Bestimmung des basalen Energieverbrauchs und der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Messung des Grundumsatzes und der oxidativen Kapazität von thermogenen Adipozyten bei übergewichtigen Mäusen.

Zusammenfassung

Messungen des Energieverbrauchs sind notwendig, um zu verstehen, wie Veränderungen im Stoffwechsel zu Fettleibigkeit führen können. Der basale Energieverbrauch kann bei Mäusen bestimmt werden, indem der Sauerstoffverbrauch des ganzen Körpers, die _{CO2-Produktion} und die körperliche Aktivität mit Hilfe von Stoffwechselkäfigen gemessen werden. Thermogene braune/beige Adipozyten (BA) tragen erheblich zum Energieverbrauch von Nagetieren bei, insbesondere bei niedrigen Umgebungstemperaturen. Hier werden Messungen des basalen Energieverbrauchs und der gesamten BA-Kapazität, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen, in zwei detaillierten Protokollen beschrieben: Das erste erklärt, wie man den Assay zur Messung des basalen Energieverbrauchs mithilfe der Analyse der Kovarianz (ANCOVA) einrichtet, eine notwendige Analyse angesichts der Tatsache, dass der Energieverbrauch mit der Körpermasse variiert. Das zweite Protokoll beschreibt, wie die BA-Energieverbrauchskapazität in vivo bei Mäusen gemessen werden kann. Dieses Verfahren beinhaltet eine Anästhesie, die erforderlich ist, um die durch körperliche Aktivität verursachten Ausgaben zu begrenzen, gefolgt von der Injektion des beta3-adrenergen Agonisten CL-316.243, der den Energieverbrauch in BA aktiviert. Diese beiden Protokolle und ihre Einschränkungen werden ausreichend detailliert beschrieben, um ein erfolgreiches erstes Experiment zu ermöglichen.

Einleitung

Metabolismus kann als die Integration der biochemischen Reaktionen definiert werden, die für die Aufnahme, Speicherung, Umwandlung und den Abbau von Nährstoffen verantwortlich sind, die Zellen verwenden, um zu wachsen und ihre Funktionen zu erfüllen. Stoffwechselreaktionen wandeln die in Nährstoffen enthaltene Energie in eine Form um, die von Zellen genutzt werden kann, um neue Moleküle zu synthetisieren und Arbeit zu verrichten. Diese biochemischen Reaktionen sind von Natur aus ineffizient, um diese Energie in eine nutzbare Form zur Erhaltung des Lebens ^umzuwandeln1. Eine solche Ineffizienz führt zu einer Energieableitung in Form von Wärme, wobei diese Wärmeproduktion zur Quantifizierung der Standard metabolic Rate (SMR) eines Organismus verwendet ^wird1. Die Standardbedingung wurde klassisch definiert als Wärmeproduktion, die bei einem wachen, aber ruhenden Erwachsenen auftritt, der keine Nahrung aufnimmt oder verdaut, bei Thermoneutralität und ohne ^Stress1. Der Grundumsatz (BMR) oder der basale Energieverbrauch bei Mäusen wird als SMR bezeichnet, jedoch bei Personen, die unter leichtem thermischem Stress (Umgebungstemperaturen 21-22 °^{C) Nahrung} aufnehmen und verdauen1. Die Herausforderungen und Schwierigkeiten bei der direkten Messung der Wärmeproduktion machten die indirekte Kalorimetrie, nämlich die Berechnung der Wärmeproduktion aus Sauerstoffverbrauchsmessungen, zum beliebtesten Ansatz zur Bestimmung des BMR. Die Berechnung des BMR aus dem Sauerstoffverbrauch ist möglich, da die Oxidation von Nährstoffen durch Mitochondrien zur Synthese von ATP für 72% des gesamten in einem Organismus verbrauchten Sauerstoffs verantwortlich ist, wobei 8% des gesamten Sauerstoffverbrauchs auch in Mitochondrien auftreten, jedoch ohne ATP (entkoppelte Atmung)¹. Der Großteil der verbleibenden 20% des verbrauchten Sauerstoffs kann auf die Nährstoffoxidation an anderen subzellulären Orten (peroxisomale Fettsäureoxidation), anabole Prozesse und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zurückgeführt ^werden1. So stellte Lusk 1907 eine Gleichung auf, die auf empirischen Messungen basierte und häufig verwendet wurde, um den Sauerstoffverbrauch und die _{CO2-Produktion} in Energieableitung als Wärme umzuwandeln. Beim Menschen macht das Gehirn ~ 25% der BMR aus, der Bewegungsapparat ~ 18,4%, die Leber ~ 20%, das Herz ~ 10% und das Fettgewebe ~ 3-7% ². Bei Mäusen ist der Gewebebeitrag zur BMR etwas anders, wobei das Gehirn ~ 6,5%, der Skelettmuskel ~ 13%, die Leber ~ 52%, das Herz ~ 3,7% und das Fettgewebe ~ 5% ³ ausmachen.

Bemerkenswert ist, dass die biochemischen Reaktionen, die die BMR definieren, nicht fixiert sind und sich als Reaktion auf unterschiedliche Bedürfnisse ändern, wie z.B. äußere Arbeit (körperliche Aktivität), Entwicklung (Gewebewachstum), innere Belastungen (Entgegenwirken von Infektionen, Verletzungen, Gewebeumsatz) und Veränderungen der Umgebungstemperatur (Kälteabwehr)¹. Einige Organismen rekrutieren aktiv Prozesse, um Wärme bei Kälteeinwirkung zu erzeugen, was bedeutet, dass die durch den Stoffwechsel erzeugte Wärme nicht nur ein zufälliges Nebenprodukt ist. Stattdessen wählte die Evolution Regulationsmechanismen aus, die die Wärmeproduktion durch Veränderung der Geschwindigkeit der Stoffwechselreaktionen spezifisch hochregulieren ^könnten1. So können dieselben Sauerstoffverbrauchsmessungen verwendet werden, um die Fähigkeit eines Organismus zu bestimmen, Wärme als Reaktion auf Kälte zu erzeugen.

Zwei Hauptprozesse tragen zur Wärmeerzeugung bei Kälteeinwirkung bei. Die erste ist das Zittern, das Wärme erzeugt, indem es die mitochondriale oxidative Phosphorylierung und Glykolyse im Muskel erhöht, um die körperliche Arbeit durch unwillkürliche Muskelkontraktion zu decken. Daher erhöht die Kälteeinwirkung den Sauerstoffverbrauch in den ^Muskeln1. Die zweite ist die nicht zitternde Thermogenese, die durch eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs in braunen und beigen Adipozyten (BA) auftritt. Die Ableitung von Energie in Wärme in BA wird durch das mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1) vermittelt, das den Wiedereintritt von Protonen in die mitochondriale Matrix ermöglicht und den mitochondrialen Protonengradienten verringert. Die Dissipation des mitochondrialen Protonengradienten durch UCP1 erhöht die Wärmeproduktion durch die Erhöhung des Elektronentransfers und des Sauerstoffverbrauchs und die Energie, die durch die Protonendissipation an sich freigesetzt wird, ohne ATP (entkoppelt) zu erzeugen. Darüber hinaus kann thermogenes BA zusätzliche Mechanismen rekrutieren, die den Sauerstoffverbrauch erhöhen, ohne eine große Dissipation im Protonengradienten zu verursachen, indem es sinnlose oxidative ATP-Synthese- und Verbrauchszyklen aktiviert. Die hier beschriebenen Stoffwechselkäfige, nämlich das CLAMS-Oxymax-System von Columbus Instruments, bieten die Möglichkeit, den Energieverbrauch bei unterschiedlichen Umgebungstemperaturen zu messen. Um jedoch die thermogene BA-Kapazität unter Verwendung von Ganzkörper-Sauerstoffverbrauchsmessungen zu bestimmen, muss man: (1) den Beitrag von Zittern und anderen Nicht-BA-Stoffwechselprozessen zum Energieverbrauch eliminieren und (2) die thermogene Aktivität von BA in vivo spezifisch aktivieren. So beschreibt ein zweites Protokoll, wie BA in vivo selektiv unter Verwendung der Pharmakologie in anästhesierten Mäusen bei Thermoneutralität (30 °C) aktiviert werden kann, wobei Anästhesie und Thermoneutralität andere thermogene Prozesse (d.h. körperliche Aktivität) ohne BA begrenzen. Die pharmakologische Strategie zur Aktivierung von BA ist die Behandlung von Mäusen mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten CL-316,246. Der Grund dafür ist, dass Kälteexposition eine sympathische Reaktion fördert, die Noradrenalin freisetzt, um β-adrenerge Rezeptoren in BA zu aktivieren, die UCP1 und Fettoxidation aktivieren. Darüber hinaus ist die β3-adrenerge Rezeptorexpression im Fettgewebe bei Mäusen stark angereichert.

Protokoll

Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Los Angeles (UCLA) genehmigt. Mäuse erhielten ihre Diät und wasser ad libitum im Stoffwechselkäfig, untergebracht in einer temperaturkontrollierten Umgebung (~ 21-22 oder 30 ° C) mit einem 12h Hell / Dunkel-Zyklus. 8 Wochen alte weibliche Mäuse, die 8 Wochen lang mit einer fettreichen Diät oder Chow-Diät gefüttert wurden, wurden für diese Studie verwendet.

1. Messung des Grundumsatzes (BMR)

1. Messen Sie das Gesamteibgewicht der Maus mit einer Waage mit einer Genauigkeit im Bereich von 0,1 g.
   HINWEIS: Dies muss vor der Unterbringung der Mäuse in Stoffwechselkäfigen und nach der 2-3-tägigen Eingewöhnungszeit an die Stoffwechselkäfige erfolgen.
2. Messen Sie die Körperzusammensetzung, einschließlich Fett und magerer Masse bei nicht betäubten Mäusen, mit einem geeigneten Analysesystem für die Körperzusammensetzung (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Diese Messungen werden zur Bestimmung des Energieverbrauchs benötigt und parallel zu den Gesamtkörpergewichtsmessungen durchgeführt (Schritt 1.1).
3. Stellen Sie die Stoffwechselkäfige auf und beginnen Sie mit der Eingewöhnungsphase.
   HINWEIS: Das metabolische Käfigsystem umfasst ein Gehäuse, mit dem der Benutzer die Gehäusetemperatur und das Licht von 12 Käfigen steuern kann (Abbildung 1A, B). Jeder Käfig verfügt über eine Wasserflasche, einen Feeder und ein Gitter (Abbildung 1C). Das Gitter trennt die Maus von der Unterseite des Käfigs und ermöglicht die Fäkaliensammlung. Sobald der Käfig auf jedem vordefinierten Raum installiert ist, umfasst ein Deckel, der den Käfig versiegelt, den Wasserflaschenschlitz, die Schlauchprobenahmeluft, das Luftstromsystem und den Sensor für körperliche Aktivität (Abbildung 1D).
   1. Schalten Sie das Temperaturgehäuse, das Luftstromsystem und den Computer 2 Stunden ein, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
   2. Öffnen Sie nach 2 Stunden die Software, die das Gehäuse steuert (siehe Materialtabelle) und den Luftstrom und lassen Sie die Software die Kommunikation des Computers mit dem Gerät testen.
      HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurde die Oxymax-Software verwendet.
   3. Sobald die Kommunikation hergestellt ist, klicken Sie auf Datei, dann auf Experimentkonfiguration öffnen (Abbildung 2A) und wählen Sie die vom Hersteller vorentwickelte (oder aus einem früheren Assay eingerichtete) Experimentkonfiguration aus.
   4. Klicken Sie auf Experiment und dann auf Eigenschaften, wodurch das Fenster Experimenteigenschaften geöffnet wird (Abbildung 2B).
   5. Legen Sie im Eigenschaftenfenster die Parameter des Umgebungsgehäuses fest, einschließlich der Umgebungstemperatur (21 °C) und der 12-Stunden-Lichtzyklen.
      HINWEIS: Wenn Sie die Software geöffnet und in Betrieb halten, kann Luft in die Käfige und das Gehäuse strömen, um die ausgewählten Temperatur- und Lichtzyklen aufrechtzuerhalten. So kann das gesamte System mehrere Tage mit Mäusen in den Käfigen arbeiten, auch ohne Sauerstoff und _CO2 zu messen.
   6. Klicken Sie auf Experiment, dann auf Setup, und das Fenster Experiment Setup öffnet sich, in dem die Parameter jedes Stoffwechselkäfigs definiert sind.
   7. Weisen Sie jede Maus-ID dem einzelnen Käfig zu, in dem die Maus untergebracht ist (Abbildung 2C).
   8. Beziehen Sie die magere Masse oder das Gesamtkörpergewicht für jede Maus nur dann ein, wenn keine Unterschiede im Körpergewicht zwischen den Gruppen beobachtet werden.
      HINWEIS: Die Ermittlung von Rohwerten des Sauerstoffverbrauchs und des Energieverbrauchs erleichtert DIE ANCOVA-Analysen.
   9. Stellen Sie die Luftstromrate für den Stoffwechselkäfig auf 0,5-0,6 l/min ein.
   10. Wählen Sie im Fenster Experiment-Setup den Pfad und den Namen der Dateispeicherung aus. Wählen Sie das Sicherungsverzeichnis aus (Abbildung 2D).
   11. Fügen Sie den Feedern eine vorgewichtete Menge an Lebensmitteln hinzu, die mindestens die Nahrungsaufnahme für 1 Tag abdeckt.
       HINWEIS: Wenn die Käfige über eine integrierte Waage verfügen, kann das Futter direkt hinzugefügt werden, und die Software zeichnet es auf.
   12. Fügen Sie die Wasserflaschen hinzu. Überprüfen Sie, ob die Flasche korrekt verschlossen ist und nicht ausläuft.
   13. 24 h nach Zugabe des Futters, wiegen Sie das Futter, das auf dem Käfig verbleibt.
       HINWEIS: Die zugesetzten Gramm Lebensmittel abzüglich der verbleibenden Gramm Nahrung messen die Nahrungsaufnahme.
   14. Beginnen Sie mit den Sauerstoff-, _CO2- und Aktivitätsmessungen (Schritt 1.4.10), sobald die Nahrungsaufnahmewerte mit denen von Mäusen übereinstimmen, die in normalen Käfigen untergebracht sind.
       HINWEIS: Hier ist die Eingewöhnungszeit (in der Regel 2-3 Tage) abgeschlossen und die Messungen des Energieverbrauchs können beginnen.
4. Indirekte Kalorimetrie und Aktivitätsmessungen zur Bewertung des Energieverbrauchs
   1. Messen Sie das Körpergewicht, das Fett und die magere Masse aller Mäuse, bevor Sie mit den Messungen beginnen.
      HINWEIS: Dies sind die Körpergewichts- und Magermassewerte, die zur Durchführung von ANCOVA-Analysen verwendet werden.
   2. Kalibrieren Sie den _{O2- und CO2-Zirkonoxid-basierten} Detektor des CLAMS-Systems (siehe Materialtabelle) mit der empfohlenen Sauerstoffkonzentration; Kalibrieren Sie den Detektor immer neu, bevor Sie ein neues Experiment starten.
   3. Verwenden Sie ein Kalibriergas bekannter Zusammensetzung (20,50% Sauerstoff und 0,50% _CO2).
      HINWEIS: Gasversorger bezeichnen dieses Gas oft als "Primary Standard Grade".
   4. Schalten Sie ein und stellen Sie sicher, dass der Ausgangsdruck des Tanks bei 5-10 psi liegt.
   5. Öffnen Sie die Calibration Utility-Software zum Kalibrieren und Testen der Gassensoren (Abbildung 2E). Klicken Sie auf Experiment und dann auf Kalibrieren.
   6. Drücken Sie Start. Warten Sie dann, bis die Sensoren getestet wurden und die Software den Benutzer auffordert, die Knöpfe des Gassensors zu drehen (Abbildung 2F), bis der Wert der _{O2-Identität} 1 ist (Abbildung 2G-H). Klicken Sie auf Weiter, wenn der Schritt abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Wenn das Kalibrierungsdienstprogramm alle aktuellen Schritte ausführt, fährt die Kalibrierung automatisch mit dem nächsten Schritt fort, wenn der Fortschrittsbalken gefüllt ist.
   7. Überprüfen Sie die Kalibrierungsergebnisse, wenn alle Schritte abgeschlossen sind und die Ergebnisse angezeigt werden.
   8. Schalten Sie das Kalibriergas aus.
   9. Wechseln Sie die Nahrung und fügen Sie ausreichend Nahrung für einen Zeitraum von 48-72 h hinzu.
      HINWEIS: Obwohl Käfige während der Energieverbrauchsmessungen geöffnet werden könnten, um das Körpergewicht zu überwachen und das Futter täglich zu wechseln, können Mäuse durch diese Manipulationen gestresst werden, und Messungen gehen verloren, wenn die Käfige geöffnet werden. Daher wird empfohlen, manipulationen während des Messzeitraums zu vermeiden.
   10. Klicken Sie in der Software auf Experiment und dann auf Ausführen , um die Sauerstoff-, _CO2 - und Aktivitätsmessungen zu starten (Abbildung 3A).
       HINWEIS: Die Ausführung der Messungen kann in Echtzeit in einem Feld im unteren linken Bereich der Software verfolgt werden (rotes Rechteck, Abbildung 3B). Das rote Rechteck in Abbildung 3B zeigt, dass das System Käfig Nr. 1 in Intervall Nr. 3 misst, nämlich der 3. Messung. Eine Messung in einem Käfig kann ca. 1 min dauern. So kann bei 12 angeschlossenen Käfigen der Sauerstoffverbrauch etwa alle 12 Minuten gemessen werden. Kontinuierliche Messungen für mindestens 48 h werden empfohlen.
   11. Beenden Sie den Versuch, indem Sie auf Experiment und dann auf Beenden klicken (Abbildung 3C).
   12. Öffnen Sie die Käfige, wiegen Sie die Mäuse und das Futter. Sammeln Sie den Kot, um die Anzahl der Kalorien und Lipide zu berechnen, die über den Messzeitraum von 48-72 h ausgeschieden werden.
       HINWEIS: Kot kann bei -20 °C für spätere Analysen gelagert werden. Diese Käfige können nicht effektiv zum Sammeln von Urin verwendet werden.
   13. Klicken Sie auf Experimente, dann auf Exportieren und exportieren Sie alle Probanden als CSV-Datei (Abbildung 3D).
       HINWEIS: Um ANCOVA-Analysen zu erleichtern, ist es wichtig, rohe Sauerstoffverbrauchs- (_VO2) und _{CO2-Produktionswerte} (_VCO2) zu exportieren, ohne durch das Körpergewicht normalisiert zu werden.
5. Datenanalyse und Qualitätskontrolle
   1. Verwenden Sie im exportierten CSV-Blatt (Abbildung 3D) (ab Schritt 1.4.13) die Rohwerte des Sauerstoffverbrauchs (_VO2) und der _{CO2-Produktion} (VCO2), die alle 12 Minuten in den 2-3 Tagen gemessen werden und von der Software automatisch aufgelistet werden und einen Zeitstempel enthalten, nämlich die Stunde und das Datum, an dem sie gemessen wurden.
      HINWEIS: _VO2 - und _VCO2-Werte werden automatisch korrigiert, wenn Körpergewichts- oder Magermassewerte addiert werden.
   2. Verwenden Sie im exportierten CSV-Blatt die Rohwerte des Atemaustauschverhältnisses (RER: _VCO2/_VO2), die von der Software automatisch berechnet und entsprechend ihrem Zeitstempel aufgelistet werden.
      HINWEIS: Werte nahe 1 zeigen, dass die Maus hauptsächlich Kohlenhydrate oxidiert, während Werte näher an 0,7 darstellen, dass die Maus hauptsächlich Fett oxidiert. RER über 1 kann während des anaeroben Trainings auftreten, da der Körper mehr _CO2 ausstößt, um die durch Laktat verursachte Azidose auszugleichen. RER höher als 1 kann auf Stress hinweisen. Die exportierte CSV-Datei enthält auch die Rohwerte aus Energieverbrauch (EE) oder Wärmeproduktion in Kalorien pro Minute pro Maus, gemessen alle 12 Minuten in den 2-3 Tagen. Hier enthalten alle aufgelisteten Werte einen Zeitstempel.
   3. Da für eine ANCOVA einzelne EE-Werte pro Maus benötigt werden, wird die EE-Werte zwischen 09:00 und 16:00 Uhr für die helle (Tag-)Phase und 19:00-04:00 Uhr für die dunkle (Nacht-)Phase pro Maus und Tag gemittelt.
      HINWEIS: Dies kann manuell mit Excel oder Graph Pad erfolgen. Durch die Auswahl dieser zwei Zeitfenster wird vermieden, dass die mittleren, allmählichen und instabilen EE-Werte, die dem Hell-Dunkel-Phasenübergang zugeordnet sind, gemittelt werden.
   4. Berechnen Sie für einen Zeitraum von 48 h den Durchschnitt der beiden Tageslichtwerte und der beiden Dunkelphasenwerte pro Maus mit Excel oder Graph Pad.
   5. Um die gesamte körperliche Aktivität zu quantifizieren, verwenden Sie Excel oder Graph Pad, um die x-, y- und z-Balkenbruchzahlen zu summieren, die in den Stoffwechselkäfigen gemessen und in der CSV-Datei für jede Maus aufgeführt sind.
      HINWEIS: Die x,y,z Gesamtaktivität wird berechnet, indem zuerst der Durchschnittswert jedes X, Y, Z pro Maus und Zyklus durchgeführt wird. Dann wird die Summe der durchschnittlichen X-, Y-, Z-Werte pro Maus und Zyklus bestimmt, um die Daten wie in Abbildung 5E darzustellen (der Durchschnitt von 2 Tagen).
   6. Alternativ können Sie die Daten darstellen, die jeden Messwert im Laufe der Zeit zeigen, wodurch Kurven generiert werden, die die Änderungen der EE während des Übergangs von hellen zu dunklen Zyklen veranschaulichen.
      HINWEIS: Bitte beachten Sie den Diskussionsabschnitt darüber, wie und wann ANCOVA-Analysen durchzuführen sind, und die verschiedenen Formeln, die zur Berechnung von _VO2, _VCO2 und EE verwendet werden, finden Sie in der Ergänzenden Datei 1.

2. Messung der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie zu verbrauchen

1. Richten Sie die Messungen und Mausbehandlungen ein. Siehe Schritt 1 für Einzelheiten zu den experimentellen Präparaten zur Überwachung des Sauerstoffverbrauchs, da die thermogene Kapazität in Adipozyten indirekt durch den Sauerstoffverbrauch nach den Schritten 2.1.1-2.2.2 bestimmt wird.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine Mausanästhesie und eine akute Behandlung mit dem Beta-3-Rezeptoragonisten CL-316,243 (siehe Materialtabelle), was eine schnelle Beurteilung der thermogenen BA-Kapazität ermöglicht.
   1. Führen Sie eine Analyse der Körperzusammensetzung durch und wiegen Sie die Mäuse. Schalten Sie das CLAMS ein, stellen Sie die Temperatur auf 30 °C (Thermoneutralität) ein und warten Sie 2 h, bis sich das gesamte System erwärmt hat.
   2. Richten Sie die restlichen Assay-Bedingungen ein, einschließlich Licht, weisen Sie jedem Käfig die Maus-ID zu und addieren Sie den Körpergewichtswert jeder Maus im entsprechenden Käfig, wenn kein Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen beobachtet wird.
   3. Kalibrieren Sie den Sauerstoff-/_CO2-Detektor gemäß den Schritten 1.4.2-1.4.7.
   4. Starten Sie das Experiment in der Software.
   5. Injizieren Sie jeder Maus Pentobarbital (60-120 mg/kg) und legen Sie jede Maus in den ihr zugewiesenen Stoffwechselkäfig (Schritt 2.1.2).
      HINWEIS: Die Dosis von Pentobarbital, die erforderlich ist, um Mäuse bei Thermoneutralität (30 °C) schlafen zu lassen, variiert je nach Mausstamm und Genotyp. Es wird empfohlen, verschiedene Pentobarbital-Dosen von 50 bis 120 mg/kg zu testen und diejenige zu wählen, die die Maus während 2-3 h bei 30 °C betäubt. Eine effiziente Anästhesie ist unerlässlich, um den Beitrag körperlicher Aktivität zum Energieverbrauch zu beseitigen.
   6. Um eine Anästhesie zu gewährleisten, beobachten Sie Mäuse nach der Pentobarbital-Injektion, bis sie vollständig schlafen und ihr verminderter Sauerstoffverbrauch stetig wird.
   7. Warten Sie, um mindestens 3 stabile aufeinanderfolgende Sauerstoffverbrauchsraten zu erhalten, bevor Sie CL-316.243 injizieren.
      HINWEIS: Während Sie auf die Stabilisierung des Sauerstoffverbrauchs warten, bereiten Sie die Spritzen mit CL-316.243 für jede Maus (1 mg/kg) vor.
   8. Öffnen Sie Käfig Nr. 1 und injizieren Sie CL-316.243 subkutan unmittelbar nach einer _VO2 - und _VCO2-Messung in Käfig Nr. 1. Bringen Sie die Maus unmittelbar nach der Injektion in Käfig Nr. 1 zurück.
      HINWEIS: Die Messungen werden in Echtzeit im unteren linken Bereich der Software angezeigt (Abbildung 3B, rotes Rechteck).
   9. Warten Sie, bis Käfig Nr. 2 gemessen wurde (Abbildung 3B, rotes Rechteck), und fahren Sie dann wie in Schritt 2.1.8 für Käfig Nr. 2 fort.
      HINWEIS: Die Injektion von CL-316,243 unmittelbar nach einer Messung ermöglicht es, die Zeit zwischen den Injektionen konstant zu halten. Zum Beispiel, wenn 12 Mäuse / Käfige laufen, mit Messungen in einzelnen Käfigen nacheinander gesammelt und die Sammlung dauert 55 s pro Käfig, dann sollten Sie eine Maus pro Minute injizieren. Bei diesen Injektionsraten erfolgt die erste Messung nach 12 minuten nach der Injektion in allen 12 Käfigen.
   10. Setzen Sie die Energieverbrauchsmessungen fort, bis die Energieaufwandswerte für 5-6 aufeinanderfolgende Messungen, normalerweise 90-180 Minuten nach der Injektion, ein Plateau erreicht haben.
       HINWEIS: Mäuse könnten während der Experimente aus der Narkose aufwachen. Diese Mäuse müssen aus der Analyse entfernt werden. Daher wird das Testen der Pentobarbital-Dosen im Voraus die Effizienz der Studien erhöhen.
   11. Stoppen Sie die Energieverbrauchsmessungen, aber halten Sie mäuse in ihren Käfigen bei 30 ° C, bis sie aufwachen.
   12. Nachdem die Mäuse vollständig wach sind, untersuchen Sie die Gesundheit der Mäuse und bringen Sie sie in ihre ursprünglichen Käfige zurück.
   13. Exportieren Sie die Daten jeder Maus als CSV-Datei mit der Gerätesoftware, wie in Abschnitt 1.4.13 beschrieben.
2. Datenanalyse
   HINWEIS: Die Datenanalyse wurde von Excel oder Graphpad durchgeführt
   1. Zeichnen Sie die 3-5 aufeinanderfolgenden Werte von _VO2, _VCO2 und EE auf, die im Laufe der Zeit stabil und konstant sind, da dies die Werte sind, die die Stoffwechselrate darstellen, wenn Mäuse vollständig betäubt sind.
   2. Zeichnen Sie dann die ersten und die folgenden aufeinanderfolgenden _VO2-, _VCO2- und EE-Messungen nach der Injektion auf.
      ANMERKUNG: Die absoluten Werte von EE und der durch Injektion induzierte Falzanstieg der EE zeigen die thermogene Funktion ^{von BA an7}.

Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt _VO2-, VCO2-, Wärmeproduktions-/Energieverbrauchs- (EE), Atemaustauschverhältnis (RER) und X-, Y-, Z-Werte für körperliche Aktivität, die mit den Stoffwechselkäfigen des CLAMS-Systems ermittelt wurden. Die vom CLAMS-System bereitgestellten _VO2 und _VCO2 sind das Gasvolumen (ml) pro Minute und können bereits durch eingabe dieser Gewichtswerte in der CLAMS-Software vor Beginn der Messungen durch das Körpergewicht oder die Mage...

Diskussion

Die indirekte Kalorimetrie wird seit Jahren zur Beurteilung des Gesamtkörperenergieverbrauchs ^eingesetzt4. Dieses hierin beschriebene Protokoll bietet eine einfache Methode zur Messung des Grundumsatzes und zur Bestimmung der thermogenen BA-Kapazität in vivo unter Verwendung von Stoffwechselkäfigen.

Das hier beschriebene indirekte Kalorimetrieverfahren bestätigt, dass die Division von Energieaufwandswerten durch Körpergewichtswerte irreführend sein kann. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration