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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Resumo

Microtúbulos, compostos por dímeros de α/β-tubulina, são um componente crucial do citoesqueleto em células eucarióticas. Esses polímeros semelhantes a tubos exibem instabilidade dinâmica à medida que subunidades heterodímeras de tubulina sofrem polimerização e despolimerização repetitivas. O controle preciso da estabilidade e dinâmica dos microtúbulos, obtido através de modificações pós-traducionais da tubulina e proteínas associadas aos microtúbulos, é essencial para várias funções celulares. Disfunções nos microtúbulos estão fortemente implicadas na patogênese, incluindo doenças neurodegenerativas. A pesquisa em andamento concentra-se em agentes terapêuticos direcionados a microtúbulos que modulam a estabilidade, oferecendo opções potenciais de tratamento para essas doenças e cânceres. Consequentemente, a compreensão do estado dinâmico dos microtúbulos é crucial para avaliar a progressão da doença e os efeitos terapêuticos.

Tradicionalmente, a dinâmica dos microtúbulos tem sido avaliada in vitro ou em células cultivadas através de fracionamento rugoso ou imunoensaio, usando anticorpos visando modificações pós-traducionais da tubulina. No entanto, a análise precisa do estado da tubulina em tecidos usando tais procedimentos impõe desafios. Neste estudo, desenvolvemos um método simples e inovador de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos.

O procedimento envolveu a homogeneização de tecidos dissecados de camundongos em tampão estabilizador de microtúbulos na proporção de volume de 19:1. Os homogeneizados foram então fracionados através de um processo de ultracentrifugação em duas etapas após centrifugação lenta inicial (2.400 × g) para remoção de debris. A primeira etapa de ultracentrifugação (100.000 × g) precipitou microtúbulos estáveis, enquanto o sobrenadante resultante foi submetido a uma segunda etapa de ultracentrifugação (500.000 × g) para fracionar microtúbulos lábeis e dímeros de tubulina solúveis. Este método determinou as proporções de tubulina constituindo microtúbulos estáveis ou lábeis no cérebro de camundongos. Adicionalmente, variações teciduais distintas na estabilidade dos microtúbulos foram observadas que se correlacionaram com a capacidade proliferativa das células constituintes. Esses achados destacam o potencial significativo deste novo método para analisar a estabilidade de microtúbulos em condições fisiológicas e patológicas.

Introdução

Microtúbulos (MTs) são estruturas tubulares alongadas constituídas por protofilamentos constituídos por subunidades heterodímeras de α/β-tubulina. Desempenham papéis essenciais em vários processos celulares, como divisão celular, motilidade, manutenção da forma e transporte intracelular, tornando-se componentes integrantes do citoesqueleto eucariótico1. A extremidade inferior das MTs, onde a subunidade α-tubulina é exposta, é relativamente estável, enquanto a extremidade superior, onde a subunidade β-tubulina é exposta, sofre despolimerização dinâmica e polimerização2. Esse ciclo contínuo de adição e dissociação de dímeros de tubulina na extremidade superior, denominado instabilidade dinâmica, resulta em um processo repetitivo de resgate e catástrofe3. As MTs exibem domínios focais com variações localizadas na instabilidade dinâmica, incluindo domínios estáveis e lábeis4.

O controle preciso da instabilidade dinâmica das MTs é crucial para inúmeras funções celulares, particularmente em neurônios caracterizados por morfologias intrincadas. A adaptabilidade e a durabilidade das MTs desempenham um papel vital no desenvolvimento e funcionamento adequado das células nervosas 5,6,7. A instabilidade dinâmica das MTs tem sido associada a várias modificações pós-traducionais (MPTs) da tubulina, tais como acetilação, fosforilação, palmitoilação, destirosinação, delta 2, oxidação de poliglutamina e poliglicilação. Além disso, a ligação de proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) serve como mecanismo regulatório8. As MPTs, excluindo a acetilação, ocorrem predominantemente na região carboxi-terminal da tubulina, situada na superfície externa das MTs. Essas modificações criam diversas condições de superfície nas MTs, influenciando sua interação com as MAPs e, em última análise, governando a estabilidade das MTs9. A presença de um resíduo de tirosina carboxi-terminal na α-tubulina é indicativa de MTs dinâmicas, que são rapidamente substituídas pelo pool de tubulina livre. Por outro lado, a destirosinação do terminal carboxi e a acetilação de Lys40 significam MTs estáveis com reduzida instabilidade dinâmica 9,10.

As MPTs da tubulina têm sido extensivamente empregadas em experimentos para avaliar a dinâmica e estabilidade de MTs 5,7,11,12,13,14,15. Por exemplo, em estudos de cultura celular, as tubulinas podem ser segregadas em dois pools: o pool de tubulina livre e o pool de MT. Isso é conseguido liberando-se tubulina livre através da permeabilização celular antes da fixação das MTs remanescentes 15,16,17,18,19. Os métodos bioquímicos envolvem o uso de estabilizantes químicos de MT que protegem MTs de catástrofes, possibilitando a separação de MTs e tubulina livre através de centrifugação20,21,22. No entanto, esses procedimentos não diferenciam entre MTs estáveis e menos estáveis (lábeis), tornando impossível quantificar MTs ou tubulina solúvel em tecidos como o cérebro. Consequentemente, avaliar a estabilidade da MT em organismos sob condições fisiológicas e patológicas tem se mostrado um desafio. Para resolver essa limitação experimental, desenvolvemos uma nova técnica para separar com precisão MTs e tubulina livre em tecido decamundongos23.

Este método único de fracionamento de MT envolve homogeneização de tecidos sob condições que mantêm o status de tubulina nos tecidos e centrifugação em duas etapas para separar MTs estáveis, MTs lábeis e tubulina livre. Este procedimento simples pode ser aplicado a estudos amplos, incluindo pesquisa básica sobre MTs e MAPs em organismos vivos, análises fisiológicas e patológicas de saúde e doenças associadas à estabilidade de MT, e desenvolvimento de drogas e outras terapêuticas que visam MTs.

Protocolo

1. Método de fracionamento MT

NOTA: Todos os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Doshisha. Camundongos C57BL/6J de ambos os sexos, com 3-4 meses de idade, foram usados aqui. Nesse protocolo, os tecidos dissecados, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, foram imediatamente homogeneizados em tampão estabilizador de microtúbulos (MSB) gelado, que continha Taxol (estabilizador de MT) em uma concentração que impedia não apenas a despolimerização, mas também a repolimerização da MT. O homogeneizado foi separado em três frações por um processo de ultracentrifugação em duas etapas (Figura 1). Todas as etapas deste protocolo foram concluídas sem interrupção em ambiente de temperatura fria, e os tecidos e frações não foram congelados até que fossem dissolvidos em tampão de amostra dodecil sulfato de sódio (SDS).

  1. Preparo de MSB e microtubos
    1. Para preparar MSB, misturar os seguintes reagentes: 0,1 M 2-(N-morfolino)ácido etanossulfônico (MES), pH 6,8 (neutralizado por KOH), 10% glicerol, 0,1 mM TDT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, inibidores de fosfatase (1 mM NaF, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO 4, 0,5 μM ácido ocadaico), 1x coquetel inibidor de protease, e inibidores de protease (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/mL pepstatin, 1 μg/mL antipain, 10 μg/mL aprotinina, 10 μg/mL leupeptina, 50 μg/mL TLCK) (ver Tabela de Materiais) e denotam como MSB(-).
    2. Imediatamente antes da dissecção do tecido, adicione 10 μM de Taxol e 2 mM de GTP (ver Tabela de Materiais) ao MSB(-). Esse buffer é indicado como MSB (+). Prepare o tampão no dia do uso e mantenha-o no gelo.
    3. Prepare os microtubos para amostragem. Microtubo vazio de 2,0 mL para armazenamento homogeneizado; microtubo vazio de 1,5 mL para armazenamento do sobrenadante1 (S1) lisado, precipitado2 (P2) e precipitado3 (P3); 1,5 mL de microtubo com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) para armazenamento do tecido dissecado; 1,5 mL de microtubo com 200 μL de tampão 2x SDS-amostra (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerol; 2% 2-mercaptoetanol; 4% SDS) para armazenamento da amostra S1 e sobrenadante3 (S3); e microtubo de centrifugação para rotores centrífugos TLA55 e TLA120.2 (ver Tabela de Materiais). Rotule todos os tubos e coloque-os no gelo.
  2. Homogeneização de tecido de camundongo
    1. Prepare uma mesa gelada para dissecção de tecido. Primeiro, encha uma caixa com gelo esmagado e coloque duas placas de Petri no gelo, uma com o lado interno para cima e a outra com o lado externo. Encha PBS gelado em um prato para lavagem transitória e armazenamento de tecidos dissecados. Coloque papel filtro umedecido com PBS em outro prato virado.
    2. Para sacrificar um camundongo, realizar luxação cervical sob anestesia profunda com um anestésico misto de butorfanol, midazolam e medetomidina. Em seguida, disseque imediatamente os tecidos, por exemplo, cérebro, fígado ou timo, e lave-os com PBS gelado em uma placa de Petri.
      NOTA: Qualquer tipo de tecido mole pode ser analisado por este método. No entanto, o tamanho do tecido é limitado pela faixa de volume recomendada do homogeneizador utilizado. Por exemplo, se um volume de 2 mL de homogeneizador é usado, 50-100 mg de tecido é recomendado.
    3. Após pesar os microtubos de 1,5 mL preenchidos com PBS para armazenamento do tecido dissecado, recorte e armazene os tecidos dentro dos microtubos e pese novamente cada microtubo. O peso úmido de cada tecido pode ser calculado subtraindo-se o peso do tubo antes e depois da adição do tecido.
    4. Homogeneizar imediatamente o tecido em MSB gelado(+) com um homogeneizador refrigerado (ver Tabela de Materiais). O volume de MSB (+) foi 19 vezes (μL) o peso úmido do tecido (mg). Realizar homogeneização com 20 golpes até que os pedaços de tecido desapareçam.
      NOTA: Por exemplo, 1.900 μL de MSB (+) é usado para 100 mg de tecido. Como o volume de MSB(+) a ser adicionado deve ser ajustado para cada peso úmido das peças de tecido analisadas, é necessário pesar cada pedaço de tecido com precisão.
  3. Centrifugação de homogeneizados de tecido de camundongo
    1. Mover todo o homogeneizado para um microtubo de 2 ml com uma pipeta de Pasteur e centrifugar a 2.400 × g durante 3 min a 2 °C para remover os detritos por precipitação.
    2. Transferir todo o sobrenadante (fração S1) para um novo microtubo e vórtice de 1,5 mL. Em seguida, aliquote 200 μL da fração S1 em um microtubo de centrifugação e centrifugação a 100.000 × g usando um rotor TLA-55 por 20 min a 2 °C para obter as proteínas de peso molecular relativamente grandes como precipitado (fração P2).
      NOTA: O volume da amostra submetida às etapas de ultracentrifugação afeta o raio de centrifugação e a eficiência de precipitação das moléculas. Manter o volume da amostra a 200 μL ou menos após esta etapa para evitar fracionamento impreciso.
    3. Centrifugar ainda mais todo o sobrenadante resultante (fração S2) a 500.000 × g usando um rotor TLA-120.2 por 60 min a 2 °C para separar os complexos proteicos insolúveis no precipitado (fração P3) das proteínas solúveis no sobrenadante (fração S3).
    4. Adicionar 400 μL de tampão 1x SDS-amostra (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerol; 1% 2-mercaptoetanol; 2% SDS) aos tubos de fração P2 e P3 e sonicar brevemente para dissolver o precipitado. Transfira essas amostras fracionadas para um microtubo vazio de 1,5 mL.
    5. Dissolver a fração S3 total em 200 μL de 2x tampão de amostra SDS.
    6. Misture as frações S1 restantes com um volume igual de buffer de amostra SDS 2x para uso como uma curva padrão para Western blotting.
    7. Ferva todas estas amostras a 100 °C durante 3 minutos. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
  4. Quantificação de proteínas em cada fração
    1. Quantificar proteínas nas frações P2, P3 e S3 por Western blotting. Primeiro, use eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10% (SDS-PAGE) para separar proteínas das frações P2, P3 e S3 adequadamente diluídas e amostra S1 diluída em série de qualquer indivíduo como uma curva padrão. Em seguida, eletroblot as amostras em membranas de fluoreto de polivinilideno (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: A razão de diluição de cada fração depende da concentração de uma proteína objetiva e da reatividade do anticorpo. (por exemplo, α-tubulina, TUBB3, β-tub e tubulina tirosinada no tecido cerebral: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2,000,; 000, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; tubulina acetinada no tecido cerebral: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulina no fígado: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulina no timo: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 diluição da concentração tecidual).
    2. Bloquear a membrana com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) com 0,1% Tween 20 (TBS-T) por mais de 30 min.
    3. Imergir a membrana em TBS-T contendo anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) por mais de 2 h. Em seguida, lave a membrana com TBS-T por 3 min (3 vezes).
    4. Rotular o anticorpo primário usando anticorpos secundários conjugados à HRP (ver Tabela de Materiais) na TBS-T por mais de 1 h. Em seguida, lave a membrana com TBS-T por 3 min (3 vezes).
    5. Desenvolver as membranas com o reagente de quimioluminescência Enhanced . Em seguida, analise as bandas de interesse com um analisador de imagem luminescente (ver Tabela de Materiais).
    6. Quantifique as intensidades da banda de proteínas usando um software de análise de imagem (veja Tabela de Materiais) e crie uma curva padrão plotando as unidades de diluição das amostras S1 diluídas usadas para a curva padrão ao longo do eixo X e as intensidades de banda ao longo do eixo Y.
    7. Ler a concentração de proteínas (unidade) correspondente às amostras de fracção diluída. Multiplique a concentração lida pelo fator de diluição da amostra para obter uma unidade proteica em cada fração. Divida a unidade medida de cada fração pela unidade proteica total (P2 + P3 + S3) para obter uma porcentagem.

2. Avaliação das propriedades da tubulina em cada fração

NOTA: Este método bioquímico fornece três grupos de complexos de tubulina definidos pelas propriedades de sedimentação. Aqui, o status dos complexos de tubulina obtidos nessas frações foi identificado com base no tamanho do complexo e das MPTs tubulinas. Conclua todas as etapas deste protocolo sem interrupção em um ambiente de temperatura fria, mas não congele as amostras de fração até que sejam dissolvidas no tampão de amostra SDS.

  1. Ensaio de armadilha de filtro
    1. Filtrar as frações S2 e S3 (500 μL cada) utilizando uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 kDa (ver Tabela de Materiais). Realizar centrifugação de 14.000 × g a 2 °C até que todo o sobrenadante seja filtrado, as proteínas eluídas sejam coletadas nos tubos receptores e as proteínas aprisionadas permaneçam no filtro dos tubos reservatório.
    2. Traduzir os filtrados inteiros (aproximadamente 500 μL) em tubos receptores em novos microtubos de 1,5 mL e dissolvê-los em 500 μL de 2x tampão de amostra SDS.
    3. Solubilizar os resíduos no filtro dos tubos reservatório em 1.000 μL de tampão de amostra 1x SDS pipetando e transferindo as amostras para um novo microtubo de 1,5 mL.
    4. Ferver as amostras a 100 °C durante 3 min. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
    5. Analise as quantidades de tubulina por Western blotting com DM1A (anticorpo anti-α-tubulina, ver Tabela de Materiais).
  2. Cromatografia de exclusão de tamanho
    1. Preparar o tampão transportador (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glicerol; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM TDT) suplementado com 1/10 concentração de protease e inibidores da fosfatase, conforme descrito no passo 1.1.1. Em seguida, filtre a solução e armazene-a em um ambiente frio.
    2. Preparar uma coluna de cromatografia de filtração em gel equipada com um sistema de cromatografia líquida preparativa numa câmara de cromatografia (ver quadro de materiais) a 4 °C.
    3. Antes de injetar amostras na coluna, escoe 180 mL do tampão transportador para lavar a coluna. O fluxo é de 1 mL/min por 3 h.
    4. Injetar tubulina suína purificada comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) como controle ou a fração S3 de cérebros de camundongos (500 μL cada) na coluna.
    5. Eluir a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min com tampão carreador. Coletar as frações de 1,5 mL por 120 min. Monitorar proteínas eluídas por absorbância a 280 nm. Mantenha a pressão máxima abaixo de 0,3 MPa.
    6. Após vórtex das frações coletadas, misturar 50 μL delas com 50 μL de tampão de amostra 2x SDS em um microtubo de 1,5 mL. Ferva todas as amostras a 100 °C durante 3 min. Depois de as amostras terem arrefecido à temperatura ambiente, conservar as amostras a -20 °C.
    7. Analisar as quantidades de tubulina por Western blotting com DM1A, anticorpo anti-α-tubulina e KMX-1, anticorpo anti-β-tubulina (ver Tabela de Materiais).

Resultados

Quantificação de tubulina nas frações P2, P3 e S3 do cérebro de camundongos pelo método de fracionamento de MT
A tubulina em tecido de camundongo foi separada nas frações P2, P3 e S3 pelo método de fracionamento MT e quantificada por Western blotting (Figura 1A). O precipitado de MTs que permaneceram na fração P2 por ultracentrifugação a 100.000 × g por 20 min representou 34,86% ± 1,68% da tubulina total em cérebro de camundongo. O sobrenadante (S...

Discussão

A tarefa mais significativa ao investigar o estado da tubulina em tecidos de organismos vivos é prevenir a polimerização acidental de MT ou a despolimerização durante a preparação. A estabilidade das MTs nas amostras é afetada por fatores como a concentração de Taxol em MSB, a proporção da quantidade de tecido em tampão e a temperatura durante o processo, desde a remoção do tecido até a homogeneização e centrifugação. Portanto, as condições foram otimizadas em cada etapa do protocolo para análise d...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado, em parte, pela JST: o estabelecimento de bolsas universitárias para a criação de ciência, tecnologia, inovação (A.HT.; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT.; JPMJSP2129), Grant-in-Aid for JSPS Fellows (A.HT.; 23KJ2078), Grant-in-Aid for Scientific Research(B) JSPS KAKENHI (22H02946 for TM), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas intitulado "Brain Protein Aging and Dementia Control" da MEXT (TM; 26117004), e pela Uehara Research Fellowship da Uehara Memorial Foundation (TM; 202020027). Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ML TUBE CASE OF 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT90281:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa ultrafiltration spin columnAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5,000 dilution
ÄKTAprime plusCytiva11001313
anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5,000 dilution
antipainPeptide Institute Inc.4062
aprotininNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning bottle-top vacuum filter systemCorning4307580.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261:5,000 dilution
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter RollPall CorporationBSP0161
glycerolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg columnCytiva28-9893-35
Image Gauge Software FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzerFUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
okadaic acidLC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatinNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2Beckman Coulter343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)Roche11873580001
Purified tubulin CytoskeletonT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 rotorBeckman Coulter357656
TLA-55 rotorBeckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422

Referências

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