Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.

Résumé

Depuis 1996, les virus H5 de la lignée A/oie/Guangdong/1/96-lignée hautement pathogène (IAHP) sont à l’origine d’épidémies de grippe chez les volailles et les oiseaux sauvages. Parfois, les humains en sont également victimes, ce qui entraîne une mortalité élevée. Néanmoins, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle doit être traitée dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus s’avèrent être les outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus IAHP H5. Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests.

Introduction

Depuis 1996, les virus H5 de la grippe aviaire hautement pathogène (IAHP) de la lignée A/oie/Guangdong/1/96 sont à l’origine d’épidémies de grippe continuelles chez les volailles et les oiseaux sauvages, ce qui représente d’énormes pertes socio-économiques dans l’industrie mondiale de la volaille. Parfois, les humains sont également infectés par elle, confrontés à un taux de mortalité élevé ^1,2. Cependant, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle ne peut pas être traitée en dehors des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus sont suffisamment sûrs pour être pratiqués dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2.

Les pseudovirus IAHP H5 appartiennent à des virus chimériques constitués de noyaux de virus de substitution, d’enveloppes lipidiques avec les glycoprotéines de surface des virus de la grippe et de gènes rapporteurs. Les carottes de pseudovirus sont généralement dérivées du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) lentivirale, des rétrovirus tels que le virus de la leucémie murine (MLV) et du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV)³. Plus précisément, le système d’emballage du VIH-1 est largement utilisé pour produire le pseudovirus de la grippe, où les principaux gènes fournis sont gag et pol. Le gène gag du VIH exprime les protéines centrales. Le gène pol exprime l’intégrase et la transcriptase inverse, toutes deux nécessaires à l’expression du gène rapporteur dans les cellules transduites. Imitant le génome du virus de substitution, le gène rapporteur est intégré dans le noyau du pseudovirus sous forme d’ARN. Le gène rapporteur exprimera la protéine dans les cellules hôtes. Les niveaux d’expression génique des gènes rapporteurs peuvent être utilisés pour mesurer l’efficacité de l’infection pseudovirale ^3,4. Le rapporteur principal est la luciférase luciole pour mesurer les unités de luminescence relative (RLU) ou l’activité relative de la luciférase (RLA) dans les cellules transduites. D’autres rapporteurs tels que lacZ, Gaussia et Renilla luciferase sont également utilisés, mais dans une moindre mesure⁵.

Les pseudovirus sont des outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus H5 HAPI. Pour mesurer le pouvoir neutralisant des anticorps, les tests de neutralisation des pseudovirus (PN)⁶ sont utilisés. L’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) sont des glycoprotéines présentes à la surface du virus de la grippe A ^7,8. Le HA est composé d’un domaine de tête globulaire pour la liaison au récepteur et d’un domaine souche pour la fusion membranaire. La protéine NA a l’activité sialidase pour faciliter la libération du virus ^7,8. Un test NP peut mesurer des anticorps neutralisants dirigés contre les protéines HA. Les anticorps neutralisants dirigés contre la tête et la région souche de l’HA peuvent également être détectés par des tests de fixation et d’entrée virales. Par rapport aux virus de type sauvage, les expériences de neutralisation des pseudovirus ont des valeurs de détection plus sensibles, peuvent être manipulées en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 et sont généralement plus faciles à utiliser dans la pratique.

Ce protocole présente en détail les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests PN. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests. Dans cette étude, la souche A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) des virus IAHP H5N1 a été utilisée comme exemple. Pour obtenir les sérums immunitaires utilisés dans les essais, ce protocole a sélectionné la protéine HA provenant de la souche TH comme immunogène pour immuniser les souris.

Protocole

Toutes les opérations expérimentales liées aux pseudovirus ont été réalisées sous condition ABSL2 à l’Institut Pasteur de l’Académie chinoise des sciences de Shanghai (IPS, CAS). Les expériences sur les animaux ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’IPS, CAS.

1. Emballage de pseudovirus avec transfection de phosphate de calcium

1. Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules HEK293FT (9 x 10⁵ par mL) dans un milieu DMEM complet (tableau 1). Ajouter 10 mL des suspensions unicellulaires dans une fiole T75, incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) pendant 20 h avant la transfection.
   NOTE: HEK293FT passage bas (<20 passages) est recommandé. Assurez-vous que la monocouche cellulaire est confluente à 80-90%.
2. Remplacer le milieu par 10 mL de milieu complet frais contenant de la chloroquine (100 μM) 2 h avant la transfection.
3. Mélanger les réactifs et l’ADN plasmidique comme indiqué dans le Tableau 2 et la Figure 1 : ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl 2 et 2x tampon HEPES. Pipeter 5 fois doucement, incuber le mélange à température ambiante (TR) pendant 20 min.
4. Transférer le mélange dans le milieu au-dessus des cellules et bercer doucement la fiole. Incuber les cellules dans l’incubateur cellulaire pendant 15 h.
5. Remplacer le milieu par 15 ml de milieu DMEM complet frais. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ pendant 65 h.
   REMARQUE: La couleur du milieu sera orange clair ou légèrement jaune, et au moins 80% de la cellule doit montrer l’effet cytopathique (CPE) sous le microscope à lumière inversée.
6. Récolter le surnageant et le centrifuger à 2095 x g pendant 20 min à 4 °C. Prélever le surnageant, l’aliquote et le conserver à -80 °C.

2. Détection de l’expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus grippal

1. Détecter l’expression de la protéine HA par le dosage de l’hémagglutinine (HA).
   1. Ajouter 50 μL de PBS dans les colonnes 2 à 12, rangées A, B et C d’une plaque à fond rond de 96 puits.
      Remarque : Les lignes A, B et C appartiennent à 3 tests de réplication indépendants et la colonne 12 est utilisée comme contrôle négatif.
   2. Ajouter 100 μL de pseudovirus dans les puits de la colonne 1. Transvaser 50 μL de la colonne 1 dans la colonne 2, bien mélanger en pipetant 5 fois de haut en bas, effectuer les deux dilutions jusqu’à la dernière colonne 11 et éliminer les 50 μL supplémentaires de la colonne 11.
   3. Ajouter 50 μL d’érythrocyte à 0,5 % dans chaque puits, le pipeter doucement de haut en bas deux fois. Incuber la plaque pendant 30-60 min à TA ou jusqu’à ce que les érythrocytes du témoin négatif forment les taches régulières au fond du puits.
   4. Observez et enregistrez les titres HA du pseudovirus.
      REMARQUE: L’unité HA des pseudovirus est le facteur de dilution le plus élevé du virus qui peut causer une hémagglutination à 100% des globules rouges.
2. Détecter l’expression des protéines HA et NA par le test Western blot.
   REMARQUE: Toutes les étapes du transfert Western sont effectuées conformément au manuel de clonage moléculaire (4e^édition).
3. Détecter l’expression de la protéine p24 du VIH-1 à l’aide du kit ELISA VIH-1 p24 (Table of Materials).
   1. Ajouter 50 μL du tampon de lyse dans 450 μL d’échantillon de pseudovirus. Mélangez bien.
   2. Ajouter 300 μL du tampon de lavage à chaque puits de la microplaque. Frappez la plaque inversée pour retirer complètement le tampon de lavage. Répétez le lavage 5 fois.
   3. Ajouter 200 μL de l’étalon et des échantillons à chaque puits séparément. Incuber à 37 °C pendant une nuit ou pendant 2 h.
   4. Aspirer le contenu de la plaque et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
      REMARQUE: Laissez un puits de la plaque d’essai vide pour l’utiliser comme substrat vierge.
   5. Ajouter 200 μL d’anticorps du détecteur p24 à chaque puits. Incuber à 37 °C pendant 1 h. Aspirer et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
   6. Ajouter 100 μL de la solution de travail streptavidine-peroxydase à chaque puits et les incuber à 37 °C pendant 30 min. Aspirer et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
   7. Ajouter 100 μL de la solution de travail sous-étatique à chaque puits, y compris le puits de substrat vierge, et les incuber à 37 °C pendant 30 min.
      REMARQUE: La couleur bleue se développera dans les puits.
   8. Ajouter 100 μL du tampon d’arrêt à chaque puits.
      REMARQUE: La couleur bleue passera immédiatement en jaune.
   9. Lire la densité optique à 450 nm en 15 min. Enregistrer les titres p24 du pseudovirus

3. Titrage des pseudovirus

1. Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 10⁴ par mL) dans un milieu DMEM complet, ajouter 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 et 40000 cellules à différents puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ pendant 20 h.
2. Sortez le pseudovirus du réfrigérateur à -80 °C, décongelez-le sur la glace et vortex le pseudovirus.
3. Ajouter 6 pseudovirus HAU (6x unités HA) à chaque puits de plaque à fond rond de 96 puits et reconstituer chaque puits avec du DMEM complet jusqu’à 120 μL.
4. Pipeter 5 fois le mélange pour bien mélanger. Incuber la plaque de mélange dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 1 heure.
5. Transférer 100 μL du mélange dans les cellules de la plaque de 96 puits. Remettez la plaque de culture cellulaire dans l’incubateur pendant 48 h, 60 h et 72 h après l’infection virale.
6. Sortez la plaque de l’incubateur et effectuez le dosage de la luciférase (Tableau des matériaux).
7. Retirez soigneusement le milieu des puits de la plaque. Rincez les cellules avec 200 μL de PBS et retirez le PBS autant que possible.
   REMARQUE: Retournez la plaque et jetez le surnageant en l’inversant sur du papier absorbant. Si la lignée cellulaire d’essai n’a pas pu se fixer fermement au fond, retirez soigneusement le milieu d’aspiration.
8. Ajouter 50 μL du tampon de lyse à chaque puits et secouer la plaque de culture plusieurs fois. Conserver la plaque à -80 °C pendant la nuit.
   REMARQUE: Mélanger 1 volume de 5x tampon de lyse avec 4 volumes d’eau pour faire le tampon de lyse 1x. Équilibrer le tampon de lyse 1x à RT avant utilisation. Balancez la plaque pour vous assurer que les cellules sont complètement recouvertes du tampon de lyse. Le processus unique de congélation-décongélation peut aider la cellule à être lysée complètement.
9. Sortir la plaque, équilibrer à TA pendant 2 h.
   REMARQUE: La cellule doit être lysée complètement.
10. Balancez la plaque plusieurs fois doucement et transférez tous les lysats cellulaires sur des plaques opaques à 96 puits.
11. Ajouter 50 μL de substrat à chaque puits, secouer la plaque plusieurs fois doucement et bien mélanger le substrat et le tampon de lyse.
12. Mesurer la lumière produite en 5 minutes à l’aide d’un luminomètre. Enregistrez les titres de luciférase du pseudovirus.
    REMARQUE: Lorsqu’un substrat approprié est ajouté, la lumière est émise en tant que sous-produit via une réaction chimique dans laquelle la luciférine est convertie en oxyluciférine par l’enzyme luciférase. La quantité de lumière produite est proportionnelle à la quantité de l’enzyme luciférase.

4. Préparation du sérum immunitaire

REMARQUE: Le sérum immunitaire sera utilisé pour des expériences liées aux cellules, et l’opération expérimentale doit être effectuée dans des conditions aseptiques.

1. Préparez 12 souris BALB/c femelles âgées de huit semaines. Divisez également les souris en deux groupes.
   NOTE: Un groupe était le groupe DDV et l’autre était le groupe témoin négatif.
2. Immunisation du groupe DDV : Amorcer deux fois par voie intramusculaire avec 100 μg d’un plasmide d’ADN optimisé pour le codon codant pour la protéine HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) à la semaine 0 et à la semaine 3 et augmenter une fois par voie intrapéritonéale avec 512 particules pseudo-virales (VLP) HAU TH à la semaine 6.
3. Immunisation du groupe témoin : amorcer deux fois par voie intramusculaire avec 100 μg d’ADN plasmidique vectoriel vide à la semaine 0 et à la semaine 3 et augmenter une fois par voie intrapéritonéale avec le VLP gag du VIH-1 à la semaine 6.
4. Prélever le sang de souris 2 semaines après la dernière vaccination.
   REMARQUE: Ici, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique (65 mg / kg) au moment de la collecte de sang. Après prélèvement sanguin dans la veine sous-maxillaire, les souris ont été euthanasiées immédiatement avec du CO₂.
5. Gardez le sang à TA pendant 2 h, puis 4 °C pendant la nuit. Centrifuger à 900 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Inactiver le sérum en le plaçant à 56 °C pendant 30 min.
6. Conservez les sérums immunitaires au réfrigérateur à -80 °C en vue de leur utilisation.
   REMARQUE : Reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour obtenir l’organigramme qui décrit les principales procédures d’immunisation des souris.

5. Test de neutralisation des pseudovirus (NP)

1. Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 10⁴ par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter 100 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ pendant 20 h.
2. Sortez le pseudovirus et le sérum du réfrigérateur à -80 °C, décongelez-les sur la glace et vortex soigneusement.
3. Diluer le sérum dans le milieu complet 20 fois et ajouter 100 μL de milieu DMEM complet dans les puits d’une plaque à fond rond de 96 puits provenant des colonnes 2 à 10.
4. Ajouter 200 μL du sérum dilué dans les puits de la colonne 2, transférer 100 μL de la colonne 2 à la colonne 3, diluer les sérums sous forme 1:20, 1:40, 1:80, etc., à 1:10240 successivement de la colonne 2 à la colonne 10, et éliminer les 100 μL de la colonne 10.
5. Ajouter 100 μL de milieu complet DMEM aux puits de la colonne 11 comme témoin négatif.
6. Ajouter 100 μL de pseudovirus à chaque puits, pipeter le mélange 5 fois et incuber la plaque de mélange dans une plaque de mélange à 37 °C, 5% CO₂ pendant 1 h.
7. Transférer 100 μL du mélange de la plaque à fond rond de 96 puits au puits correspondant de la plaque de culture cellulaire de 96 puits. Remettre la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5% CO₂) pendant 60 h.
8. Sortez l’assiette de l’incubateur. Effectuer le test de luciférase comme décrit aux étapes 3.7-3.12.

6. Essai d’attachement de pseudovirus

1. Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (4 x 10⁴ par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter des suspensions cellulaires de 100 μL à chaque puits dans une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 20 h.
2. Incuber le pseudovirus avec des sérums dans du DMEM contenant 1 % de BSA à 4 °C pendant une nuit.
   NOTE: Le volume du mélange est de 100 μL.
3. Bloquer les cellules MDCK avec 100 μL par puits de DMEM contenant 1% de BSA à 4 °C pendant 1 h.
4. Inoculer le pseudovirus et le mélange de sérum (100 μL) sur la monocouche MDCK et l’incuber à 4 °C pendant 2 h.
5. Lavez la plaque cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA pour éliminer tout virus non lié.
6. Lyser les cellules avec 100 μL de tampon de lyse de la luciférase à TA pendant 30 min.
7. Quantifier la quantité de virus lié sur les cellules à l’aide d’un kit ELISA VIH-1 p24 comme décrit ci-dessus (rubrique 2.3).

7. Évaluation de l’entrée virale

1. Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 10⁴ par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter 100 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 20 h avant le dosage.
2. Inoculer le pseudovirus (100 μL) sur une monocouche MDCK dans une plaque de 96 puits à 4 °C pendant 6 h.
3. Lavez la plaque cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA pour éliminer les pseudovirus non liés.
4. Ajouter 100 μL de sérums immunitaires dilués en série ou de sérums provenant de souris de vaccination simulée dans du DMEM contenant 1% de BSA à la monocouche, et incuber la cellule à 4 °C pendant 2 h.
5. Retirez le surnageant cellulaire et lavez la plaque de culture cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA.
6. Ajouter du DMEM frais aux cellules et incuber pendant 60 h dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ .
7. Mesurer l’activité relative de la luciférase (RLA) des cellules comme décrit aux étapes 3.7-3.12.
   NOTE: L’entrée virale, telle qu’indiquée par RLA, a été exprimée en pourcentage de la lecture obtenue en l’absence de sérum, qui a été fixée à 100%.

Résultats

Expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus de la grippe
Pour déterminer l’efficacité de l’emballage viral, les stocks de pseudovirus grippaux ont d’abord été détectés par le test HA (figure 2A). Les unités d’HA par millilitre de pseudovirus de la grippe sont de 643 (tableau 3). Le test Western blot et les tests ELISA sandwich ont été utilisés pour tester l’expression des protéines p24 HA, NA et VIH-1. Ensuite, les ra...

Discussion

HEK293FT cellules sont généralement utilisées comme cellules d’emballage pour produire des pseudovirus. Une détection régulière des mycoplasmes est essentielle lors de la culture cellulaire. La contamination par les mycoplasmes peut diminuer considérablement les rendements de pseudovirus et parfois proche de zéro. Par rapport à d’autres contaminations, les contaminations par mycoplasmes n’entraînent pas de changements de la valeur du pH ou de turbidité du milieu de culture cellulaire. Même une forte con...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Chiken Erythrocyte	Bio-channel	BC-RBC-C001	Reagent
96-well cell culture plates (flat-bottom)	Thermo fisher scientific	167008	consumable material
96-well cell culture plates (round-bottom)	Thermo fisher scientific	163320	consumable material
Allegra X-15R	Beckman coulter	--	Equipment/Centrifuge
BD Insulin Syringes	BD	324910	consumable material
Calcium Chloride Anhydrous	AMRESCO	1B1110-500G	Reagent
chloroquine diphosphate	Selleck	S4157	Reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12100-046	Reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-044	Reagent
HEK293FT	Gibco	R700-07	Cell line
HEPES FREE ACID	AMRESCO	0511-250G	Reagent
HIV-1 p24 Antigen ELISA	ZeptoMetrix	801111	Reagent kit
Luciferase Assay System Freezer Pack	Promega	E4530	Reagent kit
MDCK.1	ATCC	CRL-2935	Cell line
Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo fisher scientific	509-GRD-Q	consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL	Thermo fisher scientific	339650	consumable material
Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL	Thermo fisher scientific	339652	consumable material
Nunc EasYFlask 75 cm2	Thermo fisher scientific	156499	consumable material
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Reagent
Pipette Tips (10 μL)	Thermo fisher scientific	TF102-10-Q	consumable material
Pipette Tips (100 μL)	Thermo fisher scientific	TF113-100-Q	consumable material
Pipette Tips (1000 μL)	Thermo fisher scientific	TF112-1000-Q	consumable material
Serological pipets (5 mL)	Thermo fisher scientific	170355N	consumable material
Serological pipets (10 mL)	Thermo fisher scientific	170356N	consumable material
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Reagent
Varioskan Flash	Thermo fisher scientific	--	Equipment/Microplate reader
Water Jacket Incubator	Thermo fisher scientific	3111	Equipment/Cell incubator
Pentobarbital sodium salt	Sigma	57-33-0	Reagent