단순 포진 바이러스의 플라쿼싱

요약

Plaquing은 집단에서 살아있는 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 일상적인 방법입니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 다양한 미생물학 커리큘럼에서 플라킹이 자주 가르쳐지지만, 포유류 바이러스의 플라킹은 더 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 단순 포진 바이러스와의 정기적 인 작업을 위해 안정적으로 기능하는 절차를 설명합니다.

초록

방법론에 대한 기본 문헌 내의 참고 문헌을 포함하여 바이러스를 플라킹하기위한 수많은 출판 된 프로토콜이 있습니다. 그러나 플라킹 바이러스는 수행하기가 어려울 수 있으므로 사양과 개선에 중점을 두어야합니다. 신입생이 마스터하는 것은 매우 어려운 방법이며, 주로 가장 세심한주의를 기울여야하기 때문입니다. 단순 포진 바이러스를 괴롭히는 이러한 시연은 수년에 걸쳐이 방법, 특히 뉘앙스를 시각화하는 데 어려움을 겪은 사람들을 도울 것입니다. 이 원고는 표준 플라킹 방법론의 동일한 원칙에 기초하지만, (1) 공정 중 파괴를 피하기 위해 숙주 세포를 가장 잘 다루는 방법, (2) 비리온의 확산을 제한하기 위해 아가로스보다 더 유용한 점성 배지, (3) 신뢰할 수 있게 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차에 대한 자세한 설명을 포함하고 있다는 점에서 다릅니다. 또한, 첨부 된 비디오는 플라크 분석을 수행하는 다른 사람들에게 지시 할 때 자주 놓치는 과정에서 더 미세한 구별을 입증하는 데 도움이됩니다.

서문

바이러스 플라크 분석의 시작은 1890 년대 바이러스의 첫 번째 발견으로 돌아갑니다¹. 담배 모자이크 바이러스는 먼저 분리되어 담배 잎에 전달되었으며, 개별 감염 지점은 단일 살아있는 바이러스 엔티티²에서 유래 한 것으로 인식되고 정량화 될 수 있었으며 나중에 ^virion2로 확인되었습니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 이후의 정액 연구는 성장의 중간 로그 단계의 박테리아, 박테리오파지 샘플의 연속 희석 및 박테리아 잔디밭의 문자 그대로의 구멍 (플라크로 명명 됨)의 후속 시각화를 통한 상단 한천을 포함하여 이러한 바이러스를 플라크하는 데 사용되는 기술을 완성했습니다³.

동물 바이러스의 플라쿼싱은 박테리오파지와 함께 수행되고 있는 흥미로운 연구가 지연되었는데, 그 이유는 주로 배양에서 포유동물 세포를 성장시키는 데 필요한 방법이 1940년대까지 개발되지 않았기 때문이다⁴. 그러나, 전체 숙주 유기체의 부재 하에 성장하는 뮤린 세포의 출현4은 바이러스를 배양하고 계수하는 능력^의 새로운 시대를 열었다. 이러한 작업은 닭 세포에서 웨스턴 에퀸 뇌척수염 바이러스의 증식 및 정량화와 인간 세포에서의 폴리오바이러스^5,6 동안 확장되었다. 배양 가능한 포유류 세포의 영역이 확장됨에 따라, 다양한 바이러스 감염에 대한 다양한 숙주 세포의 bevy는 모든 종류의 바이러스를 연구 할 수있는 가능성의 각막⁷을 세계에 주었다. 여기에는 인간 헤르페스바이러스, 특히 점막 피부 병변을 일으키는 단순 헤르페스 바이러스-1(HSV-1) 및 -2(HSV-2)의 전파 및 정량화가 포함되었다⁸. 중요하게도, 모든 플라크 검정은 살아있는 비리온의 존재에 의존하며, 이는 샘플⁹에서 수용체-매개된 방식으로 숙주 세포에 진입할 수 있다. 플라크 분석의 실행에 관한 편재성과 다수의 간행물에 관계없이5,10,11,12,13,14,15,16^, HSV-1/-2^에 대한 이러한 방법은 예술과 과학의 혼합물이다; 프로토콜의 모든 세부 사항에 적절한주의를 기울이지 않고 분석을 수행 할 수 없으며 프로세스의 미묘함에 대한 비판적 인 눈없이 성공적인 분석을 수행 할 수도 없습니다. 이 원고는 HSV-1/-2 플라크 분석을위한 가장 일관되게 재현 가능한 방법 중 하나를 묘사하며, 거의 논의되지 않는 분석의 기술에 대한 정확한 세부 사항을 보여줍니다.

이 현재 프로토콜은 HSV-1 및 -2에 대한 살아있는 플라크 형성 단위 (PFU) 카운트를 안정적으로 얻습니다. 가장 좋은 결과는 낮은 계대 (통과 번호 155 이하)에서 Vero 세포 (형질전환 된 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포)를 사용하고 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), L-알라닐-L-글루타민 및 항생제 / 항균제 혼합물로 보충 된 알파 ^MEM17에서 일상적으로 성장합니다¹⁸. 베로 세포는 표준적으로 이 배지에서 매주 두세 번 ¹/₅ 희석으로 전파된다.

프로토콜

Vero 세포 및 살아있는 헤르페스 바이러스에 대한 모든 절차는 Towson University Institutional Biosafety Committee의 승인을 받았습니다. 이러한 절차의 일반화된 체계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 베로 세포의 시딩

1. 플라크 분석을 시작하기 전날, 베로 세포를 트립신화하고 일반 둘베코의 변형 이글스 배지 (DMEM)에 재현탁시키고 표준 세포 배양 방법론에 따라 보충하십시오¹⁹. 트립신화된 세포를 컨플루언트 베로 세포(∼107 ^세포) 의 T-75 플라스크 당 10 mL의 DMEM에 재현탁시킨다.
   참고: DMEM은 세포 성장 속도를 약간 늦추고 더 나은 플라크 분석 결과를 선호하기 때문에 알파-MEM 대신 플라크 분석에 사용됩니다.
2. 선호하는 방법 (예를 들어, 트리판 블루 배제를 갖는 표준 혈구측정기)에 의해 세포를 계수한다¹⁹.
3. 세포를 4 x ¹⁰⁶ 세포 / 플레이트에 시드하십시오. HSV-2의 경우 웰 당 2.5mL의 DMEM (보충제 포함)이있는 6 웰 플레이트를 사용하십시오. HSV-1의 경우 웰 당 1.25mL의 DMEM (보충제 포함)이있는 12 웰 플레이트를 사용하십시오.
   참고 : 세포의 수는 사용 된 플레이트에 관계없이 일정해야하지만 웰의 크기는 플라크 분석의 정확성과 관련하여 중요합니다. 세포를 고르게 분포시키는 것이 필수적이며, 이는 원형 방식이 아닌 판을 앞뒤로 움직여 가장 효과적으로 수행 할 수 있습니다.
4. 세포가 가습된 인큐베이터에서 37°C/5% _CO2 에서 하룻밤 동안 성장하도록 허용하십시오.
   참고 : 습도는 인큐베이터 바닥에 살지제가 들어있는 증류수 팬으로 유지됩니다.

2. 샘플 희석

1. 샘플 희석을 완료하고 한 실험실 세션에서 세포에 바이러스를 첨가하십시오.
   주의: HSV-1 및 -2는 인체에 전염성이 있으며 적절한 생물안전 봉쇄(BSL-2)에 따라 취급해야 합니다. 바이러스와 접촉하는 모든 물질을 분리하여 보관하고 생물안전 캐비닛에서 제거하기 전에 1/256 희석액( 표 참조), 요오도포어, 표백제 또는 강한 이온성 세제(예: SDS)에서 4차 약제로 소독하십시오.
2. 베로 세포를 시딩한 다음날, 각 바이러스 샘플을 연속적으로 희석하여 1x PBS로 플라크화하고; 일반적으로 가장 정확한 추적을 위해 10배 희석을 사용합니다.
3. 이러한 희석액을 10-4 (낮은 농도의 바이러스의 경우) 또는 ^10-9 (더 높은 역가 샘플의 기대를 위해)를 통해 플라크 분석 자체를 위해 남아있는 각 샘플의 최소 1 mL를 확인하십시오.
4. 이러한 희석된 바이러스 샘플을 세포에 첨가할 준비가 될 때까지 모든 바이러스 희석액을 얼음 위에 보관하십시오(1시간 이하).

3. 세포에 바이러스의 추가

1. 피펫으로 하나 또는 두 개의 웰로부터 세포 배양 배지를 제거한다.
   참고: 흡입기는 세포 단층에서 너무 많은 액체를 제거하고 세포를 건조시키기 때문에 사용하지 마십시오. 한 가지 중요한 고려 사항은 세포 단일층이 실험의 전체 과정에 걸쳐 수화 상태를 유지하도록하는 것입니다. 세포가 말라 버리면 마지막 단계에서 접시를 씻어 내고 사용할 수없는 데이터를 생성합니다. 따라서 이러한 가능성을 줄이기 위해 한 번에 하나 또는 두 개의 웰만 처리하십시오.
2. 희석된 바이러스 샘플(각각 6-웰 및 12-웰 플레이트에 사용되는 바이러스 샘플 100-400 μL 및 50-200 μL)을 각 단층에 적하하고, 각 웰의 측면 아래로 방울을 첨가한다. 전체 플레이트가 플라크되는 바이러스 샘플로 채워질 때까지 하나 또는 두 개의 웰마다 이 과정을 반복하십시오.
   참고: 방울을 우물 중앙에 추가하면 실수로 세포가 기질에서 떨어져 나갈 수 있습니다.
3. 바이러스가 포함된 PBS가 각 웰에서 세포의 전체 단층을 덮을 수 있도록 플레이트 전체를 손으로 부드럽게 흔든 다음, 플레이트를 37°C의 _CO2 인큐베이터에 두어 바이러스가 흡착되도록 한다.
4. 1 시간 이내에 10 분마다 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 부드럽게 다시 흔들어서 각 웰에 바이러스를 더 고르게 퍼뜨린 다음 인큐베이터에 다시 놓습니다.
   참고: 각 실험은 반복실험 횟수와 사용되는 희석액을 결정합니다. 독자의 선호는 그 결정을 지시합니다.
5. 실수로 흡수되지 않은 접종물을 세는 가능성을 줄이려면 1000 μL 피펫 팁으로 웰에서 바이러스 샘플을 제거하고 폐기물 비커에 넣으십시오.
   참고: 다시 말하지만, 이 절차는 세포 단일층의 수화를 유지하기 위해 한 번에 하나 또는 두 개의 웰로만 수행됩니다.
6. 2.5 mL의 메틸셀룰로스 오버레이를 놓는다(PBS 100 mL에 5% 메틸셀룰로스 w/w를 용해시키고, 액체 사이클에 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 액체 사이클에 15 psi 동안 오토클레이브한 다음, DMEM 375 mL와 FBS 25 mL를 첨가한다).
7. 전체 플레이트에 오버레이가 포함되면 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣어 이틀 동안 성장시킵니다.
   참고 : 바이러스와 세포가 DMEM 플러스 보충제에서도 사흘 동안 성장할 수 있다면 단층에서 세포가 크게 손실되어 최종 데이터가 손상 될 수 있습니다.
8. 폐기물 비이커를 소독하십시오, 일반적으로 표백제, 요오도포어 또는 유사한 virucide를 첨가하여 생물 안전 캐비닛에서 제거하십시오.

4. 플라크에 대한 염색

1. 이틀 인큐베이션 후, 피펫에 의해 메틸셀룰로스 오버레이를 제거하고, 한 번에 하나 또는 두 개의 웰을 다시 제거하고, 이를 폐기물 비이커에 놓는다.
2. 각 웰에 50% 에탄올에 1% 크리스탈 바이올렛( 물질표 참조) 2mL를 첨가하여 플라크를 염색한다.
   참고: 오버레이의 마지막 한 방울을 모두 제거할 필요는 없습니다.
3. 염색으로 채워진 모든 웰로 플레이트를 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 시점에서, 단계 3.8에서 위와 같이 폐기물 비이커를 소독한다.
4. 유출이 맑을 때까지 수돗물로 접시를 격렬하게 씻으십시오.
   참고 : 부드러운 물줄기는 충분히 활발하지 않습니다. 실험실 싱크대 설비의 최대 압력이 필요합니다.
5. 이 시점에서, 각 희석 시리즈에 걸친 플라크의 수에 대략 10배 차이가 있는지 확인하십시오.
6. 플레이트를 하룻밤 동안 거꾸로 말리고 그 후에 개별 플라크를 계산할 수 있습니다.

5. 플라크 계산 및 바이러스 역가 결정

1. 접근법에 관계없이(아래 참고 참조), 플라크의 수에 희석 계수를 곱한다(예를 들어, 플라크가 ^10-4 웰에서 계수된다면, 플라크의 수는 ¹⁰⁴를 곱할 것이다).
   참고: 10-100개의 플라크 범위 내에서 계수하는 것이 유용하지만⁵, 30-300개의 플라크로 웰을 세는 것이 다소 더 신뢰할 수 있으며 전체 로그 희석 대신 약 1/2 로그 희석을 고려합니다.
2. 이 숫자를 접종물의 부피로 나누고(단계 3.2에서 위와 같이), 명시된 범위 내에 플라크가 있는 모든 웰을 평균하여 원래 샘플에서 HSV의 가장 정확한 역가를 얻는다.
3. 표 1의 모의 데이터 사용을 고려하여 5.3.1 ~ 5.3.5단계에서 계산을 수행합니다.
   1. 30-300 개의 플라크가있는 우물 만 고려하십시오 (5.1 단계). 따라서 표 1에서는 반복실험 1, 2 및 3에 대해 ^10-5 열만 사용합니다.
   2. 주어진 희석에서 플라크의 수를 취하여 희석 계수의 역수로 곱하십시오. 따라서, 샘플 1의 10-5 컬럼은 ^10-5 희석에서 81 플라크에서 81 플라크 배 ¹⁰⁵로 이동합니다.
   3. 그 다음 그 수를 그 웰 내의 세포에 첨가된 바이러스 희석액의 부피(mL 단위)로 나눈다. 표 1의 HSV-1에 대한 데이터가 12 -웰 플레이트로부터의 것이라고 가정하면, 0.2 mL가 가장 적절한 측정일 것이다. 따라서 5.3.2 단계의 계산은 81 x ¹⁰⁵ 를 0.2 mL로 나눈 값 또는 HSV-1의 4.0 x ¹⁰⁷ PFU / mL가됩니다.
   4. 모든 유용한 데이터와 평균에 대해이 프로세스를 반복하십시오. 따라서 10-5 컬럼의 모든 샘플에 대해 5.3.2-5.3.3으로 계산을 수행하고, 동일한 바이러스 샘플에서 유래했다고 가정하고 생물학적 반복실험을 수행하여 가장 정확한 역가 측정을 얻었다. 표 1의 경우에, 평균 4.0 x 107, 2.1 x 107, 및 2.6 x 107 PFU/mL의 최종 평균 역가는 이 샘플에 대해 2.9 x 107 ± 0.98 x ¹⁰⁷ PFU/mL를 얻었다.

결과

표 1은 최적의 결과를 갖는 실험을 나타낸다. 모든 10배 희석은 플라크 수의 약 10배 감소를 따릅니다. 이러한 종류의 데이터는 세 번의 반복실험 모두에 대해 셀 수 있는 플라크 수가 ^10-4 범위에 속하는 실제 플라크 분석인 그림 2에서도 볼 수 있습니다. 도 3에서도 동일하게 볼 수 있는데, 여기서 셀 수 있는 수의 플라크는 ^10-3

토론

플라크 분석은 포유류 세포 배양 자체만큼이나 오래되었지만, 각 실험실에는 이 기본 분석을 실행하기 위한 자체 프로토콜 세트가 있는 것으로 보입니다5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81