הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

Summary

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג'ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

Abstract

ישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו עבור וירוסים plaquing, כולל הפניות בתוך הספרות הראשית למתודולוגיה. עם זאת, וירוסים plaquing יכול להיות קשה לביצוע, הדורשים התמקדות מפרטים שלה עידון. זוהי שיטה מאתגרת להפליא עבור תלמידים חדשים לשלוט, בעיקר משום שהיא דורשת תשומת לב קפדנית לפרטים הקטנים ביותר. הדגמה זו של וירוסים הרפס סימפלקס plaquing צריך לעזור לאלה שנאבקו עם לדמיין את השיטה, במיוחד הניואנסים שלה, לאורך השנים. בעוד שכתב יד זה מבוסס על אותם עקרונות של מתודולוגיית הפלקה הסטנדרטית, הוא שונה בכך שהוא מכיל תיאור מפורט של (1) כיצד לטפל בצורה הטובה ביותר בתאים מארחים כדי למנוע הפרעה במהלך התהליך, (2) מדיום צמיג שימושי יותר מאשר אגרוז כדי להגביל את פיזור הוויריונים, ו - (3) הליך קיבעון והכתמה פשוט המייצר תוצאות ניתנות לשחזור אמינות. יתר על כן, הסרטון המצורף מסייע להדגים את ההבחנות העדינות בתהליך, אשר לעתים קרובות חסרים כאשר מנחים אחרים על ביצוע בדיקות פלאק.

Introduction

ראשיתם של בדיקות פלאק וירוס לחזור לתגליות הראשונות של וירוסים בשנות ה -18901. נגיף פסיפס הטבק היה מבודד לראשונה והועבר על עלי טבק, שם ניתן לזהות ולכמת כתמי זיהום בודדים שמקורם בישות וירוס חיה ^אחת2, שזוהתה מאוחר יותר כ- ^virion2. מחקרים ראשוניים מאוחרים יותר עם חיידקים ובקטריופאג'ים שיכללו את הטכניקות המשמשות לפלייק של וירוסים אלה, כולל חיידקים בשלב אמצע היומן של הצמיחה, דילול סדרתי של דגימות בקטריופאג ', ואגר העליון עם הדמיה מאוחרת יותר של חורים מילוליים (הנקראים פלאקים) במדשאה ^{החיידקית3}.

הפלקה של וירוסים מן החי פיגרה במחקר המרגש שנערך עם בקטריופאג'ים, בעיקר משום שהשיטות הנדרשות לגידול תאי יונקים בתרבית לא פותחו עד שנות ה-40 של ^{המאה ה-20}. עם זאת, הופעתם של תאי מורין גדלים בהיעדר האורגניזם המארח ^כולו4 הולידה עידן חדש ביכולת לתרבות ולספור וירוסים. עבודה זו הורחבה עבור התפשטות וכמות של וירוס אנצפלומליטיס סוס מערבי בתאי עוף ופוליו וירוס בתאים ^{אנושיים5,6}. ככל שתחום תאי היונקים הפולחניים התרחב, החבורה של תאים מארחים שונים לזיהומים ויראליים שונים העניקה לעולם שפע של אפשרויות לחקור כל מיני ^{וירוסים7}. זה כלל את ההתפשטות והכימות של הרפס-וירוסים אנושיים, במיוחד וירוס הרפס סימפלקס-1 (HSV-1) ו -2 (HSV-2), הגורמים נגעים mucocutaneous8. חשוב לציין, כל בדיקות הפלאק תלויות בקיומם של נגיפים חיים, שיכולים להיכנס לתאים מארחים באופן בתיווך קולטן ^במדגם9. ללא קשר בכל מקום ושפע של פרסומים על ביצוע בדיקות פלאק5,10,11,11,12,13,14,15,16, שיטות אלה עבור HSV-1/-2 הן תערובת של אמנות ומדע; אי אפשר לנהל את הבדיקה ללא תשומת לב ראויה לכל פרט בפרוטוקול, וגם לא ניתן לבצע בדיקה מוצלחת ללא עין קרטית לעידון בתהליך. כתב יד זה מתאר את אחת השיטות הניתנות לשחזור באופן עקבי ביותר עבור בדיקות פלאק HSV-1/-2, עם פרטים מדויקים כלפי אמנות הבדיקה שנדונים לעתים רחוקות.

פרוטוקול נוכחי זה מקבל ספירות יחידות יוצרות פלאק חי (PFU) עבור HSV-1 ו- -2 באופן אמין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות באמצעות תאי Vero (תאי אפיתל כליות קוף ירוק אפריקאי שעברו טרנספורמציה) במעבר נמוך (מתחת למעבר מספר 155) וגדלים באופן שגרתי באלפא-MEM17 בתוספת סרום עגל עוברי 10% (FCS), L-אלניל-L-גלוטמין, ותערובת אנטיביוטית/אנטי-מיקרוטית18. תאי Vero מופצים באופן סטנדרטי במדיום זה פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע בדילול של ¹/₅ בכל פעם.

Protocol

כל ההליכים עם תאי Vero והרפסוירוסים חיים אושרו על ידי ועדת הביו-בטיחות המוסדית של אוניברסיטת טוסון. ערכה כללית של הליכים אלה מיוצגת באיור 1.

1. זריעת תאי Vero

1. יום לפני תחילת בדיקת הפלאק, טריפסינציה תאי Vero resuspened אותם רגילים של Dulbecco שונה נשרים בינוני (DMEM) ולהשלים לפי מתודולוגיית תרבית התא ^{הסטנדרטית19}. הגדילו מחדש את התאים הטריפסיניים ב-10 מ"ל של DMEM לכל בקבוק T-75 של תאי Vero המתנגשים (כ-107 תאים).
   הערה: DMEM משמש לבדיקות פלאק במקום אלפא-MEM מכיוון שהוא מאט מעט את קצב צמיחת התא ומעדיף תוצאות בדיקת פלאק טובות יותר.
2. ספור את התאים לפי השיטה המועדפת על האדם (לדוגמה, המוציטומטר סטנדרטי עם אי-הכללה של טריפאן בלו)¹⁹.
3. זרע את התאים ב 4 x ¹⁰⁶ תאים / צלחת; עבור HSV-2, להשתמש 6-well צלחות עם 2.5 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר; ועבור HSV-1, השתמש צלחות 12-well עם 1.25 מ"ל של DMEM (עם תוספי מזון) לבאר.
   הערה: מספר התאים צריך להיות קבוע ללא קשר ללוח המשמש, אם כי גודל הבארות חשוב לגבי דיוק בבדיקת הפלאק. זה חיוני כדי לקבל תאים מופצים באופן שווה, אשר ניתן להשיג בצורה היעילה ביותר על ידי הזזת הצלחת קדימה ואחורה, לא בצורה מעגלית.
4. אפשר לתאים לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 °C /5% _CO2 באינקובטור לח.
   הערה: הלחות נשמרת עם מחבת של מים מזוקקים המכילים קוטל בתחתית האינקובטור.

2. דילול מדגם

1. להשלים את דילול המדגם ואת התוספת של וירוס לתאים במושב מעבדה אחד.
   זהירות: HSV-1 ו-2 מדבקים לבני אדם ויש לטפל בהם תחת בלימה בטיחות ביולוגית נאותה (BSL-2). יש להפריד את כל החומרים שבאים במגע עם הנגיף ולחטא עם סוכן רבעוני בדילול של 1/256 (ראו טבלת חומרים), יודופר, אקונומיקה או חומר ניקוי יוני חזק (למשל, SDS) לפני הסרתם מארון הבטיחות הביולוגית.
2. יום לאחר זריעת תאי Vero, לדלל באופן סדרתי כל דגימת וירוס להיות פלאק ב 1x PBS; בדרך כלל משתמשים בדילולים של פי 10 למעקב המדויק ביותר.
3. הפוך את הדילולים האלה דרך ^10-4 (לריכוזים נמוכים של וירוסים) או דרך ^10-9 (לציפיות של דגימות טיטר גבוהות יותר) עם לפחות 1 מ"ל של כל מדגם שנותר לבדיקת הפלאק עצמה.
4. שמור את כל הדילול הנגיפי על הקרח (לא יותר מ 1 שעות) עד מוכן להוסיף דגימות וירוס מדולל אלה לתאים.

3. תוספת של וירוס לתאים

1. הסר את מדיום תרבית התאים מבאר אחת או שתיים על ידי פיפטה.
   הערה: אין להשתמש בשאיפה מכיוון שהיא מסירה יותר מדי נוזלים ממונולייר התאים ומייבשת את התאים. שיקול מכריע אחד הוא להבטיח כי monolayer התא נשאר hydrated לאורך כל מהלך הניסוי. אם התאים יתייבשו, הם ישטפו את הצלחת בשלב האחרון וייצרו נתונים שאינם שמישים. לכן, לעבד רק באר אחת או שתיים בכל פעם כדי להפחית את האפשרות הזאת.
2. בזהירות להוסיף את מדגם וירוס מדולל (100-400 μL ו 50-200 μL של מדגם וירוס משמשים עבור 6-well ו 12-well צלחות, בהתאמה) dropwise לכל monolayer, הוספת הטיפות בצד של כל באר. חזור על התהליך עבור כל באר אחת או שתיים עד הצלחת כולה מתמלאת עם דגימות וירוס להיות פלאק.
   הערה: הוספת הטיפות למרכז הבאר עלולה לשחוק בטעות תאים מהמצע.
3. בעדינות לטלטל את הצלחת כולה ביד כדי להבטיח PBS המכיל את הנגיף מכסה את כל monolayer של תאים בכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת בחממה _CO2 ב 37 °C (50 °F) כדי לאפשר את הנגיף לספוח.
4. כל 10 דקות בתוך 1 שעה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור, בעדינות לטלטל אותו שוב כדי להפיץ את הנגיף באופן שווה יותר על פני כל באר, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה באינקובטור.
   הערה: כל ניסוי יכתיב את מספר השכפולים ואילו דילולים משמשים; העדפת הקורא מכתיבה החלטה זו.
5. כדי להפחית את האפשרות של ספירה בשוגג inoculum unabsorbed, להסיר את דגימת הנגיף מן הבארות עם טיפים 1000 μL פיפטה ומניחים אותו בכוס פסולת.
   הערה: שוב, הליך זה מתנהל עם באר אחת או שתיים בלבד בכל פעם כדי לשמור על הידרציה של monolayer התא.
6. מניחים 2.5 מ"ל של שכבת-על מתיל צלולוז (ממיסים 5% מתיל צלולוז w/w ב-100 מ"ל של PBS, אוטולבה אוטומטית למשך 15 דקות ב-121 °C ו-15 פסאיי על מחזור נוזלי, ולאחר מכן מוסיפים 375 מ"ל של DMEM בתוספת 25 מ"ל של FBS).
7. לאחר צלחת שלמה מכילה כיסוי, מניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור כדי לאפשר צמיחה במשך יומיים.
   הערה: אם הנגיף והתאים מורשים לגדול במשך שלושה ימים, אפילו ב- DMEM בתוספת תוספי מזון, אובדן משמעותי של תאים במונולייר עלול לגרום, ובכך להתפשר על הנתונים הסופיים.
8. לחטא את הפסולת, בדרך כלל עם תוספת של אקונומיקה, יודופר, או וירוקסיד דומה, לפני הסרתו מארון הבטיחות הביולוגית.

4. כתמים ללוחות

1. לאחר הדגירה בת היומיים, הסר את שכבת היתר של מתילצלולוז על ידי פיפטה, שוב באר אחת או שתיים בכל פעם, והניח אותו בכוס פסולת.
2. מוסיפים ~ 2 מ"ל של 1% סגול קריסטל (ראה טבלת חומרים) ב 50% אתנול לכל באר כדי להכתים את הלוחות.
   הערה: אין זה חיוני כדי להסיר כל טיפה אחרונה של הכיסוי.
3. לדגור על הצלחת עם כל הבארות מלאות בכתם במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). בשלב זה, לחטא את הפסולת כנל בשלב 3.8.
4. לשטוף את הצלחות במרץ עם מי ברז עד נגר ברור.
   הערה: זרם עדין של מים אינו נמרץ מספיק; לחץ מלא ממתקן כיור מעבדה נדרש.
5. בשלב זה, ודא שיש הבדלים של פי 10 במספר הלוחות בכל סדרת דילול.
6. אפשר ללוחות להתייבש בן לילה הפוך, ולאחר מכן ניתן לספור את הלוחות הבודדים.

5. ספירת לוחות וקביעת טיטר וירוסים

1. ללא קשר לגישה (ראה הערה להלן), הכפל את מספר הלוחות על ידי גורם הדילול (למשל, אם הלוחות נספרו בבאר ^10-4 , אז מספר הלוחות יוכפל ב -¹⁰⁴).
   הערה: למרות ספירה בתוך טווח של 10-100 לוחות הוא ^{שימושי5}, ספירת בארות עם 30-300 לוחות הוא קצת יותר אמין לוקח בחשבון כ 1/2-log דילול במקום דילול מלא.
2. חלק מספר זה בנפח של inoculum (כמו לעיל בשלב 3.2), וממוצע כל הבארות שיש להם לוחות בתוך הטווח שצוין כדי לקבל את הטיטר המדויק ביותר של HSV במדגם המקורי.
3. בצע את החישובים בשלבים 5.3.1 עד 5.3.5, בהתחשב בשימוש בנתונים מדומים בטבלה 1.
   1. שקול רק בארות עם 30-300 לוחות (שלב 5.1). לפיכך, בטבלה 1, השתמש רק בעמודה ^10-5 עבור שכפולים 1, 2 ו- 3.
   2. קח את מספר הלוחות בדילול הנתון והכפל בהדדיות של גורם הדילול. לפיכך, ^10-5 עמודה של מדגם 1 הולך מ 81 לוחות בדילול ^10-5 ל 81 לוחות כפול ¹⁰⁵.
   3. לאחר מכן חלק את המספר הזה בנפח (ב- mL) של דילול הנגיף שנוסף לתאים בבאר זו. בהנחה שהנתונים על HSV-1 בטבלה 1 הם מלוח של 12 בארות, 0.2 מ"ל תהיה המדידה המתאימה ביותר. מכאן החישוב משלב 5.3.2 הופך 81 x ¹⁰⁵ חלקי 0.2 מ"ל, או 4.0 x ¹⁰⁷ PFU / מ"ל של HSV-1.
   4. חזור על תהליך זה עבור כל הנתונים והממוצעים השימושיים. לפיכך, בצע את החישוב ב 5.3.2-5.3.3 על כל הדגימות בעמודה ^10-5, בהנחה שמקורם באותה דגימת וירוס ואת המשכפלים הביולוגיים נערכו כדי לקבל את מדידת titer המדויקת ביותר. במקרה של טבלה 1, ממוצע 4.0 x 107, 2.1 x ¹⁰⁷, ו 2.6 x ¹⁰⁷ PFU / mL כדי לקבל טיטר ממוצע סופי של 2.9 x ¹⁰⁷ ± 0.98 x ¹⁰⁷ PFU / mL עבור מדגם זה.

תוצאות

טבלה 1 מציגה ניסוי בעל תוצאות מיטביות. כל הדילולים פי 10 באים בעקבות ירידה של פי 10 בספירת הפלאק. נתונים מסוג זה ניתן לראות גם באיור 2, בדיקת פלאק בפועל שבה מספר הלוחות הניתן לספירה נפל בטווח של ^10-4 עבור כל שלושת המשכפלים. אותו הדבר ניתן לראות באיור 3

Discussion

בעוד שבדיקות פלאק ישנות כמעט כמו תרבות התאים של היונקים עצמה, נראה שלכל מעבדה יש מערכת פרוטוקולים משלה לביצוע בדיקה בסיסית זו5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81