Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

Zusammenfassung

Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.

Zusammenfassung

Mikrotubuli, die aus α/β-Tubulin-Dimeren bestehen, sind ein entscheidender Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen. Diese röhrenförmigen Polymere weisen eine dynamische Instabilität auf, da Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten einer repetitiven Polymerisation und Depolymerisation unterzogen werden. Die präzise Kontrolle der Stabilität und Dynamik der Mikrotubuli, die durch posttranslationale Tubulinmodifikationen und Mikrotubuli-assoziierte Proteine erreicht wird, ist für verschiedene zelluläre Funktionen unerlässlich. Funktionsstörungen in Mikrotubuli sind stark an der Pathogenese beteiligt, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Die laufende Forschung konzentriert sich auf auf Mikrotubuli-gerichtete Therapeutika, die die Stabilität modulieren und potenzielle Behandlungsoptionen für diese Krankheiten und Krebsarten bieten. Daher ist das Verständnis des dynamischen Zustands von Mikrotubuli entscheidend für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Effekte.

Traditionell wurde die Dynamik von Mikrotubuli in vitro oder in kultivierten Zellen durch grobe Fraktionierung oder Immunoassay untersucht, wobei Antikörper verwendet wurden, die auf posttranslationale Modifikationen von Tubulin abzielen. Die genaue Analyse des Tubulinstatus in Geweben mit solchen Verfahren stellt jedoch eine Herausforderung dar. In dieser Studie haben wir eine einfache und innovative Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin in Mausgeweben zu trennen.

Das Verfahren beinhaltete die Homogenisierung von präpariertem Mausgewebe in einem Mikrotubuli-stabilisierenden Puffer in einem Volumenverhältnis von 19:1. Die Homogenate wurden dann durch einen zweistufigen Ultrazentrifugationsprozess nach anfänglicher langsamer Zentrifugation (2.400 × g) fraktioniert, um Ablagerungen zu entfernen. Der erste Ultrazentrifugationsschritt (100.000 × g) fiel stabile Mikrotubuli aus, während der resultierende Überstand einem zweiten Ultrazentrifugationsschritt (500.000 × g) unterzogen wurde, um labile Mikrotubuli und lösliche Tubulindimere zu fraktionieren. Mit dieser Methode wurden die Anteile von Tubulin, die stabile oder labile Mikrotubuli im Mäusegehirn bilden, bestimmt. Darüber hinaus wurden deutliche Gewebevariationen in der Mikrotubuli-Stabilität beobachtet, die mit der proliferativen Kapazität der konstituierenden Zellen korrelierten. Diese Ergebnisse unterstreichen das signifikante Potenzial dieser neuartigen Methode zur Analyse der Mikrotubuli-Stabilität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) sind längliche röhrenförmige Strukturen, die aus Protofilamenten bestehen, die aus α/β-Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten bestehen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Motilität, Formerhaltung und intrazellulärem Transport und sind damit integrale Bestandteile des eukaryotischen Zytoskeletts¹. Das Minus-Ende von MTs, bei dem die α-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, ist relativ stabil, während das Plus-Ende, bei dem die β-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, eine dynamische Depolymerisation und Polymerisation erfährt². Dieser kontinuierliche Zyklus der Tubulin-Dimer-Addition und -Dissoziation am Plus-Ende, der als dynamische Instabilität bezeichnet wird, führt zu einem sich wiederholenden Prozess der Rettung und Katastrophe³. MTs weisen fokale Domänen mit lokalisierten Variationen der dynamischen Instabilität auf, einschließlich stabiler und labiler Domänen⁴.

Die präzise Kontrolle der dynamischen Instabilität von MTs ist entscheidend für zahlreiche zelluläre Funktionen, insbesondere in Neuronen, die durch komplizierte Morphologien gekennzeichnet sind. Die Anpassungsfähigkeit und Haltbarkeit von MTs spielen eine entscheidende Rolle für die Entwicklung und das reibungslose Funktionieren von Nervenzellen ^5,6,7. Es wurde festgestellt, dass die dynamische Instabilität von MTs mit verschiedenen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) von Tubulin verbunden ist, wie z. B. Acetylierung, Phosphorylierung, Palmitoylierung, Detyrosinierung, Delta 2, Polyglutaminoxidation und Polyglycylierung. Darüber hinaus dient die Bindung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) als Regulationsmechanismus⁸. PTMs, mit Ausnahme der Acetylierung, treten überwiegend in der Tubulin-Carboxy-terminalen Region auf, die sich auf der äußeren Oberfläche von MTs befindet. Diese Modifikationen erzeugen unterschiedliche Oberflächenbedingungen auf MTs, beeinflussen deren Wechselwirkung mit MAPs und steuern letztendlich die MT-Stabilität⁹. Das Vorhandensein eines carboxyterminalen Tyrosinrests in α-Tubulin ist ein Hinweis auf dynamische MTs, die schnell durch den freien Tubulinpool ersetzt werden. Umgekehrt bedeuten die Detyrosinierung des Carboxy-Terminus und die Acetylierung von Lys40 stabile MTs mit reduzierter dynamischer Instabilität ^9,10.

Die PTMs von Tubulin wurden in großem Umfang in Experimenten eingesetzt, um die Dynamik und Stabilität von MTs 5,7,11,12,13,14,15 zu bewerten. Zum Beispiel können Tubuline in Zellkulturstudien in zwei Pools unterteilt werden: den freien Tubulin-Pool und den MT-Pool. Dies wird erreicht, indem freies Tubulin durch Zellpermeabilisierung freigesetzt wird, bevor die verbleibenden MTs 15,16,17,18,19 fixiert werden. Biochemische Methoden beinhalten die Verwendung chemischer MT-Stabilisatoren, die MTs vor Katastrophen schützen und die Trennung von MTs und freiem Tubulin durch Zentrifugation ermöglichen^20,21,22. Diese Verfahren unterscheiden jedoch nicht zwischen stabilen und weniger stabilen (labilen) MTs, wodurch es unmöglich ist, MTs oder lösliches Tubulin in Geweben wie dem Gehirn zu quantifizieren. Folglich hat sich die Bewertung der MT-Stabilität in Organismen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen als schwierig erwiesen. Um diese experimentelle Einschränkung zu adressieren, haben wir eine neuartige Technik zur präzisen Trennung von MTs und freiem Tubulin in Mausgewebe entwickelt²³.

Diese einzigartige MT-Fraktionierungsmethode beinhaltet die Homogenisierung von Gewebe unter Bedingungen, die den Tubulinstatus im Gewebe aufrechterhalten, und die zweistufige Zentrifugation zur Trennung stabiler MTs, labiler MTs und freiem Tubulin. Dieses einfache Verfahren kann auf breit angelegte Studien angewendet werden, einschließlich Grundlagenforschung zu MTs und MAPs in lebenden Organismen, physiologische und pathologische Analysen von Gesundheit und Krankheiten, die mit der MT-Stabilität verbunden sind, sowie die Entwicklung von Medikamenten und anderen Therapeutika, die auf MTs abzielen.

Protokoll

1. Methode der MT-Fraktionierung

HINWEIS: Alle Experimente, die in dieser Studie durchgeführt wurden, wurden von der Tierethikkommission der Doshisha-Universität genehmigt. Hier wurden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 3-4 Monaten verwendet. In diesem Protokoll wurden präparierte Gewebe, z. B. Gehirn, Leber oder Thymusdrüse, sofort in eiskaltem Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer (MSB) homogenisiert, der Taxol (MT-Stabilisator) in einer Konzentration enthielt, die nicht nur die Depolymerisation, sondern auch die Repolymerisation von MT verhinderte. Das Homogenat wurde durch einen zweistufigen Ultrazentrifugationsprozess in drei Fraktionen getrennt (Abbildung 1). Alle Schritte in diesem Protokoll wurden ohne Unterbrechung in einer Umgebung mit kühlen Temperaturen durchgeführt, und die Gewebe und Fraktionen wurden erst eingefroren, wenn sie in Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer gelöst waren.

1. Präparation von MSB und Mikroröhrchen
   1. Zur Herstellung von MSB werden die folgenden Reagenzien gemischt: 0,1 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 6,8 (neutralisiert durch KOH), 10 % Glycerin, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, 0,5 % Triton X-100, Phosphatase-Inhibitoren (1 mM NaF, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM_Na3VO4, 0,5 μM Okadainsäure), 1x Protease-Inhibitor-Cocktail, und Proteasehemmer (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/ml Pepstatin, 1 μg/ml Schmerzmittel, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin, 50 μg/ml TLCK) (siehe Materialtabelle) und als MSB(-) bezeichnet.
   2. Kurz vor der Gewebedissektion werden 10 μM Taxol und 2 mM GTP (siehe Materialtabelle) zu MSB(-) gegeben. Dieser Puffer wird als MSB(+) bezeichnet. Bereiten Sie den Puffer am Tag der Verwendung vor und bewahren Sie ihn auf Eis auf.
   3. Bereiten Sie die Mikroröhrchen für die Probenahme vor. Leeres 2,0-ml-Mikroröhrchen für die Lagerung von Homogenaten; leeres 1,5-ml-Mikroröhrchen für Lysat mit Überstand1 (S1), Probe für Niederschlag2 (P2) und Probenlagerung für Niederschlag3 (P3); 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 1 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zur Lagerung von präpariertem Gewebe; 1,5 ml Mikroröhrchen mit 200 μl 2x SDS-Probenpuffer (0,16 M Tris pH 6,8; 20 % Glycerin; 2 % 2-Mercaptoethanol; 4 % SDS) für die Lagerung von S1-Proben und Überständen3 (S3); und Zentrifugationsmikroröhrchen für Zentrifugenrotoren TLA55 und TLA120.2 (siehe Materialtabelle). Beschriften Sie alle Röhrchen und legen Sie sie auf Eis.
2. Homogenisierung von Mausgewebe
   1. Bereiten Sie einen gekühlten Tisch für die Gewebedissektion vor. Füllen Sie zunächst eine Schachtel mit Crushed Ice und stellen Sie zwei Petrischalen auf Eis, eine mit der Innenseite nach oben und die andere mit der Außenseite. Füllen Sie eiskaltes PBS in eine Schale zum vorübergehenden Waschen und Aufbewahren von präpariertem Gewebe. Mit PBS angefeuchtetes Filterpapier auf eine andere umgedrehte Schale legen.
   2. Um eine Maus zu opfern, führen Sie eine Zervixluxation unter tiefer Betäubung mit einem gemischten Anästhetikum aus Butorphanol, Midazolam und Medetomidin durch. Sezieren Sie dann sofort das Gewebe, z. B. Gehirn, Leber oder Thymusdrüse, und waschen Sie es mit eiskaltem PBS in einer Petrischale.
      HINWEIS: Jede Art von Weichgewebe kann mit dieser Methode analysiert werden. Die Größe des Gewebes ist jedoch durch den empfohlenen Volumenbereich des verwendeten Homogenisators begrenzt. Wenn beispielsweise ein Homogenisator mit einem Volumen von 2 ml verwendet wird, werden 50-100 mg Gewebe empfohlen.
   3. Nach dem Wiegen der mit PBS gefüllten 1,5-ml-Mikroröhrchen für die Lagerung von präpariertem Gewebe schneiden Sie Gewebe aus und lagern Sie es in den Mikroröhrchen und wiegen Sie jedes Mikroröhrchen erneut. Das Nassgewicht jedes Gewebes kann berechnet werden, indem das Gewicht des Röhrchens vor und nach der Zugabe des Gewebes subtrahiert wird.
   4. Homogenisieren Sie das Gewebe sofort in eiskaltem MSB(+) mit einem gekühlten Homogenisator (siehe Materialtabelle). Das Volumen von MSB(+) betrug das 19-fache (μl) des Nassgewichts des Gewebes (mg). Homogenisieren Sie mit 20 Hüben, bis die Gewebestücke verschwunden sind.
      HINWEIS: Für 100 mg Gewebe werden beispielsweise 1.900 μl MSB(+) verwendet. Da das Volumen des zuzugebenden MSB(+) für jedes Nassgewicht der analysierten Gewebestücke angepasst werden muss, ist es notwendig, jedes Gewebestück genau zu wiegen.
3. Zentrifugation der Mausgewebe-Homogenate
   1. Das gesamte Homogenat mit einer Pasteurpipette in ein 2-ml-Mikroröhrchen geben und bei 2.400 × g 3 min bei 2 °C zentrifugieren, um die Ablagerungen durch Fällung zu entfernen.
   2. Den gesamten Überstand (S1-Fraktion) in ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen und einen Wirbel überführen. Dann werden 200 μl S1-Fraktion in ein Zentrifugationsmikroröhrchen aliquotiert und bei 100.000 × g mit einem TLA-55-Rotor 20 min bei 2 °C zentrifugiert, um die relativ großen Molekularproteine als Präzipitat (P2-Fraktion) zu erhalten.
      HINWEIS: Das Volumen der Probe, die den Ultrazentrifugationsschritten unterzogen wird, beeinflusst den Zentrifugationsradius und die Fällungseffizienz der Moleküle. Halten Sie das Probenvolumen nach diesem Schritt bei 200 μl oder weniger, um eine ungenaue Fraktionierung zu vermeiden.
   3. Weiter zentrifugiert der gesamte resultierende Überstand (S2-Fraktion) bei 500.000 × g unter Verwendung eines TLA-120.2-Rotors für 60 min bei 2 °C, um die unlöslichen Proteinkomplexe im Niederschlag (P3-Fraktion) von den löslichen Proteinen im Überstand (S3-Fraktion) zu trennen.
   4. 400 μl 1x SDS-Probenpuffer (0,08 M Tris pH 6,8; 10 % Glycerin; 1 % 2-Mercaptoethanol; 2 % SDS) in die P2- und P3-Fraktionsröhrchen geben und kurz beschallen, um den Niederschlag aufzulösen. Überführen Sie diese Fraktionsproben in ein leeres 1,5-ml-Mikroröhrchen.
   5. Die gesamte S3-Fraktion wird in 200 μl 2x SDS-Probenpuffer gelöst.
   6. Mischen Sie die verbleibenden S1-Fraktionen mit einem gleichen Volumen von 2x SDS-Probenpuffer, um sie als Standardkurve für das Western Blot zu verwenden.
   7. Alle diese Proben werden bei 100 °C für 3 min gekocht. Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, lagern Sie die Proben bei -20 °C.
4. Quantifizierung von Proteinen in jeder Fraktion
   1. Quantifizierung von Proteinen in den P2-, P3- und S3-Fraktionen durch Western Blotting. Verwenden Sie zunächst die 10%ige SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), um Proteine aus ordnungsgemäß verdünnten P2-, P3- und S3-Fraktionen und seriell verdünnter S1-Probe von jedem Individuum als Standardkurve zu trennen. Anschließend werden die Proben auf Polyvinylidenfluorid-Membranen elektrotupft (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Das Verdünnungsverhältnis jeder Fraktion hängt von der Konzentration eines Zielproteins und der Reaktivität des Antikörpers ab. (z. B. α-Tubulin, TUBB3, β-Wanne und tyrosiniertes Tubulin im Hirngewebe: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2.000, S1 = 1/50,000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; acetyliertes Tubulin im Hirngewebe: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-Tubulin in der Leber: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-Tubulin im Thymus: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 Verdünnung der Gewebekonzentration).
   2. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T) für mehr als 30 Minuten.
   3. Tauchen Sie die Membran länger als 2 h in TBS-T-haltige Primärantikörper (siehe Materialtabelle). Danach waschen Sie die Membran 3 Minuten lang (3 Mal) mit TBS-T.
   4. Markierung des Primärantikörpers mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) in TBS-T für mehr als 1 Stunde. Danach waschen Sie die Membran 3 Minuten lang (3 Mal) mit TBS-T.
   5. Entwickeln Sie die Membranen mit dem Reagenz Enhanced Chemilumineszenz. Analysieren Sie dann die interessierenden Bänder mit einem Lumineszenzbildanalysator (siehe Materialtabelle).
   6. Quantifizieren Sie die Proteinbandenintensitäten mit einer Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Verdünnungseinheiten der verdünnten S1-Proben auftragen, die für die Standardkurve entlang der X-Achse und die Bandintensitäten entlang der Y-Achse verwendet werden.
   7. Lesen Sie die Proteinkonzentration (Einheit) ab, die den Proben der verdünnten Fraktion entspricht. Multiplizieren Sie die abgelesene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor der Probe, um eine Proteineinheit in jeder Fraktion zu erhalten. Teilen Sie die gemessene Einheit jeder Fraktion durch die gesamte Proteineinheit (P2 + P3 + S3), um einen Prozentsatz zu erhalten.

2. Bewertung der Eigenschaften von Tubulin in jeder Fraktion

HINWEIS: Diese biochemische Methode liefert drei Gruppen von Tubulinkomplexen, die durch Sedimentationseigenschaften definiert sind. Hier wurde der Status der in diesen Fraktionen erhaltenen Tubulin-Komplexe anhand der Größe des Komplexes und der Tubulin-PTMs bestimmt. Führen Sie alle Schritte dieses Protokolls ohne Unterbrechung in einer Umgebung mit kühler Temperatur durch, aber frieren Sie die Fraktionsproben nicht ein, bis sie im SDB-Probenpuffer aufgelöst sind.

1. Filterfallen-Assay
   1. Filtern Sie die S2- und S3-Fraktionen (je 500 μl) mit einer 300-kDa-Ultrafiltrations-Spin-Säule (siehe Materialtabelle). Führen Sie eine Zentrifugation von 14.000 × g bei 2 °C durch, bis der gesamte Überstand gefiltert ist, eluierte Proteine in Empfängerröhrchen gesammelt werden und eingeschlossene Proteine auf dem Filter der Reservoirröhrchen verbleiben.
   2. Übersetzen Sie die ganzen Filtrate (ca. 500 μl) in Empfängerröhrchen in neue 1,5-ml-Mikroröhrchen und lösen Sie sie in 500 μl 2x SDS-Probenpuffer auf.
   3. Solubilisieren Sie die Rückstände auf dem Filter der Reservoirröhrchen in 1.000 μl 1x SDS-Probenpuffer, indem Sie die Proben pipettieren und in ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.
   4. Die Proben werden bei 100 °C für 3 min gekocht. Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, lagern Sie die Proben bei -20 °C.
   5. Analysieren Sie die Tubulinmengen durch Western Blot mit DM1A (Anti-α-Tubulin-Antikörper, siehe Materialtabelle).
2. Größenausschluss-Chromatographie
   1. Der Trägerpuffer (0,1 M MES, pH 6,8; 10 % Glycerin; 1 mM MgSO₄; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) wird mit einer Konzentration von 1/10 Protease- und Phosphataseinhibitoren wie in Schritt 1.1.1 beschrieben hergestellt. Filtern Sie dann die Lösung und lagern Sie sie in einer kalten Umgebung.
   2. Bereiten Sie eine Gelfiltrationschromatographiesäule mit einem präparativen Flüssigkeitschromatographiesystem in einer Chromatographiekammer (siehe Materialtabelle) bei 4 °C vor.
   3. Bevor Sie Proben auf die Säule injizieren, lassen Sie 180 ml des Trägerpuffers zufließen, um die Säule zu waschen. Die Durchflussrate beträgt 1 ml/min für 3 h.
   4. Injizieren Sie handelsübliches gereinigtes Schweinetubulin (siehe Materialtabelle) als Kontrolle oder die S3-Fraktion aus Mäusegehirnen (je 500 μl) auf die Säule.
   5. Eluieren Sie mit einer Flussrate von 1,0 ml/min mit Trägerpuffer. Sammeln Sie die 1,5-ml-Fraktionen 120 Minuten lang. Überwachung eluierter Proteine durch Absorption bei 280 nm. Halten Sie den maximalen Druck unter 0,3 MPa.
   6. Nach dem Vortexen der gesammelten Fraktionen mischen Sie 50 μl davon mit 50 μl 2x SDS-Probenpuffer in einem 1,5 mL Mikroröhrchen. Alle Proben werden bei 100 °C für 3 min gekocht. Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, lagern Sie die Proben bei -20 °C.
   7. Analysieren Sie die Tubulinmengen durch Western Blot mit DM1A, Anti-α-Tubulin-Antikörper und KMX-1, Anti-β-Tubulin-Antikörper (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Quantifizierung von Tubulin in den P2-, P3- und S3-Fraktionen des Mäusegehirns mit der MT-Fraktionierungsmethode
Tubulin im Mausgewebe wurde mit der MT-Fraktionierungsmethode in die P2-, P3- und S3-Fraktionen aufgeteilt und durch Western Blot quantifiziert (Abbildung 1A). Die Ausfällung von MTs, die durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 20 min in der P2-Fraktion verblieben waren, machte 34,86 % ± 1,68 % des gesamten Tubulins in einem Mausgehirn aus. ...

Diskussion

Die wichtigste Aufgabe bei der Untersuchung des Status von Tubulin in Gewebe lebender Organismen besteht darin, eine versehentliche MT-Polymerisation oder -Depolymerisation während der Präparation zu verhindern. Die Stabilität von MTs in Proben wird durch Faktoren wie die Konzentration von Taxol in MSB, das Verhältnis der Gewebemenge zum Puffer und die Temperatur während des Prozesses von der Gewebeentnahme bis zur Homogenisierung und Zentrifugation beeinflusst. Daher wurden die Bedingungen in jedem Schritt des Prot...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus	Cytiva	11001313
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1	AS ONE	1-2050-11
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP	Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman	TOMY	KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)	Roche	11873580001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol	LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422