Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

요약

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.

서문

1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 ^1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.

H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.³. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하기 위해 널리 사용되며, 여기서 제공되는 주요 유전자는 gag 및 pol입니다. HIV gag 유전자는 핵심 단백질을 발현합니다. pol 유전자는 인테그라제 및 역전사효소를 발현하며, 둘 다 형질도입된 세포에서 리포터 유전자의 발현에 필요합니다. 대리 바이러스의 게놈을 모방한 리포터 유전자는 RNA 형태로 유사바이러스 코어에 흡수됩니다. 리포터 유전자는 숙주 세포에서 단백질을 발현합니다. 리포터 유전자의 유전자 발현 수준은 슈도바이러스 감염 효율을 측정하는데 사용될 수 있다 ^3,4. 1차 리포터는 형질도입된 세포에서 상대 발광 단위(RLU) 또는 상대 루시페라아제 활성(RLA)을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라아제입니다. lacZ, Gaussia, Renilla luciferase 와 같은 다른 리포터들도 사용되지만 그 정도는 적습니다⁵.

슈도바이러스는 H5 HAPI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 중화 항체 효능을 측정하기 위해, 슈도바이러스 중화(PN)^분석법(6)이 사용된다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)는 인플루엔자 A 바이러스 ^7,8의 표면에 있는 당단백질입니다. HA는 수용체 결합을 위한 구형 헤드 도메인과 막 융합을 위한 줄기 도메인으로 구성됩니다. NA 단백질은 바이러스 방출을 촉진하는 시알리다아제 활성을 가지고 있습니다 ^7,8. PN 분석은 HA 단백질에 대한 중화 항체를 측정할 수 있습니다. HA의 머리 및 줄기 영역으로 향하는 중화 항체는 또한 바이러스 부착 및 진입 분석에 의해 검출될 수 있다. 야생형 바이러스에 비해 유사 바이러스 중화 실험은 검출 값이 더 민감하고 레벨 2 생물 안전 실험실에서 안전하게 처리 할 수 있으며 일반적으로 실제로 작동하기가 더 쉽습니다.

이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 PN 분석의 절차와 중요한 단계를 자세히 제시합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 본 연구에서는 H5N1 HPAI 바이러스의 A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) 균주를 예로 들어 설명하였다. 분석에 사용되는 면역 혈청을 얻기 위해, 이 프로토콜은 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 TH 균주로부터 유래된 HA 단백질을 선택하였다.

프로토콜

모든 슈도바이러스 관련 실험 작업은 상하이 중국과학원 파스퇴르 연구소(IPS, CAS)에서 ABSL2 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 IPS, CAS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜을 기반으로 수행되었습니다.

1. Calcium-phosphate transfection을 사용한 유사바이러스 패키징

1. 완전한 DMEM 배지에서 HEK293FT 세포(mL당 9 x 10⁵)의 단일 세포 현탁액을 만듭니다(표 1). 단세포 현탁액 10 mL를 T75 플라스크에 넣고, 형질감염 전에 20 시간 동안 37°C, 5% 이산화탄소 (_CO2) 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다.
   알림: HEK293FT 낮은 통로(<20통로)를 권장합니다. 셀 단층이 80-90% 합류하는지 확인하십시오.
2. 형질감염 2시간 전에 배지를 클로로퀸(100μM)을 함유하는 완전한 신선한 배지 10mL로 교체합니다.
3. 표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이 시약 및 플라스미드 DNA를 혼합한다: ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M_CaCl2, 및 2x HEPES 완충액. 부드럽게 위아래로 5회 피펫팅하고, 혼합물을 실온(RT)에서 20분 동안 배양한다.
4. 혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔듭니다. 세포 배양기에서 세포를 15시간 동안 배양합니다.
5. 배지를 15mL의 새로운 완전 DMEM 배지로 교체합니다. 세포를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 65시간 동안 인큐베이션한다.
   참고: 배지의 색상은 밝은 주황색 또는 약간 노란색이며 세포의 최소 80%가 도립 광학 현미경에서 세포 변성 효과(CPE)를 보여야 합니다.
6. 상청액을 수확하고, 4°C에서 20분 동안 2095 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 수집하고, 분취하고, -80 °C에서 저장한다.

2. 인플루엔자 슈도바이러스의 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 검출

1. 헤마글루티닌(HA) 분석법으로 HA 단백질 발현을 검출합니다.
   1. 50μL의 PBS를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2-12, 행 A, B 및 C에 추가합니다.
      참고: 행 A, B 및 C는 3개의 독립적인 복제 테스트에 속하며 열 12는 음성 대조군으로 사용됩니다.
   2. 100μL의 슈도바이러스를 컬럼 1의 웰에 추가합니다. 컬럼 1에서 컬럼 2로 50μL를 옮기고, 위아래로 5회 피펫팅하여 잘 혼합하고, 마지막 컬럼 11까지 2배 희석을 수행하고, 컬럼 11에서 추가로 50μL를 버립니다.
   3. 0.5% 적혈구 50μL를 각 웰에 넣고 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다. RT에서 30-60 분 동안 또는 음성 대조군의 적혈구가 우물 바닥에 규칙적인 반점을 형성 할 때까지 플레이트를 배양하십시오.
   4. 슈도바이러스의 HA 역가를 관찰하고 기록합니다.
      참고: 슈도바이러스의 HA 단위는 적혈구의 100% 혈구 응집을 유발할 수 있는 바이러스의 가장 높은 희석 인자입니다.
2. 웨스턴 블롯 분석에 의한 HA 및 NA 단백질 발현 검출.
   참고: 모든 웨스턴 블롯 단계는 분자 복제 매뉴얼(4^판 )에 따라 수행됩니다.
3. HIV-1 p24 ELISA 키트(Table of Materials)로 HIV-1 p24 단백질 발현을 검출한다.
   1. 용해 완충액 50μL를 450μL의 유사바이러스 샘플에 추가합니다. 철저히 섞는다.
   2. 세척 완충액 300 μL를 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 거꾸로 쳐서 세척 버퍼를 완전히 제거합니다. 세탁을 5 번 반복하십시오.
   3. 200 μL의 표준물질과 시료를 각 웰에 개별적으로 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 또는 2시간 동안 배양합니다.
   4. 플레이트의 내용물을 흡인하고 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 세척하십시오.
      참고: 기판 블랭크로 사용하기 위해 분석 플레이트의 한 웰을 비워 둡니다.
   5. 각 웰에 p24 검출기 항체 200μL를 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.
   6. 스트렙타비딘-퍼옥시다제 작업 용액 100μL를 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 2.3.2 단계에 설명 된대로 플레이트를 흡인하고 세척하십시오.
   7. 기판 블랭크 웰을 포함한 각 웰에 100μL의 substate 작업 용액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
      알림: 우물에서 파란색이 발생합니다.
   8. 100 μL의 정지 완충액을 각 웰에 추가합니다.
      알림: 파란색은 즉시 노란색으로 바뀝니다.
   9. 450nm에서 15분 이내에 광학 밀도를 판독합니다. 슈도바이러스의 p24 역가를 기록합니다.

3. 슈도바이러스 적정

1. 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 10⁴ )을 만들고 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 및 40000 세포를 96웰 평평한 바닥 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 세포를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
2. -80°C 냉장고에서 슈도바이러스를 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 슈도바이러스를 소용돌이친다.
3. 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 6개의 HAU(6x HA 단위) 슈도바이러스를 추가하고 각 웰에 최대 120μL의 완전한 DMEM을 보충합니다.
4. 혼합물을 위아래로 5번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
5. 혼합물 100 μL를 96-웰 플레이트의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염 후 48시간, 60시간 및 72시간 동안 세포 배양 접시를 다시 배양기에 넣습니다.
6. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 루시페라아제 분석(Table of Materials)을 수행합니다.
7. 플레이트의 웰에서 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 200 μL의 PBS로 세포를 헹구고 가능한 한 PBS를 제거합니다.
   알림: 접시를 뒤집고 흡수성 종이에 거꾸로 두드려 상등액을 버립니다. 테스트 세포주가 바닥에 단단히 부착되지 않으면 배지 흡인을 조심스럽게 제거합니다.
8. 용해 완충액 50μL를 각 웰에 넣고 배양 플레이트를 여러 번 흔듭니다. 플레이트를 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
   알림: 1x 용해 버퍼 5개와 물 4개를 혼합하여 1x 용해 버퍼를 만듭니다. 사용하기 전에 1x 용해 버퍼를 RT로 평형화하십시오. 세포가 용해 완충액으로 완전히 덮이도록 플레이트를 흔듭니다. 단일 동결-해동 공정은 세포가 완전히 용해되도록 도울 수 있습니다.
9. 플레이트를 꺼내 RT에서 2시간 동안 평형을 이룹니다.
   알림: 셀은 완전히 용해되어야 합니다.
10. 플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다.
11. 기질 50μL를 각 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 여러 번 흔든 다음 기질과 용해 완충액을 완전히 혼합합니다.
12. 광도계를 사용하여 5분 이내에 생성된 빛을 측정합니다. 슈도바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다.
    참고: 적절한 기질이 첨가되면 루시페린이 루시페라아제 효소에 의해 옥시루시페린으로 전환되는 화학 반응을 통해 부산물로 빛이 방출됩니다. 생성되는 빛의 양은 루시페라아제 효소의 양에 비례합니다.

4. 면역 혈청 준비

참고: 면역 혈청은 세포 관련 실험에 사용되며 실험 작업은 무균 조건에서 수행되어야 합니다.

1. 8주령의 암컷 BALB/c 마우스 12마리를 준비합니다. 마우스를 두 그룹으로 균등하게 나눕니다.
   참고: 한 그룹은 DDV 그룹이었고 다른 그룹은 음성 대조군이었습니다.
2. DDV 그룹 면역화: 0주 및 3주에 A/Thailand/(KAN-1)/2004(TH) HA 단백질을 암호화하는 코돈 최적화 DNA 플라스미드 100μg으로 근육내 2회 프라이밍하고 6주차에 512 HAU TH 바이러스 유사 입자(VLP)로 복강내 1회 증폭합니다.
3. 대조군 면역화: 0주 및 3주에 100μg의 빈 벡터 플라스미드 DNA로 근육내 2회 프라이밍하고 6주에 HIV-1 gag VLP로 복강내 1회 부스팅합니다.
4. 마지막 예방 접종 후 2 주 후에 마우스 혈액을 수집합니다.
   참고: 여기에서 마우스는 채혈 시 펜토바르비탈 나트륨(65mg/kg)으로 마취되었습니다. 턱밑 정맥으로부터 혈액을 채취한 후, 마우스를_CO2로 즉시 안락사시켰다.
5. 혈액을 RT에서 2시간 동안 유지한 다음 밤새 4°C로 유지합니다. 4°C에서 10분 동안 900 x g 로 원심분리하고 상층액을 수집합니다. 혈청을 56°C에서 30분 동안 두어 비활성화합니다.
6. 면역 혈청을 -80°C 냉장고에 보관하여 사용하십시오.
   참고: 마우스 예방 접종의 주요 절차를 설명하는 순서도는 보충 그림 1 을 참조하십시오.

5. 슈도바이러스 중화(PN) 분석

1. 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 10⁴ )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 세포를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
2. -80°C 냉장고에서 슈도바이러스와 혈청을 꺼내 얼음 위에서 해동한 후 완전히 소용돌이칩니다.
3. 완전한 배지에서 혈청을 20배 희석하고, 컬럼 2-10에서 96웰 둥근 바닥 플레이트의 웰에 완전한 DMEM 배지 100μL를 추가합니다.
4. 희석된 혈청 200μL를 2열의 웰에 넣고 100μL를 2열에서 3열로 옮기고 혈청을 1:20, 1:40, 1:80 등으로 1:10240으로 연속적으로 2열에서 10열로 희석하고 100μL를 10열에서 버립니다.
5. 100μL의 DMEM 완전 배지를 음성 대조군으로 컬럼 11의 웰에 추가합니다.
6. 100 μL의 슈도바이러스를 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 5회 완전히 위아래로 피펫팅하고, 혼합물 플레이트를 37°C, 5%_CO2 에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
7. 혼합물 100μL를 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 96웰 세포 배양 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 플레이트를 다시 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에 60시간 동안 넣었다.
8. 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 3.7-3.12단계에 설명된 대로 루시페라아제 분석을 수행합니다.

6. 슈도바이러스 부착 분석

1. 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 4 x 10⁴ 개)을 만들고 96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 100μL 세포 현탁액을 추가합니다. 세포를 37°C, 5%_CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
2. 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA를 함유하는 DMEM에서 혈청과 함께 슈도바이러스를 인큐베이션한다.
   참고: 혼합물의 부피는 100μL입니다.
3. MDCK 세포를 1시간 동안 4°C에서 1% BSA를 함유하는 DMEM의 웰 당 100 μL로 차단하였다.
4. 유사 바이러스 및 혈청 혼합물(100μL)을 MDCK 단층에 접종하고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 세포판을 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 바이러스를 제거합니다.
6. RT에서 100μL의 루시페라아제 용해 완충액으로 30분 동안 세포를 용해합니다.
7. 상술한 바와 같이 HIV-1 p24 ELISA 키트로 세포에 결합된 바이러스의 양을 정량화한다(섹션 2.3).

7. 바이러스 진입 평가

1. 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 단일 세포 현탁액(mL당 5 x 10⁴ )을 만들고 96웰 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 분석 전에 세포를 37°C, 5%_CO2 에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
2. 슈도바이러스(100μL)를 4°C에서 6시간 동안 96웰 플레이트의 MDCK 단층에 접종합니다.
3. 세포판을 1% BSA를 함유하는 PBS로 4회 세척하여 결합되지 않은 슈도바이러스를 제거한다.
4. 1% BSA를 함유하는 DMEM에서 가짜 백신 접종 마우스에서 연속적으로 희석된 면역 혈청 또는 혈청 100μL를 단층에 추가하고 4°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
5. 세포 상층액을 제거하고, 세포 배양 접시를 1% BSA가 함유된 PBS로 4회 세척하였다.
6. 신선한 DMEM을 세포에 첨가하고 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 60시간 동안 인큐베이션한다.
7. 3.7-3.12 단계에 설명된 대로 세포의 상대적 루시페라아제 활성(RLA)을 측정합니다.
   참고: RLA에 표시된 바이러스 항목은 혈청이 없을 때 얻은 판독값의 백분율로 표시되었으며 100%로 설정되었습니다.

결과

HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 인플루엔자 슈도바이러스
바이러스 패키징 효율을 확인하기 위해, 인플루엔자 슈도바이러스 스톡을 먼저 HA 분석에 의해 검출하였다(도 2A). 인플루엔자 슈도바이러스의 밀리리터당 HA 단위는 643입니다(표 3). 웨스턴 블롯 분석 및 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현을 테스트했습니다. 이어서, HA...

토론

HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Chiken Erythrocyte	Bio-channel	BC-RBC-C001	Reagent
96-well cell culture plates (flat-bottom)	Thermo fisher scientific	167008	consumable material
96-well cell culture plates (round-bottom)	Thermo fisher scientific	163320	consumable material
Allegra X-15R	Beckman coulter	--	Equipment/Centrifuge
BD Insulin Syringes	BD	324910	consumable material
Calcium Chloride Anhydrous	AMRESCO	1B1110-500G	Reagent
chloroquine diphosphate	Selleck	S4157	Reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12100-046	Reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-044	Reagent
HEK293FT	Gibco	R700-07	Cell line
HEPES FREE ACID	AMRESCO	0511-250G	Reagent
HIV-1 p24 Antigen ELISA	ZeptoMetrix	801111	Reagent kit
Luciferase Assay System Freezer Pack	Promega	E4530	Reagent kit
MDCK.1	ATCC	CRL-2935	Cell line
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo fisher scientific	509-GRD-Q	consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL	Thermo fisher scientific	339650	consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL	Thermo fisher scientific	339652	consumable material
Nunc EasYFlask 75 cm2	Thermo fisher scientific	156499	consumable material
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
Pipette Tips (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF102-10-Q	consumable material
Pipette Tips (100 μL)	Thermo fisher scientific	TF113-100-Q	consumable material
Pipette Tips (1000 μL)	Thermo fisher scientific	TF112-1000-Q	consumable material
Serological pipets (5 mL)	Thermo fisher scientific	170355N	consumable material
Serological pipets (10 mL)	Thermo fisher scientific	170356N	consumable material
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Reagent
Varioskan Flash	Thermo fisher scientific	--	Equipment/Microplate reader
Water Jacket Incubator	Thermo fisher scientific	3111	Equipment/Cell incubator
Pentobarbital sodium salt	Sigma	57-33-0	Reagent