. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. בצע את בדיקת luciferase כמתואר בשלבים 3.7-3.12.

6. בדיקת קבצים מצורפים Pseudovirus

  1. צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (4 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף מתלי תאים של 100 μL לכל באר בלוח שטוח בעל 96 בארות. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 20 שעות.
  2. לדגור את pseudovirus עם sera ב DMEM המכיל 1% BSA ב 4 ° C במשך הלילה.
    הערה: נפח התערובת הוא 100 μL.
  3. חסום את תאי MDCK עם 100 μL לכל באר של DMEM המכיל 1% BSA ב 4 ° C במשך 1 שעות.
  4. חסן את תערובת הפסאודו-וירוס והסרום (100 μL) על השכבה החד-שכבתית MDCK ודגר עליה ב-4°C למשך שעתיים.
  5. שטפו את צלחת התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA כדי להסיר כל וירוס לא קשור.
  6. Lyse את התאים עם 100 μL של חיץ luciferase lysis ב RT במשך 30 דקות.
  7. כמת את כמות הנגיף הכבול על התאים באמצעות ערכת ELISA של HIV-1 p24 כמתואר לעיל (סעיף 2.3).

7. הערכה של כניסה ויראלית

  1. צור תרחיפים חד-תאיים של תאי MDCK (5 x 104 למ"ל) בתווך DMEM מלא, והוסף 100 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 20 שעות לפני הבדיקה.
  2. חסן את הפסאודו-וירוס (100 μL) על שכבה חד-שכבתית MDCK בצלחת של 96 בארות ב-4°C למשך 6 שעות.
  3. שטפו את צלחת התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA כדי להסיר פסאודו-וירוסים לא מאוגדים.
  4. הוסף 100 μL של סרה חיסונית בדילול סדרתי או סרה מעכברי חיסון דמה ב- DMEM המכיל 1% BSA לחד-שכבתי, ודגר על התא ב -4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. הסר את supernatant התא, ולשטוף את צלחת תרבית התא 4 פעמים עם PBS המכיל 1% BSA.
  6. הוסף DMEM טרי לתאים ודגור במשך 60 שעות באינקובטור 37°C, 5% CO2 .
  7. מדוד את פעילות הלוציפראז היחסית (RLA) של התאים כמתואר בשלבים 3.7-3.12.
    הערה: ערך ויראלי, כפי שצוין על ידי RLA, התבטא כאחוז מהקריאה המתקבלת בהיעדר סרה, שנקבע כ -100%.

תוצאות

HA, NA ו- HIV-1 p24 ביטוי חלבון של פסאודו-וירוס שפעת
כדי לזהות את יעילות האריזה הנגיפית, מלאי פסאודו-וירוס של שפעת זוהה לראשונה על-ידי בדיקת HA (איור 2A). יחידות HA למיליליטר של פסאודו-וירוסים של שפעת הן 643 (טבלה 3). בדיקות כתם מערבי ומבחני ELISA סנדוויץ' שימשו לבדיקת ביט...

Discussion

תאי HEK293FT משמשים בדרך כלל כתאי אריזה לייצור פסאודו-וירוסים. זיהוי מיקופלסמה קבוע חיוני במהלך תרבית התא. זיהום מיקופלסמה יכול להפחית באופן דרסטי את תפוקת הפסאודו-וירוס ולפעמים קרוב לאפס. בהשוואה לזיהומים אחרים, זיהומי מיקופלסמה אינם מובילים לשינויים בערך ה- pH או לעכירות של מדיום תרבית התא. ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המחקר מפרויקט בניית יכולת החדשנות של מחוז ג'יאנגסו (BM2020019), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של שנזן (לא. JSGG20200225150702770), תוכנית מחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDB29030103), הפרויקט המדעי והטכנולוגי של גואנגדונג (מס '2020B1111340076) ותוכנית המחקר הפתוח של מעבדת מפרץ שנזן (לא. SZBL202002271003).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Chiken ErythrocyteBio-channelBC-RBC-C001Reagent
96-well cell culture plates (flat-bottom)Thermo fisher scientific167008consumable material
96-well cell culture plates (round-bottom)Thermo fisher scientific163320consumable material
Allegra X-15RBeckman coulter--Equipment/Centrifuge
BD Insulin SyringesBD324910consumable material
Calcium Chloride AnhydrousAMRESCO1B1110-500GReagent
chloroquine diphosphateSelleckS4157Reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12100-046Reagent
Fetal Bovine SerumGibco16000-044Reagent
HEK293FTGibcoR700-07Cell line
HEPES FREE ACIDAMRESCO0511-250GReagent
HIV-1 p24 Antigen ELISAZeptoMetrix801111Reagent kit
Luciferase Assay System Freezer PackPromegaE4530Reagent kit
MDCK.1ATCCCRL-2935Cell line
Microcentrifuge Tubes 1.5 mLThermo fisher scientific509-GRD-Qconsumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mLThermo fisher scientific339650consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mLThermo fisher scientific339652consumable material
Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo fisher scientific156499consumable material
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122Reagent
Pipette Tips (10 μL)Thermo fisher scientificTF102-10-Qconsumable material
Pipette Tips (100 μL)Thermo fisher scientificTF113-100-Qconsumable material
Pipette Tips (1000 μL)Thermo fisher scientificTF112-1000-Qconsumable material
Serological pipets (5 mL)Thermo fisher scientific170355Nconsumable material
Serological pipets (10 mL)Thermo fisher scientific170356Nconsumable material
Trypsin/EDTAGibco25200-072Reagent
Varioskan FlashThermo fisher scientific--Equipment/Microplate reader
Water Jacket IncubatorThermo fisher scientific3111Equipment/Cell incubator
Pentobarbital sodium saltSigma57-33-0Reagent

References

  1. Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
  2. Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
  3. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
  4. Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
  5. Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
  6. Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
  7. Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
  8. Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
  9. Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
  10. Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
  11. Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
  13. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
  16. . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
  17. . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE177H5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved