Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris

Résumé

Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.

Résumé

Les microtubules, composés de dimères de α/β-tubuline, sont un composant crucial du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ces polymères tubulaires présentent une instabilité dynamique lorsque les sous-unités hétérodimères de tubuline subissent une polymérisation et une dépolymérisation répétitives. Un contrôle précis de la stabilité et de la dynamique des microtubules, obtenu grâce à des modifications post-traductionnelles de la tubuline et à des protéines associées aux microtubules, est essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Les dysfonctionnements des microtubules sont fortement impliqués dans la pathogenèse, y compris les troubles neurodégénératifs. Les recherches en cours se concentrent sur les agents thérapeutiques ciblant les microtubules qui modulent la stabilité, offrant des options de traitement potentielles pour ces maladies et cancers. Par conséquent, la compréhension de l’état dynamique des microtubules est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les effets thérapeutiques.

Traditionnellement, la dynamique des microtubules a été évaluée in vitro ou dans des cellules en culture par fractionnement approximatif ou immunoessai, à l’aide d’anticorps ciblant les modifications post-traductionnelles de la tubuline. Cependant, l’analyse précise du statut de la tubuline dans les tissus à l’aide de telles procédures pose des défis. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et innovante de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris.

La procédure a consisté à homogénéiser des tissus de souris disséqués dans un tampon stabilisateur de microtubules à un rapport de volume de 19 :1. Les homogénats ont ensuite été fractionnés par un processus d’ultracentrifugation en deux étapes après une centrifugation lente initiale (2 400 × g) pour éliminer les débris. La première étape d’ultracentrifugation (100 000 × g) a précipité les microtubules stables, tandis que le surnageant résultant a été soumis à une deuxième étape d’ultracentrifugation (500 000 × g) pour fractionner les microtubules labiles et les dimères de tubuline solubles. Cette méthode a permis de déterminer les proportions de tubuline constituant des microtubules stables ou labiles dans le cerveau de la souris. De plus, des variations tissulaires distinctes dans la stabilité des microtubules ont été observées qui étaient corrélées avec la capacité proliférative des cellules constitutives. Ces résultats mettent en évidence le potentiel important de cette nouvelle méthode pour l’analyse de la stabilité des microtubules dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les microtubules (MT) sont des structures tubulaires allongées comprenant des protofilaments constitués de sous-unités hétérodimères α/β-tubuline. Ils jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires tels que la division cellulaire, la motilité, le maintien de la forme et le transport intracellulaire, ce qui en fait des composants intégraux du cytosquelette eucaryote¹. L’extrémité négative des MT, où la sous-unité α-tubuline est exposée, est relativement stable, tandis que l’extrémité positive, où la sous-unité β-tubuline est exposée, subit une dépolymérisation dynamique et une polymérisation². Ce cycle continu d’ajout et de dissociation des dimères de tubuline à l’extrémité positive, appelé instabilité dynamique, entraîne un processus répétitif de sauvetage et de catastrophe³. Les MT présentent des domaines focaux avec des variations localisées de l’instabilité dynamique, y compris des domaines stables et labiles⁴.

Un contrôle précis de l’instabilité dynamique des MT est crucial pour de nombreuses fonctions cellulaires, en particulier dans les neurones caractérisés par des morphologies complexes. L’adaptabilité et la durabilité des MT jouent un rôle essentiel dans le développement et le bon fonctionnement des cellules nerveuses ^5,6,7. L’instabilité dynamique des MT s’est avérée être associée à diverses modifications post-traductionnelles (PTM) de la tubuline, telles que l’acétylation, la phosphorylation, la palmitoylation, la détyrosination, le delta 2, l’oxydation de la polyglutamine et la polyglycylation. De plus, la liaison des protéines associées aux microtubules (MAP) sert de mécanisme de régulation⁸. Les PTM, à l’exclusion de l’acétylation, se produisent principalement dans la région carboxy-terminale de la tubuline située sur la surface externe des MT. Ces modifications créent des conditions de surface diverses sur les MT, influençant leur interaction avec les MAP et, en fin de compte, régissant la stabilité des MT⁹. La présence d’un résidu de tyrosine carboxy-terminale dans la α-tubuline est révélatrice de MT dynamiques, qui sont rapidement remplacées par le pool de tubuline libre. À l’inverse, la détyrosination de l’extrémité carboxy et l’acétylation de Lys40 signifient des MT stables avec une instabilité dynamique réduite ^9,10.

Les PTM de la tubuline ont été largement utilisés dans des expériences visant à évaluer la dynamique et la stabilité des MT 5,7,11,12,13,14,15. Par exemple, dans les études de culture cellulaire, les tubulines peuvent être séparées en deux pools : le pool de tubulines libres et le pool MT. Ceci est réalisé en libérant de la tubuline libre par perméabilisation cellulaire avant de fixer les MT restantes 15,16,17,18,19. Les méthodes biochimiques impliquent l’utilisation de stabilisateurs chimiques de MT qui protègent les MT d’une catastrophe, permettant la séparation des MT et de la tubuline libre par centrifugation^20,21,22. Cependant, ces procédures ne font pas la différence entre les MT stables et moins stables (labiles), ce qui rend impossible la quantification des MT ou de la tubuline soluble dans des tissus comme le cerveau. Par conséquent, l’évaluation de la stabilité de la TA chez les organismes dans des conditions physiologiques et pathologiques s’est avérée difficile. Pour remédier à cette limite expérimentale, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de séparer avec précision les MT et la tubuline libre dans les tissus de souris²³.

Cette méthode unique de fractionnement de la magnétoscopie implique l’homogénéisation des tissus dans des conditions qui maintiennent le statut de la tubuline dans les tissus et la centrifugation en deux étapes pour séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre. Cette procédure simple peut être appliquée à de vastes études, y compris la recherche fondamentale sur les MT et les MAP dans les organismes vivants, les analyses physiologiques et pathologiques de la santé et des maladies associées à la stabilité des MT, et le développement de médicaments et d’autres thérapies qui ciblent les MT.

Protocole

1. Méthode de fractionnement MT

REMARQUE : Toutes les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Doshisha. Des souris C57BL/6J des deux sexes, âgées de 3 à 4 mois, ont été utilisées ici. Dans ce protocole, les tissus disséqués, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, ont été immédiatement homogénéisés dans un tampon stabilisateur de microtubules (MSB) glacé, qui contenait du Taxol (stabilisateur MT) à une concentration qui empêchait non seulement la dépolymérisation, mais aussi la repolymérisation de la MT. L’homogénat a été séparé en trois fractions par un procédé d’ultracentrifugation en deux étapes (Figure 1). Toutes les étapes de ce protocole ont été réalisées sans interruption dans un environnement à température fraîche, et les tissus et les fractions n’ont pas été congelés jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans un tampon d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS).

1. Préparation de MSB et de microtubes
   1. Pour préparer le MSB, mélanger les réactifs suivants : 0,1 M d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES), pH 6,8 (neutralisé par KOH), 10 % de glycérol, 0,1 mM de DTT, 1 mM de MgSO 4, 1 mM d’EGTA, 0,5 % de Triton X-100, inhibiteurs de la phosphatase (1 mM de NaF, 1 mM de β-glycérophosphate, 1 mM de Na₃VO ₄, 0,5 μM d’acide okadaïque), 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase, et les inhibiteurs de la protéase (0,1 mM de PMSF, 0,1 mM de DIFP, 1 μg/mL de pepstatine, 1 μg/mL d’antidouleur, 10 μg/mL d’aprotinine, 10 μg/mL de leupeptine, 50 μg/mL de TLCK) (voir le tableau des matériaux) et désignés par MSB(-).
   2. Juste avant la dissection tissulaire, ajouter 10 μM de Taxol et 2 mM de GTP (voir le tableau des matériaux) à la MSB(-). Ce tampon est désigné MSB(+). Préparez le tampon le jour de l’utilisation et conservez-le sur de la glace.
   3. Préparez les microtubes pour l’échantillonnage. Microtube vide de 2,0 ml pour le stockage de l’homogénat ; microtube vide de 1,5 mL pour le lysat de surnageant1 (S1), l’échantillon de précipité2 (P2) et l’entreposage de l’échantillon de précipité3 (P3) ; Microtube de 1,5 mL avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour le stockage des tissus disséqués ; Microtube de 1,5 mL avec 200 μL de tampon d’échantillon SDS 2x (0,16 M Tris pH 6,8 ; glycérol 20 % ; 2-mercaptoéthanol 2 % ; 4 % SDS) pour le stockage de l’échantillon S1 et du surnageant3 (S3) ; et microtube de centrifugation pour rotors de centrifugation TLA55 et TLA120.2 (voir tableau des matériaux). Étiquetez tous les tubes et placez-les sur de la glace.
2. Homogénéisation des tissus de souris
   1. Préparez une table réfrigérée pour la dissection des tissus. Tout d’abord, remplissez une boîte de glace pilée et placez deux boîtes de Pétri sur de la glace, l’une avec le côté intérieur vers le haut et l’autre avec le côté extérieur. Remplissez du PBS glacé dans un plat pour le lavage et le stockage transitoires des tissus disséqués. Posez du papier filtre imbibé de PBS sur un autre plat retourné.
   2. Pour sacrifier une souris, effectuez une luxation cervicale sous anesthésie profonde avec un anesthésique mixte de butorphanol, de midazolam et de médétomidine. Ensuite, disséquez immédiatement les tissus, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, et lavez-les avec du PBS glacé dans une boîte de Pétri.
      REMARQUE : Tout type de tissu mou peut être analysé par cette méthode. Cependant, la taille du tissu est limitée par la plage de volume recommandée de l’homogénéisateur utilisé. Par exemple, si un volume de 2 ml d’homogénéisateur est utilisé, 50 à 100 mg de tissu sont recommandés.
   3. Après avoir pesé les microtubes de 1,5 ml remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués, découpez et stockez les tissus à l’intérieur des microtubes, et pesez à nouveau chaque microtube. Le poids humide de chaque tissu peut être calculé en soustrayant le poids du tube avant et après l’ajout du tissu.
   4. Homogénéiser immédiatement le tissu dans un MSB(+) glacé à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré (voir le tableau des matériaux). Le volume de MSB(+) était 19 fois (μL) le poids humide des tissus (mg). Effectuez l’homogénéisation avec 20 coups jusqu’à ce que les morceaux de tissu disparaissent.
      REMARQUE : Par exemple, 1 900 μL de MSB(+) sont utilisés pour 100 mg de tissu. Étant donné que le volume de MSB(+) à ajouter doit être ajusté pour chaque poids humide des morceaux de tissu analysés, il est nécessaire de peser chaque morceau de tissu avec précision.
3. Centrifugation des homogénats de tissus de souris
   1. Déplacer l’homogénat entier dans un microtube de 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 × g pendant 3 min à 2 °C pour éliminer les débris par précipitation.
   2. Transférez le surnageant entier (fraction S1) dans un nouveau microtube de 1,5 mL et un vortex. Ensuite, aliquotez 200 μL de fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifugez à 100 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 min à 2 °C pour obtenir les protéines de poids moléculaire relativement important sous forme de précipité (fraction P2).
      REMARQUE : Le volume de l’échantillon soumis aux étapes d’ultracentrifugation affecte le rayon de centrifugation et l’efficacité de précipitation des molécules. Maintenez le volume de l’échantillon à 200 μL ou moins après cette étape pour éviter un fractionnement inexact.
   3. Centrifuger ensuite tout le surnageant résultant (fraction S2) à 500 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-120.2 pendant 60 min à 2 °C pour séparer les complexes protéiques insolubles dans le précipité (fraction P3) des protéines solubles dans le surnageant (fraction S3).
   4. Ajouter 400 μL de tampon d’échantillon 1x SDS (0,08 M Tris pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 % de 2-mercaptoéthanol ; 2 % SDS) dans les tubes de fraction P2 et P3 et soniser brièvement pour dissoudre le précipité. Transférez ces échantillons de fraction dans un microtube vide de 1,5 ml.
   5. Dissoudre la fraction S3 totale dans 200 μL de tampon 2x SDS.
   6. Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon 2x SDS pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western.
   7. Faites bouillir tous ces échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
4. Quantification des protéines dans chaque fraction
   1. Quantifier les protéines dans les fractions P2, P3 et S3 par Western blot. Tout d’abord, utilisez l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS à 10 % (SDS-PAGE) pour séparer les protéines des fractions P2, P3 et S3 correctement diluées et de l’échantillon S1 dilué en série de n’importe quel individu comme courbe standard. Ensuite, vaporisez les échantillons sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (voir le tableau des matériaux).
      NOTE : Le taux de dilution de chaque fraction dépend de la concentration d’une protéine objective et de la réactivité de l’anticorps. (p. ex., α-tubuline, TUBB3, β-tub et tubuline tyrosinée dans le tissu cérébral : S3 = 1/400, P3 = 1/2 000, P2 = 1/2 000, S1 = 1/50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; tubuline acétylée dans le tissu cérébral : S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000 ; α-tubuline dans le foie : S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; α-tubuline dans le thymus : S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 dilution de la concentration tissulaire).
   2. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris (50 mM de Tris-HCl pH 7,6 ; 152 mM de NaCl) avec 0,1 % de Tween 20 (TBS-T) pendant plus de 30 min.
   3. Immergez la membrane dans l’anticorps primaire contenant le TBS-T (voir le tableau des matériaux) pendant plus de 2 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
   4. Marquer l’anticorps primaire à l’aide d’anticorps secondaires conjugués HRP (voir le tableau des matériaux) dans le TBS-T pendant plus de 1 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
   5. Développer les membranes avec le réactif de chimiluminescence améliorée. Ensuite, analysez les bandes d’intérêt à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes (voir Tableau des matériaux).
   6. Quantifier l’intensité des bandes protéiques à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir le tableau des matériaux) et créer une courbe standard en traçant les unités de dilution des échantillons S1 dilués utilisés pour la courbe standard le long de l’axe X et les intensités des bandes le long de l’axe Y.
   7. Lire la concentration en protéines (unité) correspondant aux échantillons de fraction diluée. Multipliez la concentration lue par le facteur de dilution de l’échantillon pour obtenir une unité protéique dans chaque fraction. Divisez l’unité mesurée de chaque fraction par l’unité protéique totale (P2 + P3 + S3) pour obtenir un pourcentage.

2. Évaluation des propriétés de la tubuline dans chaque fraction

REMARQUE : Cette méthode biochimique fournit trois groupes de complexes de tubuline définis par des propriétés de sédimentation. Ici, le statut des complexes de tubuline obtenus dans ces fractions a été identifié en fonction de la taille du complexe et des tubulines-PTM. Effectuez toutes les étapes de ce protocole sans interruption dans un environnement à température fraîche, mais ne congelez pas les échantillons de fraction jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans le tampon d’échantillon SDS.

1. Dosage du piège à filtre
   1. Filtrer les fractions S2 et S3 (500 μL chacune) à l’aide d’une colonne de centrifugation d’ultrafiltration de 300 kDa (voir Tableau des matériaux). Effectuer une centrifugation de 14 000 × g à 2 °C jusqu’à ce que l’ensemble du surnageant soit filtré, que les protéines éluées soient recueillies dans des tubes récepteurs et que les protéines piégées restent sur le filtre des tubes réservoirs.
   2. Traduire l’ensemble des filtrats (environ 500 μL) dans les tubes récepteurs en nouveaux microtubes de 1,5 mL et les dissoudre dans 500 μL de tampon d’échantillon SDS 2x.
   3. Solubiliser les résidus sur le filtre des tubes réservoirs dans 1 000 μL de tampon d’échantillon SDS 1x en pipetant et en transférant les échantillons dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
   4. Faites bouillir les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
   5. Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A (anticorps anti-α-tubuline, voir le tableau des matériaux).
2. Chromatographie d’exclusion de taille
   1. Préparer le tampon porteur (0,1 M MES, pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 mM MgSO₄ ; 1 mM EGTA ; 0,1 mM DTT) complété par une concentration de 1/10 d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase comme décrit à l’étape 1.1.1. Ensuite, filtrez la solution et stockez-la dans un environnement froid.
   2. Préparer une colonne de chromatographie par filtration sur gel équipée d’un système de chromatographie liquide préparative dans une chambre de chromatographie (voir tableau des matériaux) à 4 °C.
   3. Avant d’injecter des échantillons dans la colonne, faire couler 180 mL du tampon de support pour laver la colonne. Le débit est de 1 mL/min pendant 3 h.
   4. Injecter de la tubuline porcine purifiée disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) comme témoin ou la fraction S3 de cerveaux de souris (500 μL chacun) sur la colonne.
   5. Elute à un débit de 1,0 mL/min avec tampon porteur. Prélever les fractions de 1,5 mL pendant 120 minutes. Surveiller les protéines éluées par absorbance à 280 nm. Maintenez la pression maximale en dessous de 0,3 MPa.
   6. Après avoir vortex les fractions collectées, mélanger 50 μL d’entre elles avec 50 μL de tampon d’échantillon SDS 2x dans un microtube de 1,5 mL. Faites bouillir tous les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
   7. Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A, anticorps anti-α-tubuline et KMX-1, anticorps anti-β-tubuline (voir le tableau des matériaux).

Résultats

Quantification de la tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 du cerveau de souris par la méthode de fractionnement MT
La tubuline dans les tissus de souris a été séparée en fractions P2, P3 et S3 par la méthode de fractionnement MT et quantifiée par Western blot (Figure 1A). Le précipité de MT qui est resté dans la fraction P2 par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 20 min représentait 34,86 % ± 1,68 % de la tubuline totale dans un cerveau de...

Discussion

La tâche la plus importante lors de l’étude de l’état de la tubuline dans les tissus d’organismes vivants est d’empêcher la polymérisation ou la dépolymérisation accidentelle de la magnétoscopie pendant la préparation. La stabilité des MT dans les échantillons est affectée par des facteurs tels que la concentration de Taxol dans la MSB, la proportion de quantité tissulaire à tamponner et la température pendant le processus allant du prélèvement des tissus à l’homogénéisation et à la centrif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
ÄKTAprime plus	Cytiva	11001313
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1	AS ONE	1-2050-11
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP	Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman	TOMY	KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete™, EDTA-free)	Roche	11873580001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol	LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422