단순 포진 바이러스의 플라쿼싱

요약

Plaquing은 집단에서 살아있는 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 일상적인 방법입니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 다양한 미생물학 커리큘럼에서 플라킹이 자주 가르쳐지지만, 포유류 바이러스의 플라킹은 더 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 단순 포진 바이러스와의 정기적 인 작업을 위해 안정적으로 기능하는 절차를 설명합니다.

초록

방법론에 대한 기본 문헌 내의 참고 문헌을 포함하여 바이러스를 플라킹하기위한 수많은 출판 된 프로토콜이 있습니다. 그러나 플라킹 바이러스는 수행하기가 어려울 수 있으므로 사양과 개선에 중점을 두어야합니다. 신입생이 마스터하는 것은 매우 어려운 방법이며, 주로 가장 세심한주의를 기울여야하기 때문입니다. 단순 포진 바이러스를 괴롭히는 이러한 시연은 수년에 걸쳐이 방법, 특히 뉘앙스를 시각화하는 데 어려움을 겪은 사람들을 도울 것입니다. 이 원고는 표준 플라킹 방법론의 동일한 원칙에 기초하지만, (1) 공정 중 파괴를 피하기 위해 숙주 세포를 가장 잘 다루는 방법, (2) 비리온의 확산을 제한하기 위해 아가로스보다 더 유용한 점성 배지, (3) 신뢰할 수 있게 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차에 대한 자세한 설명을 포함하고 있다는 점에서 다릅니다. 또한, 첨부 된 비디오는 플라크 분석을 수행하는 다른 사람들에게 지시 할 때 자주 놓치는 과정에서 더 미세한 구별을 입증하는 데 도움이됩니다.

서문

바이러스 플라크 분석의 시작은 1890 년대 바이러스의 첫 번째 발견으로 돌아갑니다¹. 담배 모자이크 바이러스는 먼저 분리되어 담배 잎에 전달되었으며, 개별 감염 지점은 단일 살아있는 바이러스 엔티티²에서 유래 한 것으로 인식되고 정량화 될 수 있었으며 나중에 ^virion2로 확인되었습니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 이후의 정액 연구는 성장의 중간 로그 단계의 박테리아, 박테리오파지 샘플의 연속 희석 및 박테리아 잔디밭의 문자 그대로의 구멍 (플라크로 명명 됨)의 후속 시각화를 통한 상단 한천을 포함하여 이러한 바이러스를 플라크하는 데 사용되는 기술을 완성했습니다³.

동물 바이러스의 플라쿼싱은 박테리오파지와 함께 수행되고 있는 흥미로운 연구가 지연되었는데, 그 이유는 주로 배양에서 포유동물 세포를 성장시키는 데 필요한 방법이 1940년대까지 개발되지 않았기 때문이다⁴. 그러나, 전체 숙주 유기체의 부재 하에 성장하는 뮤린 세포의 출현4은 바이러스를 배양하고 계수하는 능력^의 새로운 시....

프로토콜

Vero 세포 및 살아있는 헤르페스 바이러스에 대한 모든 절차는 Towson University Institutional Biosafety Committee의 승인을 받았습니다. 이러한 절차의 일반화된 체계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 베로 세포의 시딩

1. 플라크 분석을 시작하기 전날, 베로 세포를 트립신화하고 일반 둘베코의 변형 이글스 배지 (DMEM)에 재현탁시키고 표준 세포 배양 방법론에 따라 보충하십시오¹⁹. 트립신화된 세포를 컨플루언트 베로 세포(∼107 ^세포) 의 T-75 플라스크 당 10 mL의 DMEM에 재현탁시킨다.
   참고: DMEM은 세포 성장 속도를 약간 늦추고 더 나은 플라크 분석 결과를 선호하기 때문에 알파-MEM 대신 플라크 분석에 사용됩니다.
2. 선호하는 방법 (예를 들어, 트리판 블루 배제를 갖는 표준 혈구측정기)에 의해 세포를 계수한다¹⁹.
3. 세포를 4 x ¹⁰⁶ 세포 / 플레이트에 시드하십시오. HSV-2의 경우 웰 당 2.5mL의 DMEM (보충제 포....

결과

표 1은 최적의 결과를 갖는 실험을 나타낸다. 모든 10배 희석은 플라크 수의 약 10배 감소를 따릅니다. 이러한 종류의 데이터는 세 번의 반복실험 모두에 대해 셀 수 있는 플라크 수가 ^10-4 범위에 속하는 실제 플라크 분석인 그림 2에서도 볼 수 있습니다. 도 3에서도 동일하게 볼 수 있는데, 여기서 셀 수 있는 수의 플라크는 ^10-3

토론

플라크 분석은 포유류 세포 배양 자체만큼이나 오래되었지만, 각 실험실에는 이 기본 분석을 실행하기 위한 자체 프로토콜 세트가 있는 것으로 보입니다5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81