Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

Zusammenfassung

Plaquing ist eine Routinemethode zur Quantifizierung lebender Viren in einer Population. Obwohl Plaquing häufig in verschiedenen mikrobiologischen Lehrplänen mit Bakterien und Bakteriophagen gelehrt wird, ist das Plaquieren von Säugetierviren komplexer und zeitaufwendiger. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, die für die regelmäßige Arbeit mit Herpes-simplex-Viren zuverlässig funktionieren.

Zusammenfassung

Es gibt zahlreiche veröffentlichte Protokolle für das Plaquieren von Viren, einschließlich Referenzen in der Primärliteratur für die Methodik. Das Plaquieren von Viren kann jedoch schwierig durchzuführen sein, da es erforderlich ist, sich auf seine Spezifikationen und Verfeinerung zu konzentrieren. Es ist eine unglaublich herausfordernde Methode für neue Schüler, vor allem, weil sie akribische Aufmerksamkeit für die kleinsten Details erfordert. Diese Demonstration des Plaquing von Herpes-simplex-Viren sollte denjenigen helfen, die im Laufe der Jahre mit der Visualisierung der Methode, insbesondere ihrer Nuancen, zu kämpfen hatten. Während dieses Manuskript auf den gleichen Prinzipien der Standard-Plaquing-Methodik basiert, unterscheidet es sich dadurch, dass es eine detaillierte Beschreibung enthält, (1) wie Wirtszellen am besten gehandhabt werden, um Störungen während des Prozesses zu vermeiden, (2) ein nützlicheres viskoses Medium als Agarose, um die Diffusion von Virionen zu begrenzen, und (3) ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse liefert. Darüber hinaus hilft das begleitende Video, die feineren Unterscheidungen im Prozess zu demonstrieren, die häufig übersehen werden, wenn andere in die Durchführung von Plaque-Assays eingewiesen werden.

Einleitung

Die Anfänge der Virus-Plaque-Assays gehen auf die ersten Entdeckungen von Viren in den 1890er Jahren ^zurück1. Das Tabakmosaikvirus wurde zunächst isoliert und auf Tabakblättern weitergegeben, wo einzelne Infektionsflecken erkannt und quantifiziert werden konnten, die von einer einzigen, lebenden Virusentität ^stammten2, die später als Virion identifiziert ^wurde2. Spätere bahnbrechende Studien mit Bakterien und Bakteriophagen perfektionierten die Techniken, die verwendet wurden, um diese Viren zu beflecken, einschließlich Bakterien in der Mid-Log-Phase des Wachstums, serielle Verdünnung von Bakteriophagenproben und Top-Agar mit anschließender Visualisierung von buchstäblichen Löchern (benannte Plaques^{) im Bakterienrasen3.}

Das Plaquieren von Tierviren hinkte der spannenden Forschung mit Bakteriophagen hinterher, vor allem, weil die Methoden, die für die Züchtung von Säugetierzellen in Kultur erforderlich sind, erst in den 1940er Jahren entwickelt ^wurden4. Das Aufkommen von wachsenden murinen Zellen in Abwesenheit des gesamten Wirtsorganismus4 brachte jedoch eine neue Ära in der Fähigkeit hervor, Viren zu kultivieren und zu zählen^. Diese Arbeiten wurden für die Vermehrung und Quantifizierung des Western Equine Encephalomyelitis-Virus in Hühnerzellen und des Poliovirus in menschlichen Zellen ^erweitert5,6. Als sich der Bereich der kultivierbaren Säugetierzellen ausdehnte, gab die Schar verschiedener Wirtszellen für verschiedene Virusinfektionen der Welt ein Füllhorn von Möglichkeiten, alle Arten von Viren zu ^{untersuchen7.} Dazu gehörte die Vermehrung und Quantifizierung von humanen Herpesviren, insbesondere Herpes-simplex-Viren-1 (HSV-1) und -2 (HSV-2), die mukokutane Läsionen ^verursachen8. Wichtig ist, dass alle Plaque-Assays von der Existenz lebender Virionen abhängig sind, die in einer Probe rezeptorvermittelt in Wirtszellen eindringen ^können9. Unabhängig von der Allgegenwart und Vielzahl von Publikationen zur Durchführung von Plaque-Assays5,10,11,12,13,14,15,16 sind diese Methoden für HSV-1/-2 eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft; Man kann den Assay nicht ohne angemessene Aufmerksamkeit für jedes Detail im Protokoll durchführen, noch kann man einen erfolgreichen Assay ohne ein kritisches Auge für Subtilität im Prozess durchführen. Dieses Manuskript zeigt eine der konsistentesten reproduzierbaren Methoden für HSV-1/-2-Plaque-Assays, mit präzisen Details zur Kunst des Assays, die selten diskutiert werden.

Dieses aktuelle Protokoll erhält zuverlässig lebende plaquebildende Einheiten (PFU) für HSV-1 und -2. Die besten Ergebnisse werden unter Verwendung von Vero-Zellen (transformierte Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen) bei niedriger Passage (unter Passage Nummer 155) erzielt und routinemäßig in alpha-MEM17 gezüchtet^, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), L-Alanyl-L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen ^Mischung18. Vero-Zellen werden in diesem Medium standardmäßig zwei- bis dreimal pro Woche mit ^{einer 1}/_{5-Verdünnung} jedes Mal vermehrt.

Protokoll

Alle Verfahren mit den Vero-Zellen und lebenden Herpesviren wurden vom Towson University Institutional Biosafety Committee genehmigt. Ein verallgemeinertes Schema dieser Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aussaat der Vero-Zellen

1. Trypsinisieren Sie am Tag vor Beginn des Plaque-Assays Vero-Zellen und resuspendieren Sie sie in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) und ergänzen Sie sie gemäß der Standard-Zellkulturmethodik19^. Resuspendieren Sie die trypsinisierten Zellen in 10 ml DMEM pro T-75-Kolben der konfluenten Vero-Zellen (~ ¹⁰⁷ Zellen).
   HINWEIS: DMEM wird für Plaque-Assays anstelle von Alpha-MEM verwendet, da es die Zellwachstumsrate leicht verlangsamt und bessere Plaque-Assay-Ergebnisse begünstigt.
2. Zählen Sie die Zellen nach der bevorzugten Methode (z. B. ein Standard-Hämozytometer mit Trypan Blue-Ausschluss)¹⁹.
3. Samen Sie die Zellen bei 4 x ¹⁰⁶ Zellen / Platte; Verwenden Sie für HSV-2 6-Well-Platten mit 2,5 ml DMEM (mit Nahrungsergänzungsmitteln) pro Well; und für HSV-1 verwenden Sie 12-Well-Platten mit 1,25 ml DMEM (mit Ergänzungen) pro Well.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte unabhängig von der verwendeten Platte konstant sein, obwohl die Größe der Vertiefungen für die Genauigkeit des Plaque-Assays von Bedeutung ist. Es ist wichtig, die Zellen gleichmäßig zu verteilen, was am effektivsten erreicht werden kann, indem die Platte hin und her bewegt wird, nicht kreisförmig.
4. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C/5_{% CO2} in einem befeuchteten Inkubator wachsen.
   HINWEIS: Die Luftfeuchtigkeit wird mit einer Pfanne mit destilliertem Wasser, das ein Algizid enthält, im Boden des Inkubators aufrechterhalten.

2. Verdünnung der Probe

1. Schließen Sie die Probenverdünnung und die Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab.
   ACHTUNG: HSV-1 und -2 sind für den Menschen infektiös und müssen unter ordnungsgemäßer Eindämmung der biologischen Sicherheit (BSL-2) gehandhabt werden. Bewahren Sie alle Materialien, die mit dem Virus in Berührung kommen, getrennt auf und desinfizieren Sie sie mit einem quartären Mittel bei einer Verdünnung von 1/256 (siehe Materialtabelle), Iodophor, Bleichmittel oder starkem ionischem Reinigungsmittel (z. B. SDB), bevor Sie sie aus der Biosicherheitskabine entfernen.
2. Am Tag nach der Aussaat der Vero-Zellen verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, um sie in 1x PBS zu beflecken; Verwenden Sie typischerweise 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.
3. Machen Sie diese Verdünnungen durch 10-4 (für niedrige Konzentrationen von Viren) oder durch 10-9 (für Erwartungen von Proben mit höherem Titer), wobei mindestens 1 ml jeder Probe für den ^Plaque-Assay selbst verbleiben.
4. Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis (nicht länger als 1 h), bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen.

3. Zugabe von Viren zu den Zellen

1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einer oder zwei Vertiefungen mit der Pipette.
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen Aspirator, da er zu viel Flüssigkeit aus der Zellmonoschicht entfernt und die Zellen austrocknet. Eine entscheidende Überlegung ist, sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Verlaufs des Experiments hydratisiert bleibt. Wenn die Zellen austrocknen, waschen sie im letzten Schritt die Platte ab und erzeugen unbrauchbare Daten. Verarbeiten Sie daher nur ein oder zwei Vertiefungen gleichzeitig, um diese Möglichkeit zu verringern.
2. Fügen Sie die verdünnte Virusprobe (100-400 μL und 50-200 μL Virusprobe werden für 6-Well- bzw. 12-Well-Platten verwendet) vorsichtig zu jeder Monoschicht hinzu und fügen Sie die Tropfen an der Seite jedes Wells hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind.
   HINWEIS: Das Hinzufügen der Tropfen in die Mitte des Brunnens kann versehentlich Zellen vom Substrat abspalten.
3. Schaukeln Sie die gesamte Platte vorsichtig von Hand, um sicherzustellen, dass das PBS, das das Virus enthält, die gesamte Monoschicht von Zellen in jedem Brunnen bedeckt, und legen Sie die Platte dann bei 37 ° C in einen CO2-Inkubator, damit das Virus adsorbieren kann.
4. Entfernen Sie alle 10 Minuten innerhalb von 1 Stunde die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig erneut, um das Virus gleichmäßiger über jeden Brunnen zu verteilen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator.
   HINWEIS: Jedes Experiment bestimmt die Anzahl der Replikate und welche Verdünnungen verwendet werden. Die Präferenz des Lesers diktiert diese Entscheidung.
5. Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe aus den Vertiefungen mit 1000 μL Pipettenspitzen und legen Sie sie in ein Abfallbecherglas.
   HINWEIS: Auch dieses Verfahren wird mit nur einem oder zwei Vertiefungen gleichzeitig durchgeführt, um die Hydratation der Zellmonoschicht aufrechtzuerhalten.
6. 2,5 ml eines Methylcellulose-Overlays platzieren (5% Methylcellulose w/w in 100 ml PBS auflösen, 15 min bei 121 °C und 15 psi in einem Flüssigkeitszyklus autoklavieren, dann 375 ml DMEM plus 25 mL FBS hinzufügen).
7. Sobald eine ganze Platte eine Überlagerung enthält, legen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um das Wachstum für zwei Tage zu ermöglichen.
   HINWEIS: Wenn das Virus und die Zellen drei Tage lang wachsen dürfen, selbst in DMEM plus Nahrungsergänzungsmitteln, kann dies zu einem erheblichen Verlust von Zellen in der Monoschicht führen, wodurch die endgültigen Daten beeinträchtigt werden.
8. Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen.

4. Färbung für Plaketten

1. Nach der zweitägigen Inkubation entfernen Sie das Methylcellulose-Overlay durch eine Pipette, wieder ein oder zwei Vertiefungen auf einmal, und legen Sie es in ein Abfallbecherglas.
2. Fügen Sie ~ 2 ml 1% Kristallviolett (siehe Materialtabelle) in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu, um die Plaques zu färben.
   HINWEIS: Es ist nicht unbedingt erforderlich, jeden letzten Tropfen des Overlays zu entfernen.
3. Bebrüten Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 min bei 37 ° C. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas wie oben in Schritt 3.8.
4. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.
   HINWEIS: Ein sanfter Wasserstrahl ist nicht kräftig genug; Der volle Druck einer Laborspüle ist erforderlich.
5. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt.
6. Lassen Sie die Platten über Nacht kopfüber trocknen, danach können die einzelnen Plaques gezählt werden.

5. Plaques zählen und Virustiter bestimmen

1. Unabhängig vom Ansatz (siehe HINWEIS unten) multiplizieren Sie die Anzahl der Plaques mit dem Verdünnungsfaktor (z. B. wenn die Plaques in der ^{10-4-Vertiefung} gezählt würden, dann würde die Anzahl der Plaques mit ¹⁰⁴ multipliziert werden).
   HINWEIS: Obwohl das Zählen innerhalb eines Bereichs von 10-100 Plaques nützlich ^ist5, ist das Zählen von Bohrlöchern mit 30-300 Plaques etwas zuverlässiger und berücksichtigt ungefähr 1/2-Log-Verdünnungen anstelle von Full-Log-Verdünnungen.
2. Teilen Sie diese Zahl durch das Inokulumvolumen (wie oben in Schritt 3.2) und durchschnittlichen Sie alle Vertiefungen, die Plaques innerhalb des angegebenen Bereichs aufweisen, um den genauesten Titer von HSV in der ursprünglichen Probe zu erhalten.
3. Führen Sie die Berechnungen in den Schritten 5.3.1 bis 5.3.5 unter Berücksichtigung der Verwendung von Scheindaten in Tabelle 1 durch.
   1. Betrachten Sie nur Vertiefungen mit 30-300 Plaketten (Schritt 5.1). Verwenden Sie daher in Tabelle 1 nur die Spalte 10 ^{bis 5} für die Replikate 1, 2 und 3.
   2. Nehmen Sie die Anzahl der Plaques bei der gegebenen Verdünnung und multiplizieren Sie sie mit dem Kehrwert des Verdünnungsfaktors. Daher geht die 10-5-Säule von Probe 1 von 81 Plaques bei der ^{10-5-Verdünnung} auf 81 Plaques mal ¹⁰⁵.
   3. Dann teilen Sie diese Zahl durch das Volumen (in ml) der Virusverdünnung, die den Zellen in diesem Brunnen hinzugefügt wird. Unter der Annahme, dass die Daten zu HSV-1 in Tabelle 1 von einer 12-Well-Platte stammen, wären 0,2 ml die am besten geeignete Messung. Daher ergibt die Berechnung aus Schritt 5.3.2 81 x ¹⁰⁵ geteilt durch 0,2 ml oder 4,0 x ¹⁰⁷ PFU/ml von HSV-1.
   4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle nützlichen Daten und den Durchschnitt. Daher ist die Berechnung in 5.3.2-5.3.3 an allen Proben in der Spalte ^10-5 durchzuführen, vorausgesetzt, sie stammen aus derselben Virusprobe und die biologischen Replikate wurden durchgeführt, um die genaueste Titermessung zu erhalten. Im Falle von Tabelle 1 ergeben sich durchschnittlich 4,0 x 107, 2,1 x 107 und 2,6 x 107 PFU/ml, um einen endgültigen durchschnittlichen Titer von 2,9 x 107 ± ^0,98 x ¹⁰⁷ PFU/ml für diese Probe zu erhalten.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt ein Experiment mit optimalen Ergebnissen. Alle 10-fachen Verdünnungen folgen einer etwa 10-fachen Abnahme der Plaquezahl. Diese Art von Daten ist auch in Abbildung 2 zu sehen, einem tatsächlichen Plaque-Assay, bei dem die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate im Bereich von 10-4 lag. Dasselbe ist in Abbildung 3, der obersten Reihe, zu sehen, wo die abzählbare Anzahl von Plaques in der ^{10-3-Verdünnung} war.

Diskussion

Während Plaque-Assays fast so alt sind wie die Zellkultur von Säugetieren selbst, scheint es, dass jedes Labor seine eigenen Protokolle hat, um diesen grundlegenden Assay auszuführen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3512
6-well plates	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Antibiotic/antimycotic	Gibco	15240096
Crystal violet	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++)	Gibco	14190144
Fetal calf serum	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)	Gibco	GS07F161BA
Hemacytometer	Thermo Fisher	02-671-54
Methylcellulose	Millipore-Sigma	27-441-0
Quaternary agent (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Trypsin	Cytiva	SH30042.01
Vero cells	ATCC	CCL-81