קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל ואת היכולת החמצונית של אדיפוזיטים תרמוגניים בעכברים שמנים.

Abstract

מדידות הוצאות אנרגיה נחוצות כדי להבין כיצד שינויים בחילוף החומרים יכולים להוביל להשמנת יתר. ניתן לקבוע את ההוצאה על אנרגיה בזלית בעכברים על ידי מדידת צריכת חמצן בכל הגוף, ייצור _CO2 ופעילות גופנית באמצעות כלובים מטבוליים. אדיפוציטים חומים/בז' תרמוגניים (BA) תורמים באופן משמעותי להוצאות האנרגיה של מכרסמים, במיוחד בטמפרטורות סביבה נמוכות. כאן, מדידות של הוצאות אנרגיה בזאליות ויכולת BA כוללת להוציא אנרגיה בעכברים שמנים מתוארים בשני פרוטוקולים מפורטים: הראשון המסביר כיצד להקים את הבדיקה כדי למדוד את ההוצאה על אנרגיה בזלית באמצעות ניתוח של covariance (ANCOVA), ניתוח הכרחי בהתחשב בכך שהוצאות האנרגיה משתנות בהתאם למסת הגוף. הפרוטוקול השני מתאר כיצד למדוד את יכולת ההוצאה האנרגטית של BA בעכברים . הליך זה כרוך בהרדמה, הדרוש כדי להגביל את ההוצאה הנגרמת על ידי פעילות גופנית, ואחריו הזרקת אגוניסט בטא3-adrenergic, CL-316,243, אשר מפעיל את ההוצאה האנרגטית BA. שני פרוטוקולים אלה ומגבלותיהם מתוארים בפירוט מספיק כדי לאפשר ניסוי ראשון מוצלח.

Introduction

חילוף החומרים יכול להיות מוגדר כשילוב של התגובות הביוכימיות האחראיות על ספיגת חומרים מזינים, אחסון, טרנספורמציה, ופירוק כי תאים להשתמש כדי לגדול ולבצע את הפונקציות שלהם. תגובות מטבוליות הופכות את האנרגיה הכלולה בחומרים מזינים לצורה שיכולה לשמש תאים לסנתז מולקולות חדשות ולבצע עבודה. תגובות ביוכימיות אלה אינן יעילות מטבען בהפיכת אנרגיה זו לצורה שמיש כדי לקיים ^חיים1. חוסר יעילות כזה גורם לפיזור אנרגיה בצורה של חום, עם ייצור חום זה משמש כדי לכמת את קצב חילוף החומרים הסטנדרטי (SMR) של ^{אורגניזם1}. המצב הסטנדרטי הוגדר באופן קלאסי כייצור חום המתרחש במבוגר ער אך נח, לא בליעת או עיכול מזון, בתרמונוטרליות וללא כל ^מתח1. קצב חילוף החומרים הבסיסי (BMR) או הוצאות אנרגיה הבסיסית בעכברים מכונה SMR אך אצל אנשים בולעים ומעכלים מזון תחת לחץ תרמי קל (טמפרטורות הסביבה 21-22 מעלות צלזיוס)¹. האתגרים והקשיים של מדידת ייצור חום ישירות הפכו את ה- BMR לעקיף, כלומר לחשב את ייצור החום ממדידות צריכת חמצן, כדי להפוך לגישה הפופולרית ביותר לקביעת ה- BMR. חישוב ה- BMR מצריכת חמצן אפשרי מכיוון שחמצון החומרים המזינים על ידי המיטוכונדריה לסנתז ATP אחראי ל -72% מכלל החמצן הנצרך באורגניזם, עם 8% מצריכת החמצן הכוללת המתרחשת גם במיטוכונדריה אך מבלי ליצור ATP (נשימה לא מנוקבת)¹. ניתן לייחס את רוב 20% הנותרים של החמצן הנצרך לחמצון מיזים במקומות תת-תאיים אחרים (חמצון חומצת שומן פרוקסיזומלית), תהליכים אנבוליים ויצירת מינים תגובתיים של ^חמצן1. כך, בשנת 1907, לאסק הקים משוואה, המבוססת על מדידות אמפיריות, בשימוש נרחב כדי להפוך את צריכת החמצן וייצור _CO2 לפיזור אנרגיה כחום. אצל בני אדם, המוח מהווה ~ 25% של BMR, מערכת השלד והשרירים עבור ~ 18.4%, הכבד עבור ~ 20 %, הלב עבור ~ 10%, ורקמת השומן עבור ~ 3-7%². בעכברים, תרומת הרקמה ל- BMR שונה במקצת, כאשר המוח מייצג ~ 6.5%, שריר השלד ~ 13%, הכבד ~ 52%, הלב ~ 3.7%, ורקמת השומן ~ 5%³.

למרבה הפלא, התגובות הביוכימיות המגדירות את ה- BMR אינן קבועות ומשתנות בתגובה לצרכים שונים, כגון עבודה חיצונית (פעילות גופנית), פיתוח (צמיחת רקמות), לחצים פנימיים (זיהומים נגד, פציעות, מחזור רקמות) ושינויים בטמפרטורת הסביבה (הגנה קרה)¹. אורגניזמים מסוימים מגייסים באופן פעיל תהליכים ליצירת חום בחשיפה לקור, מה שמרמז על כך שהחום המיוצר על ידי חילוף החומרים אינו רק תוצר לוואי מקרי. במקום זאת, האבולוציה בחרה מנגנוני רגולציה שיכולים במיוחד להגביר את ייצור החום על ידי שינוי קצב התגובות המטבוליות1. לכן, אלה מדידות צריכת חמצן ניתן להשתמש כדי לקבוע את היכולת של אורגניזם לייצר חום בתגובה לקור.

שני תהליכים עיקריים תורמים לייצור חום עם חשיפה לקור. הראשון הוא רועד, אשר מייצר חום על ידי הגדלת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס בשריר כדי לכסות את העבודה הפיזית שנעשתה על ידי התכווצות שרירים לא רצונית. לכן, חשיפה לקור תגדיל את צריכת החמצן ^{בשרירים1}. השני הוא תרמוגנזה לא רועדת, המתרחשת באמצעות עלייה בצריכת חמצן באדיפוציטים חומים ובז '(BA). פיזור האנרגיה לחום ב- BA מתווך על ידי חלבון מתפרק מיטוכונדריאלי 1 (UCP1), המאפשר כניסה מחדש של פרוטון למטריצה המיטוכונדריאלית, ומפחית את שיפוע הפרוטון המיטוכונדריאלי. פיזור שיפוע הפרוטונים המיטוכונדריאלי על ידי UCP1 מגביר את ייצור החום על ידי הגובה בהעברת אלקטרונים וצריכת חמצן והאנרגיה המשתחררת על ידי פיזור פרוטונים כשלעצמו מבלי ליצור ATP (לא מנוטרל). יתר על כן, BA תרמוגני יכול לגייס מנגנונים נוספים להעלות את צריכת החמצן מבלי לגרום פיזור גדול בשיפוע פרוטון, על ידי הפעלת סינתזת ATP חמצוני חסר תועלת ומחזורי צריכה. הכלובים המטבוליים המתוארים כאן, כלומר מערכת CLAMS-Oxymax מקולומבוס אינסטרומנטס, מציעים את האפשרות למדוד את הוצאות האנרגיה בטמפרטורות סביבה שונות. עם זאת, כדי לקבוע את יכולת התרמוגנית של BA באמצעות מדידות צריכת חמצן בכל הגוף, יש: (1) לחסל את התרומה של רועד, ותהליכים מטבוליים אחרים שאינם BA להוצאות אנרגיה, ו -(2) במיוחד להפעיל פעילות תרמוגנית BA ב vivo. לכן, פרוטוקול שני מתאר כיצד להפעיל באופן סלקטיבי BA ב vivo באמצעות פרמקולוגיה בעכברים מורדמים ב thermoneutrality (30 °C), עם הרדמה תרמונוטרליות המגבילה תהליכים תרמוגניים אחרים שאינם BA (כלומר, פעילות גופנית). האסטרטגיה הפרמקולוגית להפעלת BA היא טיפול בעכברים עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic CL-316,246. הסיבה לכך היא כי חשיפה קרה מקדמת תגובה אוהדת משחרר נוראדרנלין להפעיל קולטנים β-adrenergic ב BA, אשר מפעיל UCP1 חמצון שומן. יתר על כן, ביטוי קולטן adrenergic β3 מועשר מאוד ברקמת שומן בעכברים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). עכברים קיבלו את התזונה והמים שלהם בכלוב המטבולי, ששוכנו בסביבה מבוקרת טמפרטורה (~21-22 או 30 מעלות צלזיוס) עם מחזור בהיר/כהה של 12 שעות. 8 עכברים נקבות בנות שבוע האכילו דיאטה עתירת שומן או דיאטת צ'או במשך 8 שבועות שימשו למחקר זה.

1. מדידת קצב חילוף החומרים של הבזל (BMR)

1. מדוד את משקל הגוף הכולל של העכבר באמצעות סולם משקל בדיוק בטווח של 0.1 גרם.
   הערה: זה חייב להיעשות לפני דיור העכברים בכלובים מטבוליים ואחרי 2-3 ימים של תקופת התאקלמות לכלובים המטבוליים.
2. מדוד את הרכב הגוף, כולל שומן ומסה רזה בעכברים שאינם מרדים, באמצעות מערכת ניתוח הרכב הגוף המתאימה (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: מדידות אלה נדרשות כדי לקבוע את ההוצאה האנרגטית ומבוצעות במקביל למדידות משקל הגוף הכוללות (שלב 1.1).
3. הגדר את הכלובים המטבוליים ולהתחיל את תקופת ההתאקלמות.
   הערה: מערכת הכלובים המטבוליים כוללת מארז המאפשר למשתמש לשלוט בטמפרטורת הדיור ובאור של 12 כלובים (איור 1A,B). בכל כלוב יש בקבוק מים, מאכיל ורשת (איור 1C). הרשת מפרידה את העכבר מתחתית הכלוב, ומאפשרת איסוף צואה. לאחר התקנת הכלוב על כל חלל שנקבע מראש, מכסה החותם את הכלוב כולל את חריץ בקבוק המים, את אוויר הדגימה של הצינורות, את מערכת זרימת האוויר ואת חיישן הפעילות הגופנית (איור 1D).
   1. הפעל את מארז הטמפרטורה, את מערכת זרימת האוויר ואת המחשב 2 שעות לפני תחילת בדיקת ההפעלה.
   2. לאחר 2 שעות, פתח את התוכנה השולטת במארז (ראה טבלת חומרים) ואת זרימת האוויר ותן לתוכנה לבדוק את התקשורת של המחשב עם הציוד.
      הערה: תוכנת Oxymax שימשה לעבודה הנוכחית.
   3. לאחר יצירת התקשורת, לחץ על קובץ ולאחר מכן פתח את תצורת הניסוי (איור 2A) ובחר את תצורת הניסוי שעוצבה מראש על-ידי הספק (או הגדר מבוחן קודם).
   4. לחץ על הניסוי ולאחר מכן לחץ על מאפיינים, אשר יפתח את החלון מאפייני ניסוי (איור 2B).
   5. בחלון מאפיינים, הגדר את הפרמטרים של המארז הסביבתי, כולל טמפרטורת הסביבה (21 °C )C) ואת מחזורי האור של 12 שעות.
      הערה: שמירה על התוכנה פתוחה ופועלת מאפשרת לאוויר לזרום לתוך הכלובים והמארז כדי לשמור על הטמפרטורה ומחזורי האור שנבחרו. לכן, המערכת כולה יכולה לפעול עם עכברים בתוך הכלובים במשך כמה ימים, גם ללא מדידת חמצן ופחמן _{דו חמצני.}
   6. לחץ על ניסוי, ולאחר מכן לחץ על ההתקנה, ואת החלון הגדרת ניסוי ייפתח, שבו הפרמטרים של כל כלוב מטבולי מוגדרים.
   7. הקצה כל מזהה עכבר לכלוב הבודד שבו שוכן העכבר (איור 2C).
   8. כלול את המסה הרזה או משקל גוף כולל עבור כל עכבר רק אם אין הבדלים במשקל הגוף נצפים בין קבוצות.
      הערה: השגת ערכים גולמיים של צריכת חמצן והוצאות אנרגיה מקלה על ניתוחי ANCOVA.
   9. הגדר את קצב זרימת האוויר לכלוב חילוף החומרים ב 0.5-0.6 ליטר / דקה.
   10. בחלון התקנת ניסוי, בחר את הנתיב והשם לשמירת הקבצים. בחרו בספריית הגיבוי (איור 2D).
   11. הוסף כמות משוקללת מראש של מזון למאכילים המכסה לפחות צריכת מזון במשך יום אחד.
       הערה: אם לכלובים יש קשקשים משולבים, ניתן להוסיף את המזון ישירות, והתוכנה תקליט אותו.
   12. מוסיפים את בקבוקי המים. בדוק כי הבקבוק אטום כראוי ואינו דולף.
   13. 24 שעות לאחר הוספת האוכל, לשקול את האוכל שנותר על הכלוב.
       הערה: גרם המזון שנוספו פחות גרם המזון שנותר ימדוד את צריכת המזון.
   14. התחל את מדידות החמצן, _{הפחמן הדו-חמצני} והפעילות (שלב 1.4.10) לאחר שערכי צריכת המזון זהים לאלה של עכברים השוכנים בכלובים רגילים.
       הערה: כאן, תקופת ההתאקלמות (בדרך כלל 2-3 ימים) הושלמה, ומדידות הוצאות אנרגיה יכולות להתחיל.
4. מדידות קלורימטריה ופעילות עקיפות להערכת הוצאות האנרגיה
   1. למדוד את משקל הגוף, שומן, ומסה רזה של כל העכברים לפני תחילת המדידות.
      הערה: אלה הם משקל הגוף וערכי מסה רזה המשמשים לביצוע ניתוחי ANCOVA.
   2. כייל את גלאי _O2 ו- _CO2 של מערכת ה- CLAMS (ראה טבלת חומרים) בריכוז החמצן המומלץ; תמיד לכייל מחדש את הגלאי לפני תחילת ניסוי חדש.
   3. השתמש בגז כיול של הרכב ידוע (20.50% חמצן ו 0.50% _CO2).
      הערה: ספקי גז לעתים קרובות מתייחסים לגז זה כאל "ציון סטנדרטי ראשוני".
   4. הפעל ולוודא כי לחץ פלט הטנק הוא ב 5-10 פסאיי.
   5. פתחו את תוכנת כלי הכיול לכיול ובדיקה של חיישני הגז (איור 2E). לחץ על ניסוי, ולאחר מכן כייל.
   6. לחץ על התחל. לאחר מכן, המתינו לבדיקת החיישנים ושתוכנה תבקש מהמשתמש לסובב את הכפתורים של חיישן הגז (איור 2F) עד שהערך של זהות _O2 יהיה 1 (איור 2G-H). לחץ על הבא לאחר השלמת השלב.
      הערה: אם כלי הכיול מבצע את כל השלבים הנוכחיים, הכיול ימשיך באופן אוטומטי לשלב הבא כאשר מד ההתקדמות יתמלא.
   7. אמת את תוצאות הכיול לאחר השלמת כל השלבים והתוצאות מוצגות.
   8. כבה את גז הכיול.
   9. החליפו מזון והוסיפו מספיק מזון לתקופה של 48-72 שעות.
      הערה: למרות כלובים ניתן לפתוח במהלך מדידות הוצאות האנרגיה כדי לפקח על משקל הגוף ולשנות את המזון מדי יום, עכברים יכולים להיות לחוצים על ידי מניפולציות אלה, ומדידות הולכים לאיבוד כאשר הכלובים נפתחים. לכן, מומלץ להימנע מכל מניפולציה במהלך תקופת המדידה.
   10. בתוכנה, לחץ על ניסוי ולאחר מכן הפעל כדי להפעיל את מדידות החמצן_{, הפחמן הדו-חמצני} והפעילות (איור 3A).
       הערה: ניתן לעקוב אחר ביצוע המדידות בזמן אמת בתיבה הממוקמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (מלבן אדום, איור 3B). המלבן האדום באיור 3B מראה שהמערכת מודדת את הכלוב מספר 1 במרווח מס' 3, כלומר המדידה השלישית. מדידה אחת בכלוב אחד יכולה להימשך כדקה אחת. לכן, עם 12 כלובים מחוברים, צריכת חמצן ניתן למדוד בערך כל 12 דקות. מומלץ לבצע מדידות רציפה של מינימום 48 שעות.
   11. הפסיקו את הניסוי על ידי לחיצה על הניסוי ולאחר מכן עצרו (איור 3C).
   12. פתח את הכלובים, שקול את העכברים ואת האוכל. לאסוף את הצואה כדי לחשב את מספר הקלוריות והשומנים המופרשים על פני תקופת המדידות 48-72 שעות.
       הערה: ניתן לאחסן צואה ב- -20 °C (70 °F) עבור ניתוחים מאוחרים יותר. לא ניתן להשתמש בכלובים אלה ביעילות לאיסוף שתן.
   13. לחץ על ניסויים ולאחר מכן על ייצוא וייצוא של כל הנושאים כקובץ CSV (איור 3D).
       הערה: כדי להקל על ניתוחי ANCOVA, זה חיוני כדי לייצא צריכת חמצן גולמי (_VO2) ו _CO2 ייצור ערכים (VCO2) מבלי להיות מנורמל על ידי משקל הגוף.
5. ניתוח נתונים ובקרת איכות
   1. בגיליון CSV המיוצא (איור 3D) (החל מהשלב 1.4.13), השתמש בערכים הגולמיים של צריכת החמצן (_VO2) וייצור _CO2 (VCO2) הנמדדים כל 12 דקות בתקופה של 2-3 ימים המפורטים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה וכוללים חותמת זמן, כלומר השעה והתאריך שבהם הם נמדדו.
      הערה: ערכי _VO2 ו- _VCO2 יתוקנו באופן אוטומטי אם יוסיפו משקל גוף או ערכי מסה רזה.
   2. בגיליון CSV המיוצא, השתמש בערכים הגולמיים של יחס חילופי הנשימה (RER: _VCO2/_VO2) המחושב באופן אוטומטי ומפורטים על ידי התוכנה בהתאם לחותמת הזמן שלהם.
      הערה: ערכים קרובים ל- 1 מראים שהעכבר בעיקר מחמצן פחמימות, בעוד שערכים קרובים יותר ל- 0.7 מייצגים שהעכבר בעיקר מחמצן שומן. RER מעל 1 יכול להתרחש במהלך פעילות אנאירובית, כמו הגוף מגרש יותר _CO2 כדי לפצות על חמצת הנגרמת על ידי לקטט. RER גבוה מ- 1 יכול להצביע על מתח. קובץ CSV המיוצא מכיל גם את הערכים הגולמיים מהוצאות אנרגיה (EE) או ייצור חום בקלוריות לדקה לעכבר, הנמדדים כל 12 דקות ב -2-3 הימים. כאן, כל הערכים המפורטים כוללים חותמת זמן.
   3. מכיוון שערכי EE יחידים לעכבר נדרשים עבור ANCOVA, ממוצע ערכי ה- EE שנרשמו בין השעות 09:00-16:00 עבור שלב האור (היום) ו- 19:00-04:00 עבור השלב הכהה (לילה) בעכבר וביום.
      הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות Excel או Graph Pad. בחירת חלונות פעמיים אלה מונעת ממוצע של ערכי EE בינוניים, הדרגתיים ולא יציבים המשויכים למעבר הפאזה הכהה בהיר.
   4. עבור תקופה של 48 שעות, חשב את הממוצע של שני ערכי אור יום ואת שני ערכי הפאזה הכהה לעכבר באמצעות Excel או Graph Pad.
   5. כדי לכמת את הפעילות הגופנית הכוללת, השתמש ב- Excel או ב- Graph Pad כדי לסכם את ספירת מעברי הקרן x, Y ו- z הנמדדים בכלובים המטבוליים ומפורטים בקובץ CSV עבור כל עכבר.
      הערה: הפעילות הכוללת x,y,z מחושבת על-ידי ביצוע תחילה הערך הממוצע של כל X, Y, Z לעכבר ומחזור. לאחר מכן, הסכום של כל ערכי X, Y, Z ממוצעים לעכבר ומחזור נקבע להתוות את הנתונים כמו באיור 5E (בממוצע של יומיים).
   6. לחלופין, ייצג את הנתונים המציגים כל ערך מדידה לאורך זמן, מה שיוצר עקומות הממחישות את השינויים ב- EE במהלך המעבר ממחזורים בהירים וכהים.
      הערה: עיין בסעיף הדיון על אופן ומתי לבצע ניתוחי ANCOVA, והנוסחאות השונות המשמשות לחישוב _VO2, _VCO2 ו- EE מסופקות בקובץ משלים 1.

2. מדידת הקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוציא אנרגיה

1. הגדר את המדידות וטיפולי העכבר. ראה שלב 1 לקבלת פרטים על ההכנות הניסיוניות לניטור צריכת החמצן, שכן קיבולת תרמוגנית באדיפוציטים נקבעת בעקיפין על ידי צריכת חמצן בעקבות שלבים 2.1.1-2.2.2.
   הערה: פרוטוקול זה דורש הרדמה עכבר וטיפול אקוטי עם אגוניסט קולטן בטא 3 CL-316,243 (ראה טבלה של חומרים), נותן הערכה מהירה של יכולת תרמוגנית BA.
   1. בצע ניתוח הרכב הגוף ולשקול את העכברים. הפעל את CLAMS, להגדיר את הטמפרטורה ב 30 °C (תרמונוטרליות), ולחכות 2 שעות עבור המערכת כולה להתחמם.
   2. הגדר את שאר תנאי הבחינה, כולל אור, להקצות מזהה עכבר לכל כלוב ולהוסיף ערך משקל גוף של כל עכבר בכלוב המתאים אם אין הבדל במשקל הגוף הוא ציין בין קבוצות.
   3. כייל את גלאי החמצן/_CO2 כמו בשלבים 1.4.2-1.4.7.
   4. התחל את הניסוי בתוכנה.
   5. הזריקו לכל עכבר פנטוברביטל (60-120 מ"ג/ק"ג) והכניסו כל עכבר לכלוב המטבולי שהוקצה לו (שלב 2.1.2).
      הערה: המינון של pentobarbital הנדרש כדי לשמור על עכברים ישנים ב thermoneutrality (30 °C) משתנה עם זן העכבר ואת הגנוטיפ. מומלץ לבדוק מינונים שונים pentobarbital מ 50 כדי 120 מ"ג/ק"ג ובחר את אחד שמירה על העכבר מרדים במהלך 2-3 שעות ב 30 °C (50 °F). הרדמה יעילה חיונית כדי להסיר את התרומה של פעילות גופנית להוצאות האנרגיה.
   6. כדי להבטיח הרדמה, להתבונן בעכברים לאחר הזרקת pentobarbital עד שהם ישנים לחלוטין שלהם שיעורי צריכת החמצן ירד להיות יציב.
   7. המתן כדי להשיג לפחות 3 שיעורי צריכת חמצן יציבים רצופים לפני הזרקת CL-316,243.
      הערה: בזמן ההמתנה לייצוב צריכת החמצן, להכין את המזרקים עם CL-316,243 עבור כל עכבר (1 מ"ג / קילוגרם).
   8. פתח כלוב #1 והזרק CL-316,243 באופן תת עורי מיד לאחר מדידת _VO2 ו- _VCO2 אחת התרחשה בכלוב #1. החזר את העכבר לכלוב #1 מיד לאחר ההזרקה.
      הערה: המדידות מסומנות בזמן אמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (איור 3B, מלבן אדום).
   9. המתן עד שכלוב #2 יימדד (איור 3B, מלבן אדום) ולאחר מכן המשך כמו בשלב 2.1.8 לכלוב #2.
      הערה: הזרקת CL-316,243 מיד לאחר מדידה מאפשרת שמירה על קבוע הזמן בין זריקות. לדוגמה, אם יש 12 עכברים / כלובים פועלים, עם מדידות שנאספו בכלובים בודדים ברצף ואת האוסף שנמשך 55 s לכלוב, אז אתה צריך להזריק עכבר אחד בכל דקה. עם שיעורי הזרקה אלה, המדידה הראשונה תתרחש לאחר 12 דקות לאחר הזרקה בכל 12 הכלובים.
   10. המשך מדידות הוצאות האנרגיה עד לערכי הוצאות האנרגיה לרמה של 5-6 מדידות רצופות, בדרך כלל 90-180 דקות לאחר ההזרקה.
       הערה: עכברים יכולים להתעורר מההרדמה במהלך הניסויים. יש להסיר את העכברים האלה מהניתוח. לכן, בדיקת מינונים pentobarbital מראש יגביר את היעילות של המחקרים.
   11. עצרו את מדידות ההוצאה האנרגטית, אך שמרו עכברים בכלובים שלהם ב-30 מעלות צלזיוס, עד שהם יתעוררו.
   12. לאחר שהעכברים ערים לחלוטין, בדוק את בריאות העכברים והחזיר אותם לכלובים הראשוניים שלהם.
   13. יצא את הנתונים של כל עכבר כקובץ CSV באמצעות תוכנת הציוד, כמתואר בסעיף 1.4.13.
2. ניתוח נתונים
   הערה: ניתוח הנתונים בוצע על ידי Excel או Graphpad
   1. התווה את הערכים הרצופים 3-5 של _VO2, _VCO2 ו- EE יציבים וקבועים לאורך זמן, מכיוון שאלו הערכים המייצגים את קצב חילוף החומרים כאשר עכברים נמצאים במיון מלא.
   2. לאחר מכן, התווה את מדידות _VO2, _VCO2 ו- EE הרצופות הבאות שהושגו לאחר ההזרקה.
      הערה: הערכים המוחלטים של EE ואת הגידול הקיפול EE המושרה על ידי הזרקה מצביעים על פונקציה תרמוגנית ^BA7.

תוצאות

איור 4 מציג ערכי פעילות גופנית של _VO2, VCO2, ייצור חום/אנרגיה (EE), יחס חילופי נשימה (RER) וערכי פעילות גופנית של X, Y, Z המתקבלים באמצעות הכלובים המטבוליים של מערכת CLAMS. VO2 ו- _VCO2 המסופקים על ידי מערכת CLAMS הוא נפח הגז (mL) לדקה וניתן כבר לחלק אותו לפי משקל הגוף או ערכי...

Discussion

קלורימטריה עקיפה שימשה במשך שנים להערכת הוצאות האנרגיה של כל ^הגוף4. פרוטוקול זה המתואר כאן מספק שיטה פשוטה למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל וקביעת יכולת תרמוגנית BA ב vivo באמצעות כלובים מטבוליים.

שיטת הקלורימטריה העקיפה המתוארת כאן מאשרת כי חלוקת ערכי הוצאו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration