Заторможенность вирусов простого герпеса

Резюме

Plaquing - это обычный метод, используемый для количественной оценки живых вирусов в популяции. Хотя плакуирование часто преподается в различных учебных программах по микробиологии с бактериями и бактериофагами, плакуирование вирусов млекопитающих является более сложным и трудоемким. Этот протокол описывает процедуры, которые надежно функционируют для регулярной работы с вирусами простого герпеса.

Аннотация

Существует множество опубликованных протоколов для успокаивания вирусов, включая ссылки в первичной литературе по методологии. Тем не менее, заражение вирусами может быть трудным для выполнения, требуя сосредоточения внимания на его спецификациях и уточнении. Это невероятно сложный метод для новых студентов, главным образом потому, что он требует тщательного внимания к самым мелким деталям. Эта демонстрация заторможенных вирусов простого герпеса должна помочь тем, кто на протяжении многих лет боролся с визуализацией метода, особенно его нюансов. Хотя эта рукопись основана на тех же принципах стандартной методологии упрочнения, она отличается тем, что содержит подробное описание (1) того, как лучше всего обрабатывать клетки-хозяева, чтобы избежать нарушения во время процесса, (2) более полезную вязкую среду, чем агароза, для ограничения диффузии вирионов и (3) простую процедуру фиксации и окрашивания, которая дает надежно воспроизводимые результаты. Кроме того, сопроводительное видео помогает продемонстрировать более тонкие различия в процессе, которые часто упускаются из виду при инструктаже других о проведении анализов бляшек.

Введение

Начало анализов вирусных бляшек восходит к первым открытиям вирусов в 1890-х ^годах1. Вирус табачной мозаики сначала был выделен и передан на листьях табака, где отдельные пятна инфекции могли быть распознаны и количественно определены как происходящие от одного живого вирусного ^{образования2}, позже идентифицированного как вирион2. Более поздние семенные исследования с бактериями и бактериофагами усовершенствовали методы, используемые для бляшек этих вирусов, включая бактерии в середине фазы роста, последовательное разбавление образцов бактериофагов и верхний агар с последующей визуализацией буквальных отверстий (называемых бляшками) в бактериальном ^{газоне3}.

Размещение вирусов животных отставало от захватывающих исследований, проводимых с бактериофагами, главным образом потому, что методы, необходимые для выращивания клеток млекопитающих в культуре, не были разработаны до 1940-х годов. Однако появление растущих мышиных клеток в отсутствие всего организма-хозяина4 породило новую эру в способности культивировать и подсчитывать вирусы. Такая работа была расширена для распространения и количественного определения вируса энцефаломиелита западных лошадей в клетках кур и полиовируса в клетках ^{человека5,6}. По мере того, как область культивируемых клеток млекопитающих расширялась, множество различных клеток-хозяев для различных вирусных инфекций дало миру рог изобилия возможностей для изучения всевозможных ^{вирусов7}. Это включало распространение и количественную оценку вирусов герпеса человека, особенно вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) и -2 (ВПГ-2), которые вызывают поражения слизистой ^{оболочки8}. Важно отметить, что все анализы бляшек зависят от существования живых вирионов, которые могут проникать в клетки-хозяева рецепторно-опосредованным образом в ^{образце9}. Несмотря на повсеместное распространение и множество публикаций по выполнению анализов бляшек5,10,11,12,13,14,15,16, эти методы для ВПГ-1/-2 представляют собой смесь как искусства, так и науки; невозможно провести анализ без должного внимания к каждой детали протокола, равно как и нельзя выполнить успешный анализ без критического взгляда на тонкость в процессе. В этой рукописи изображен один из наиболее последовательно воспроизводимых методов анализа Бляшек ВПГ-1/-2 с точными деталями искусства анализа, которые редко обсуждаются.

Этот текущий протокол надежно получает количество живых бляшек (PFU) для ВПГ-1 и -2. Наилучшие результаты получены с использованием клеток Vero (трансформированных эпителиальных клеток почек африканской зеленой обезьяны) при низком пассаже (ниже числа пассажа 155) и обычно выращиваются в ^{альфа-MEM17} с добавлением 10% сыворотки плодного теленка (FCS), L-аланил-L-глутамина и смеси антибиотика / антимикотики18. Клетки Веро стандартно размножаются в этой среде два-три раза в неделю в ¹/₅ разведения каждый раз.

протокол

Все процедуры с клетками Vero и живыми герпесвирусами были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Тоусона. Обобщенная схема этих процедур представлена на рисунке 1.

1. Посев клеток Vero

1. За день до начала анализа бляшек попробуйте клетки Vero и повторно суспендируйте их в обычной модифицированной среде Dulbecco Eagles Medium (DMEM) и добавьте в соответствии со стандартной методологией клеточной ^{культуры19}. Повторное суспендирование трипсинизированных клеток в 10 мл DMEM на колбу Т-75 сливающихся клеток Vero (~¹⁰⁷ клеток).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM используется для анализа бляшек вместо альфа-MEM, потому что он немного замедляет скорость роста клеток и способствует лучшим результатам анализа бляшек.
2. Подсчитывайте клетки предпочтительным методом (например, стандартным гемоцитометром с исключением Trypan Blue)¹⁹.
3. Засейте клетки на 4 x ¹⁰⁶ клеток / пластину; для ВПГ-2 использовать 6-луночные плиты с 2,5 мл ДМЭМ (с добавками) на скважину; а для ВПГ-1 использовать плиты из 12 скважин с 1,25 мл ДМЭМ (с добавками) на скважину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек должно быть постоянным независимо от используемой пластины, хотя размер скважин имеет значение для точности анализа бляшек. Важно, чтобы клетки были равномерно распределены, что может быть наиболее эффективно достигнуто путем перемещения пластины вперед и назад, а не по кругу.
4. Дайте клеткам расти в течение ночи при 37 °C / 5% _CO2 в увлажненном инкубаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Влажность поддерживается с помощью кастрюли с дистиллированной водой, содержащей альгицид в нижней части инкубатора.

2. Разбавление пробы

1. Завершите разбавление образца и добавление вируса к клеткам за один лабораторный сеанс.
   ВНИМАНИЕ: ВПГ-1 и -2 являются инфекционными для человека и должны обрабатываться при надлежащем сдерживании биобезопасности (BSL-2). Храните все материалы, которые вступают в контакт с вирусом, отдельно и дезинфицируйте четвертичным агентом в разведении 1/256 (см. Таблицу материалов), йодофор, отбеливатель или сильное ионное моющее средство (например, SDS) перед удалением их из шкафа биобезопасности.
2. На следующий день после посева клеток Vero последовательно разбавляйте каждый образец вируса, чтобы он был бляширован в 1x PBS; обычно используют 10-кратные разведения для наиболее точного отслеживания.
3. Сделайте эти разведения через ^10-4 (для низких концентраций вирусов) или через ^10-9 (для ожиданий более высоких титров образцов) с не менее 1 мл каждого образца, оставшегося для самого анализа бляшек.
4. Храните все вирусные разведения на льду (не дольше 1 ч) до тех пор, пока не будете готовы добавить эти разбавленные образцы вируса в клетки.

3. Добавление вируса в клетки

1. Удалите культуральную среду из одной или двух лунок пипеткой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте аспиратор, потому что он удаляет слишком много жидкости из монослоя ячеек и сушит клетки. Одним из важнейших соображений является обеспечение того, чтобы клеточный монослой оставался гидратированным на протяжении всего хода эксперимента. Если клетки высохнут, они смоют пластину на последнем этапе и будут генерировать непригодные для использования данные. Поэтому обрабатывайте только одну или две скважины за раз, чтобы уменьшить эту возможность.
2. Осторожно добавляют разбавленный образец вируса (100-400 мкл и 50-200 мкл образца вируса используются для 6-луночных и 12-луночных пластин соответственно) по каплям к каждому монослою, добавляя капли вниз по бокам каждой лунки. Повторяйте процесс для каждой одной или двух скважин, пока вся пластина не будет заполнена образцами вируса, которые будут ошлетены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление капель в центр скважины может непреднамеренно отслаивать клетки от субстрата.
3. Аккуратно покачайте всю пластину вручную, чтобы убедиться, что PBS, содержащая вирус, покрывает весь монослой клеток в каждой лунке, затем поместите пластину в инкубатор _CO2 при 37 ° C, чтобы позволить вирусу адсорбироваться.
4. Каждые 10 мин в течение 1 ч извлекайте пластину из инкубатора, осторожно снова раскачивайте ее, чтобы вирус распространялся более равномерно по каждой лунке, а затем поместите ее обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый эксперимент будет диктовать количество реплик и то, какие разведения используются; предпочтения читателя диктуют это решение.
5. Чтобы уменьшить возможность непреднамеренного подсчета неабсорбированного инокулята, извлеките образец вируса из скважин с наконечниками пипетки 1000 мкл и поместите его в стакан для отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, эта процедура проводится только с одной или двумя лунками за раз для поддержания гидратации клеточного монослоя.
6. Поместите 2,5 мл наложения метилцеллюлозы (растворите 5% метилцеллюлозы в 100 мл PBS, автоклав в течение 15 мин при 121 °C и 15 psi в жидком цикле, затем добавьте 375 мл DMEM плюс 25 мл FBS).
7. Как только вся пластина содержит накладку, поместите пластину обратно в инкубатор, чтобы обеспечить рост в течение двух дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вирусу и клеткам позволить расти в течение трех дней, даже в добавках DMEM плюс, может возникнуть существенная потеря клеток в монослое, тем самым ставя под угрозу окончательные данные.
8. Дезинфицируйте отработанный стакан, как правило, с добавлением отбеливателя, йодофора или аналогичного вируцида, прежде чем удалить его из шкафа биобезопасности.

4. Окрашивание бляшек

1. После двухдневной инкубации удалите наложение метилцеллюлозы пипеткой, снова по одной или двум лункам за раз, и поместите его в стакан для отходов.
2. Добавьте ~2 мл 1% кристаллической фиалки (см. Таблицу материалов) в 50% этаноле в каждую лунку, чтобы окрасить бляшки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять каждую последнюю каплю наложения.
3. Инкубируйте пластину со всеми лунками, заполненными пятном, в течение 30 мин при 37 °C. На этом этапе продезинфицируйте стакан для отходов, как указано выше на шаге 3.8.
4. Энергично вымойте тарелки водопроводной водой до тех пор, пока сток не станет прозрачным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий поток воды недостаточно силен; требуется полное давление от лабораторной раковины.
5. На этом этапе убедитесь, что существует примерно 10-кратная разница в количестве бляшек в каждой серии разведения.
6. Дайте пластинам высохнуть в течение ночи вверх ногами, после чего отдельные бляшки могут быть подсчитаны.

5. Подсчет бляшек и определение титра вируса

1. Независимо от подхода (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже), умножьте количество бляшек на коэффициент разбавления (например, если бы бляшки были подсчитаны в ^10-4 лунке, то количество бляшек умножилось бы на ¹⁰⁴).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя подсчет в диапазоне 10-100 бляшек ^{полезен5}, подсчет скважин с 30-300 бляшками несколько более надежен и учитывает примерно 1/2 бревенчатых разбавлений вместо полных логарифмических разбавлений.
2. Разделите это число на объем инокулята (как указано выше на этапе 3.2) и усредните все скважины, которые имеют бляшки в указанном диапазоне, чтобы получить наиболее точный титр ВПГ в исходном образце.
3. Выполните расчеты на этапах 5.3.1-5.3.5 с учетом использования условных данных, приведенных в таблице 1.
   1. Рассмотрим только колодцы с 30-300 бляшками (шаг 5.1). Следовательно, в таблице 1 используйте только столбец ^10-5 для реплик 1, 2 и 3.
   2. Возьмем количество бляшек при данном разведении и умножьте на обратный коэффициент разбавления. Следовательно, ^10-5 столбец образца 1 идет от 81 бляшки в ^10-5 разведении до 81 бляшки на ¹⁰⁵.
   3. Затем разделите это число на объем (в мл) разбавления вируса, добавленного к клеткам в этой лунке. Предполагая, что данные о ВПГ-1 в таблице 1 взяты из 12-луночной пластины, наиболее подходящим измерением было бы 0,2 мл. Следовательно, расчет из шага 5.3.2 становится 81 x ¹⁰⁵ , деленным на 0,2 мл, или 4,0 x ¹⁰⁷ PFU/мл HSV-1.
   4. Повторите этот процесс для всех полезных данных и среднего значения. Следовательно, провести расчет в пунктах 5.3.2-5.3.3 для всех образцов в колонке ^10-5 , предполагая, что они произошли из одного и того же образца вируса, и биологические реплики были проведены для получения наиболее точного измерения титра. В случае таблицы 1 в среднем 4,0 x ¹⁰⁷, 2,1 x ¹⁰⁷ и 2,6 x ¹⁰⁷ PFU/мл для получения окончательного среднего титра 2,9 x ¹⁰⁷ ± 0,98 x ¹⁰⁷ PFU/мл для этого образца.

Результаты

В таблице 1 показан эксперимент, который имеет оптимальные результаты. Все 10-кратные разведения следуют за примерно 10-кратным уменьшением количества бляшек. Эти виды данных также можно увидеть на рисунке 2, фактическом анализе бляшек, где счетное количество бля...

Обсуждение

Хотя анализы бляшек почти так же стары, как и сама культура клеток млекопитающих, кажется, что каждая лаборатория имеет свой собственный набор протоколов для выполнения этого базового анализа5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81