JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיקרוטובולים, שהם פולימרי טובולין, ממלאים תפקיד מכריע כמרכיב שלד ציטוקריוטי בתאים אאוקריוטים וידועים בחוסר היציבות הדינמי שלהם. מחקר זה פיתח שיטה להפרדת מיקרוטובולים כדי להפריד אותם למיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וטובולין חופשי כדי להעריך את יציבותם של מיקרוטובולים ברקמות עכבר שונות.

Abstract

מיקרוטובולים, המורכבים מדימרים α/β-טובולין, הם מרכיב חיוני של שלד הציטו-שלד בתאים איקריוטים. פולימרים דמויי צינור אלה מפגינים חוסר יציבות דינמית כאשר תת-יחידות הטרודימר טובולין עוברות פילמור חוזר ונשנה ודה-פולימריזציה. בקרה מדויקת של יציבות ודינמיקה של מיקרוטובולים, המושגת באמצעות שינויים לאחר תרגום טובולין וחלבונים הקשורים למיקרוטובול, חיונית לתפקודים תאיים שונים. תפקוד לקוי במיקרוטובולים מעורב מאוד בפתוגנזה, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות. המחקר המתמשך מתמקד בחומרים טיפוליים ממוקדי מיקרוטובולים המווסתים את היציבות, ומציעים אפשרויות טיפול פוטנציאליות למחלות וסוגי סרטן אלה. כתוצאה מכך, הבנת המצב הדינמי של מיקרוטובולים חיונית להערכת התקדמות המחלה וההשפעות הטיפוליות.

באופן מסורתי, דינמיקה של מיקרוטובולים הוערכה במבחנה או בתאים בתרבית באמצעות שבירה גסה או אימונואסיה, תוך שימוש בנוגדנים המכוונים לשינויים שלאחר תרגום של טובולין. עם זאת, ניתוח מדויק של מצב טובולין ברקמות באמצעות הליכים כאלה מציב אתגרים. במחקר זה פיתחנו שיטה פשוטה וחדשנית להפרדת מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים לאביליים וטובולין חופשי ברקמות עכבר.

ההליך כלל הומוגניזציה של רקמות עכבר מנותחות במאגר מייצב מיקרוטובול ביחס נפח של 19:1. לאחר מכן חולקו ההומוגנטים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי לאחר צנטריפוגה איטית ראשונית (2,400 × גרם) כדי לפנות פסולת. שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (100,000 × גרם) זירז מיקרוטובולים יציבים, בעוד שהסופרנאטנט שהתקבל היה נתון לשלב אולטרה-צנטריפוגה שני (500,000 × גרם) לשבר מיקרוטובולים לאביליים ודימרים מסיסים. שיטה זו קבעה את הפרופורציות של טובולין המהווה microtubules יציב או labile במוח העכבר. בנוסף, נצפו שינויים ברורים ברקמה ביציבות המיקרוטובולים שהיו בקורלציה עם יכולת ההתרבות של התאים המרכיבים. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל המשמעותי של שיטה חדשנית זו לניתוח יציבות מיקרוטובולים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

מיקרוטובולים (MTs) הם מבנים צינוריים מוארכים הכוללים פרוטופילמנטים המורכבים מתת-יחידות הטרודימר α/β-טובולין. הם ממלאים תפקידים חיוניים בתהליכים תאיים שונים כגון חלוקת תאים, תנועתיות, תחזוקת צורה והובלה תוך-תאית, מה שהופך אותם למרכיבים אינטגרליים של שלד התא האיקריוטי1. הקצה המינוס של MTs, שבו תת-היחידה α-טובולין נחשפת, יציב יחסית, ואילו ה-plus-end, שבו תת-היחידה β-טובולין נחשפת, עובר דה-פולימריזציה דינמית ופילמור2. מחזור מתמשך זה של חיבור דימר טובולין ודיסוציאציה בקצה הפלוס, המכונה חוסר יציבות דינמי, גורם לתהליך חוזר ונשנה של הצלה וקטסטרופה3. MTs מציגים תחומי מוקד עם וריאציות מקומיות באי יציבות דינמית, כולל תחומים יציבים ושפתיים4.

בקרה מדויקת של חוסר היציבות הדינמית של MTs חיונית לתפקודים תאיים רבים, במיוחד בתאי עצב המאופיינים במורפולוגיות מורכבות. יכולת ההסתגלות והעמידות של MTs ממלאים תפקיד חיוני בהתפתחות ובתפקוד תקין של תאי עצב 5,6,7. חוסר היציבות הדינמי של MTs נמצא קשור לשינויים שונים לאחר תרגום (PTM) של טובולין, כגון אצטילציה, זרחון, פלמיטוילציה, דטרוזינציה, דלתא 2, חמצון פוליגלוטמין ופוליגליצילציה. בנוסף, קשירת חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) משמשת כמנגנון ויסות8. PTMs, למעט אצטילציה, מתרחשים בעיקר באזור מסוף קרבוקסי טובולין הממוקם על פני השטח החיצוניים של MTs. שינויים אלה יוצרים תנאי שטח מגוונים ב- MTs, משפיעים על האינטראקציה שלהם עם MAPs ובסופו של דבר שולטים ביציבות MT9. נוכחותם של שאריות טירוזין מסוף קרבוקסי ב-α-טובולין מעידה על MTs דינמיים, המוחלפים במהירות על ידי בריכת טובולין חופשית. לעומת זאת, דה-טירוזינציה של מסוף הקרבוקסי ואצטילציה של Lys40 מסמנים MTs יציבים עם פחות יציבות דינמית 9,10.

PTMs של טובולין שימשו באופן נרחב בניסויים כדי להעריך את הדינמיקה והיציבות של MTs 5,7,11,12,13,14,15. לדוגמה, במחקרי תרביות תאים, ניתן להפריד טובולינים לשתי בריכות: בריכת טובולין חופשית ובריכת MT. זה מושג על ידי שחרור טובולין חופשי דרך חדירת תאים לפני תיקון MTs 15,16,17,18,19 הנותרים. שיטות ביוכימיות כוללות שימוש במייצבי MT כימיים המגינים על MTs מפני אסון, ומאפשרים הפרדה של MTs וטובולין חופשי באמצעות צנטריפוגה20,21,22. עם זאת, הליכים אלה אינם מבדילים בין MTs יציבים ופחות יציבים (labile), ובכך הופכים את זה לבלתי אפשרי לכמת MTs או טובולין מסיס ברקמות כמו המוח. כתוצאה מכך, הערכת יציבות MT באורגניזמים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים הוכחה כמאתגרת. כדי להתמודד עם מגבלה ניסיונית זו, פיתחנו טכניקה חדשנית להפרדה מדויקת של MTs וטובולין חופשי ברקמת עכבר23.

שיטת שבירת MT ייחודית זו כוללת הומוגניזציה של רקמות בתנאים השומרים על מצב טובולין ברקמות וצנטריפוגה דו-שלבית להפרדת MTs יציבים, MTs labile וטובולין חופשי. הליך פשוט זה יכול להיות מיושם במחקרים רחבים, כולל מחקר בסיסי על MTs ו- MAPs באורגניזמים חיים, ניתוחים פיזיולוגיים ופתולוגיים של בריאות ומחלות הקשורות ליציבות MT, ופיתוח תרופות וטיפולים אחרים המכוונים ל- MTs.

Protocol

1. שיטת שבר MT

הערה: כל הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת דושישה. עכברי C57BL/6J משני המינים, בני 3-4 חודשים, שימשו כאן. בפרוטוקול זה, רקמות שנותחו, כגון מוח, כבד או בלוטת התימוס, עברו הומוגניות מיידית במאגר מייצב מיקרוטובול קר כקרח (MSB), שהכיל טקסול (מייצב MT) בריכוז שמנע לא רק דה-פולימריזציה אלא גם רה-פילמריזציה של MT. ההומוגנט הופרד לשלושה שברים בתהליך אולטרה-צנטריפוגה דו-שלבי (איור 1). כל השלבים בפרוטוקול זה הושלמו ללא הפרעה בסביבה בטמפרטורה קרירה, והרקמות והשברים לא הוקפאו עד שהומסו במאגר דגימת נתרן דודציל סולפט (SDS).

  1. הכנת MSB ומיקרו-צינוריות
    1. להכנת MSB, ערבבו את הריאגנטים הבאים: 0.1 M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), pH 6.8 (מנוטרל על ידי KOH), 10% גליצרול, 0.1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0.5% Triton X-100, מעכבי phosphatase (1 mM NaF, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 0.5 μM חומצה אוקדאית), 1x קוקטייל מעכב פרוטאז, ומעכבי פרוטאז (0.1 mM PMSF, 0.1 mM DIFP, 1 μg/mL pepstatin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin, 50 μg/mL TLCK) (ראה טבלת חומרים) ומסומנים כ-MSB(-).
    2. ממש לפני דיסקציה של רקמות, הוסף 10 מיקרומטר טקסול ו-2 מילימטר GTP (ראה טבלת חומרים) ל-MSB(-). מאגר זה מסומן כ- MSB(+). הכינו את החיץ ביום השימוש ושמרו אותו על קרח.
    3. הכינו את המיקרו-צינוריות לדגימה. מיקרו-צינור ריק של 2.0 מ"ל לאחסון הומוגני; מיקרו-צינור ריק של 1.5 מ"ל עבור סופר-נטנט1 (S1) ליזט, דגימת משקע2 (P2) ואחסון דגימה של precipitate3 (P3); מיקרו-צינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS) לאחסון רקמות מנותחות; מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל עם 200 מיקרוליטר של חיץ דגימת SDS כפול (0.16 M Tris pH 6.8; 20% גליצרול; 2% 2-מרקפטואתנול; 4% SDS) עבור דגימת S1 ואחסון דגימות סופר-נטנט3 (S3); ומיקרו-צינור צנטריפוגה עבור רוטורי צנטריפוגות TLA55 ו-TLA120.2 (ראה טבלת חומרים). תייגו את כל הצינורות והניחו אותם על קרח.
  2. הומוגניזציה של רקמת עכבר
    1. הכינו שולחן צונן לדיסקציה של רקמות. ראשית, מלאו קופסה בקרח כתוש והניחו שתי צלחות פטרי על קרח, אחת עם הצד הפנימי למעלה והשנייה עם הצד החיצוני. מלאו PBS קר כקרח בצלחת אחת לשטיפה ארעית ואחסון של רקמות מנותחות. הניחו נייר פילטר רטוב עם PBS על צלחת אחרת הפוכה.
    2. כדי להקריב עכבר, לבצע נקע צוואר הרחם תחת הרדמה עמוקה עם הרדמה מעורבת של butorphanol, midazolam, ו medetomidine. לאחר מכן, נתחו מיד את הרקמות, למשל המוח, הכבד או בלוטת התימוס, ושטפו אותן עם PBS קר כקרח בצלחת פטרי.
      הערה: ניתן לנתח כל סוג של רקמה רכה בשיטה זו. עם זאת, גודל הרקמה מוגבל על ידי טווח הנפח המומלץ של הומוגנייזר בשימוש. לדוגמה, אם נעשה שימוש בנפח 2 מ"ל של הומוגנייזר, מומלץ 50-100 מ"ג רקמה.
    3. לאחר שקילת המיקרו-צינוריות בנפח 1.5 מ"ל המלאות ב-PBS לאחסון רקמות מנותחות, חתכו ואחסנו רקמות בתוך המיקרו-צינוריות, ושקלו מחדש כל מיקרו-צינור. ניתן לחשב את משקלה הרטוב של כל רקמה על ידי הפחתת משקל הצינור לפני ואחרי הוספת הרקמה.
    4. הומוגניזציה מיידית של הרקמה ב- MSB קר כקרח(+) עם הומוגנייזר צונן (ראה טבלת חומרים). נפח MSB(+) היה פי 19 (μL) מהמשקל הרטוב של הרקמה (mg). בצע הומוגניזציה עם 20 שבץ עד חתיכות הרקמה להיעלם.
      הערה: לדוגמה, 1,900 μL של MSB(+) משמש עבור 100 מ"ג רקמה. מכיוון שיש להתאים את נפח MSB(+) שיש להוסיף לכל משקל רטוב של חלקי הרקמה שנותחו, יש צורך לשקול כל פיסת רקמה במדויק.
  3. צנטריפוגה של רקמת העכבר הומוגנאטים
    1. העבר את כל ההומוגנט למיקרו-צינור של 2 מ"ל עם פיפטה פסטר וצנטריפוגה ב 2,400 × גרם למשך 3 דקות ב -2 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הפסולת באמצעות משקעים.
    2. מעבירים את כל הסופרנאטנט (חלק S1) למיקרו-צינור ומערבולת חדשים בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן, aliquot 200 μL של שבר S1 לתוך מיקרו-צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100,000 × גרם באמצעות רוטור TLA-55 במשך 20 דקות ב 2 ° C כדי לקבל את חלבוני המשקל המולקולרי הגדול יחסית כמשקע (שבר P2).
      הערה: נפח הדגימה הנתונה לשלבי האולטרה-צנטריפוגה משפיע על רדיוס הצנטריפוגה ועל יעילות המשקעים של המולקולות. שמור על נפח הדגימה על 200 μL או פחות לאחר שלב זה כדי למנוע שבירה לא מדויקת.
    3. צנטריפוגה נוספת של כל הסופרנאטנט המתקבל (שבר S2) במהירות של 500,000 × גרם באמצעות רוטור TLA-120.2 למשך 60 דקות ב-2°C כדי להפריד את קומפלקסי החלבונים הבלתי מסיסים במשקע (מקטע P3) מחלבונים מסיסים בסופרנאטנט (שבר S3).
    4. הוסף 400 μL של חיץ דגימת SDS 1x (0.08 M Tris pH 6.8; 10% גליצרול; 1% 2-מרקפטואתנול; 2% SDS) לצינורות השבר P2 ו- P3 וסונק לזמן קצר כדי להמיס את המשקע. העבר דגימות שבר אלה למיקרו-צינור ריק של 1.5 מ"ל.
    5. המס את מקטע S3 הכולל ב- 200 μL של מאגר דגימת SDS 2x.
    6. ערבב את שברי S1 הנותרים עם נפח שווה של 2x מאגר דגימת SDS לשימוש כעקומה סטנדרטית עבור כתמים מערביים.
    7. מרתיחים את כל הדגימות הללו ב 100 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
  4. כימות חלבונים בכל שבר
    1. כימות חלבונים בשברים P2, P3 ו-S3 על ידי כתמים מערביים. ראשית, השתמש באלקטרופורזה של ג'ל 10% SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) כדי להפריד חלבונים ממדוללים כראוי של שברי P2, P3 ו- S3, ודגימת S1 מדוללת סדרתית מכל אדם כעקומה סטנדרטית. לאחר מכן, אלקטרובלוט הדגימות על קרום פוליווינילידן פלואוריד (ראה טבלת חומרים).
      הערה: יחס הדילול של כל שבר תלוי בריכוז של חלבון אובייקטיבי ובתגובתיות של הנוגדן. (לדוגמה, α-טובולין, TUBB3, β-tubulin וטירוזין ברקמת המוח: S3 = 1/400, P3 = 1/2,000, P2 = 1/2,000, P2 = 1/2,000, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000; טובולין אצטילט ברקמת המוח: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8,000, S1 = 1/100,000, 1/40,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/4,000; α-טובולין בכבד: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000; α-טובולין בבלוטת התימוס: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50,000, 1/20,000, 1/10,000, 1/5,000, 1/2,000 דילול ריכוז הרקמות).
    2. חסום את הממברנה עם 5% חלב דל שומן במי מלח חוצצים של Tris (50 mM Tris-HCl pH 7.6; 152 mM NaCl) עם 0.1% Tween 20 (TBS-T) למשך יותר מ-30 דקות.
    3. יש לטבול את הממברנה ב-TBS-T המכיל נוגדן ראשוני (ראו טבלת חומרים) במשך יותר משעתיים. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם TBS-T במשך 3 דקות (3 פעמים).
    4. יש לתייג נוגדנים ראשוניים באמצעות נוגדנים משניים מצומדים של HRP (ראו טבלת חומרים) ב-TBS-T במשך יותר משעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם TBS-T במשך 3 דקות (3 פעמים).
    5. לפתח את הממברנות עם מגיב Chemiluminescence משופר. לאחר מכן, נתח את הפסים המעניינים באמצעות מנתח תמונות זוהר (ראה טבלת חומרים).
    6. כמת את עוצמות רצועת החלבונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים) וצור עקומה סטנדרטית על ידי התוויית יחידות הדילול של דגימות S1 המדוללות המשמשות לעקומה הסטנדרטית לאורך ציר X ועוצמות הפס לאורך ציר Y.
    7. קרא את ריכוז החלבון (יחידה) המתאים לדגימות השבר המדולל. הכפל את הריכוז הנקרא עם גורם דילול הדגימה כדי לקבל יחידת חלבון בכל שבר. חלק את היחידה הנמדדת של כל שבר ביחידת החלבון הכוללת (P2 + P3 + S3) כדי לקבל אחוז.

2. הערכת המאפיינים של טובולין בכל שבר

הערה: שיטה ביוכימית זו מספקת שלוש קבוצות של קומפלקסים טובולין המוגדרים על ידי תכונות שיקוע. כאן, המצב של מתחמי טובולין המתקבלים בשברים אלה זוהה בהתבסס על גודל הקומפלקס וטובולין-PTMs. השלם את כל השלבים בפרוטוקול זה ללא הפרעה בסביבה עם טמפרטורה קרירה, אך אל תקפיא את דגימות השברים עד שהן מומסות במאגר דגימת SDS.

  1. בדיקת השמנת מסנן
    1. סנן את שברי S2 ו- S3 (500 μL כל אחד) באמצעות עמודת סיבוב אולטרה-סינון של 300 kDa (ראה טבלת חומרים). בצעו צנטריפוגה של 14,000 × גרם ב-2°C עד שכל הסופרנאטנט מסונן, חלבונים מדוללים נאספים לצינורות מקלט, וחלבונים לכודים נשארים על המסנן של צינורות המאגר.
    2. תרגם את כל התסנין (כ- 500 μL) בצינורות מקלט למיקרו-צינורות חדשים של 1.5 מ"ל והמיס אותם ב- 500 μL של חיץ דגימת SDS 2x.
    3. יש להמיס את השאריות על מסנן צינורות המאגר ב-1,000 μL של מאגר דגימת SDS 1x על ידי צנרת והעברת הדגימות למיקרו-צינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    4. מרתיחים את הדגימות ב 100 ° C במשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
    5. לנתח את כמויות טובולין על ידי כתם מערבי עם DM1A (נוגדן נגד α-טובולין, ראה טבלת חומרים).
  2. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל
    1. הכינו את מאגר הנשא (0.1 M MES, pH 6.8; 10% גליצרול; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0.1 mM DTT) בתוספת ריכוז 1/10 של מעכבי פרוטאז ופוספטאז כמתואר בשלב 1.1.1. לאחר מכן, סנן את הפתרון ואחסן אותו בסביבה קרה.
    2. הכינו עמודת כרומטוגרפיה לסינון ג'ל המצוידת במערכת כרומטוגרפיה נוזלית מכינה בתא כרומטוגרפיה (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C.
    3. לפני הזרקת דגימות על העמודה, זרימה של 180 מ"ל של חיץ המוביל כדי לשטוף את העמודה. קצב הזרימה הוא 1 מ"ל/דקה למשך 3 שעות.
    4. הזריקו טובולין חזירי מטוהר זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) כבקרה או את מקטע S3 ממוחות עכברים (500 מיקרוליטר כל אחד) על העמודה.
    5. Elute בקצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה עם חיץ מוביל. אסוף את השברים של 1.5 מ"ל למשך 120 דקות. נטר חלבונים מדוללים על ידי ספיגה ב 280 ננומטר. שמור על הלחץ המרבי מתחת ל- 0.3 מגפ"ס.
    6. לאחר ערבול השברים שנאספו, מערבבים 50 μL מהם עם 50 μL של חיץ דגימת SDS 2x במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל. מרתיחים את כל הדגימות בטמפרטורה של 100°C למשך 3 דקות. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C.
    7. לנתח את כמויות טובולין על ידי כתם מערבי עם DM1A, נוגדן אנטי α-טובולין ונוגדן KMX-1, אנטי β-טובולין (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

כימות טובולין בשברים P2, P3 ו-S3 ממוח עכבר בשיטת שבר MT
טובולין ברקמת עכבר הופרד לשברים P2, P3 ו-S3 בשיטת שבר MT וכומת על-ידי כתם מערבי (איור 1A). המשקע של MTs שנשאר בשבר P2 על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב 100,000 × גרם במשך 20 דקות היווה 34.86% ± 1.68% מכלל טובולין במוח עכבר. הסופרנאטנט (S2) ע...

Discussion

המשימה המשמעותית ביותר בעת חקירת מצב טובולין ברקמה מאורגניזמים חיים היא מניעת פילמור MT בשוגג או דה-פולימריזציה במהלך ההכנה. יציבות MTs בדגימות מושפעת מגורמים כגון ריכוז טקסול ב- MSB, שיעור כמות הרקמה לחיץ, והטמפרטורה בתהליך מהסרת רקמות להומוגניזציה וצנטריפוגה. לכן, התנאים היו אופטימליים בכל...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי JST הקמת מלגות אוניברסיטאיות ליצירת חדשנות טכנולוגית מדעית (A.HT.; JPMJFS2145), JST אביב (A.HT.; JPMJSP2129), מענק סיוע לעמיתי JSPS (A.HT; 23KJ2078), מענק סיוע למחקר מדעי (B) JSPS KAKENHI (22H02946 עבור מדיטציה טרנסנדנטלית), מענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים שכותרתו "הזדקנות חלבון המוח ובקרת דמנציה" מ-MEXT (TM; 26117004), ומלגת מחקר של Uehara מקרן הזיכרון של אואהארה (TM; 202020027). המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ML TUBE CASE OF 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT90281:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa ultrafiltration spin columnAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5,000 dilution
ÄKTAprime plusCytiva11001313
anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5,000 dilution
antipainPeptide Institute Inc.4062
aprotininNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning bottle-top vacuum filter systemCorning4307580.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261:5,000 dilution
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter RollPall CorporationBSP0161
glycerolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columnCytiva28-9893-35
Image Gauge Software FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzerFUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
okadaic acidLC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2Beckman Coulter343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)Roche11873580001
Purified tubulin CytoskeletonT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 rotorBeckman Coulter357656
TLA-55 rotorBeckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422

References

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207 (2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837 (2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9 (2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415 (2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved