גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

Summary

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

Abstract

היכולת לדמיין אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות ודינמיות בין סוגי תאים רבים לבין המטריצה החוץ-תאית (ECM) בתוך מיקרו-סביבה של גידול חי היא צעד חשוב לקראת הבנת מנגנונים המווסתים את התקדמות הגידול. אמנם ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות הדמיה תוך-ורידיות עכשוויות, אך זה עדיין מאתגר בשל האופי ההטרוגני של הרקמות והצורך בהקשר מרחבי בתוך התצפית הניסיונית. לשם כך, פיתחנו תהליך הדמיה תוך-ורידי המשלב הדמיה של קולגן מהדור ההרמוני השני, פלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H, ומיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) כאמצעי למידור לא פולשני של המיקרו-סביבה של הגידול לתחומים בסיסיים של קן הגידול, הסטרומה או ה-ECM שמסביב, וכלי הדם. פרוטוקול לא פולשני זה מפרט את התהליך שלב אחר שלב, החל מרכישת תמונות בהילוך מהיר של מודלים של גידולי יונקים ועד לניתוח לאחר העיבוד ופילוח תמונות. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא בכך שהיא מנצלת חתימות מטבוליות כדי להקשר את המיקרו-סביבה של הגידול החי המשתנה באופן דינמי ללא שימוש בתוויות פלואורסצנטיות אקסוגניות, מה שהופך אותה ליתרון עבור מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם במטופלים אנושיים ולשימוש קליני עתידי שבו פלואורופורים חיצוניים אינם ישימים בקלות.

Introduction

המטריצה החוץ-תאית (ECM) במיקרו-סביבה של הגידול ידועה כמי שהופקדה באופן דינמי ושופצה על ידי סוגי תאים מרובים כדי להקל עוד יותר על התקדמות המחלה ^1,2,3. שינויי מטריצה אלה מספקים רמזים מכניים וביולוגיים המשנים את התנהגות התאים ולעתים קרובות גורמים למחזור מתמשך של שיפוץ מטריצה⁴. חקירת יחסי הגומלין הדינמיים וההדדיים בין תאי הגידול לבין המטריצה החוץ-תאית מתבצעת לעתים קרובות באמצעות תרבית מבחנה תלת-ממדית (תלת-ממדית) או מערכות מיקרופלואידיות. בעוד שגישות אלה מלמטה למעלה הדגימו מנגנונים של שיפוץ ECM ^5,6,7, התפשטות מוגברת⁸, מעבר אפיתל למזנכימלי ^9,10,11,12, והגירה ופלישה של תאי גידול ^{7,13,14,15,16} ההתמקדות שלהם הייתה בעיקר בכמה סוגי תאים (למשל, תאי גידול או פיברובלסטים) בתוך מטריצה תלת-ממדית הומוגנית בהשוואה למגוון ולהטרוגניות של אינטראקציות הקיימות בתוך רקמה פיזיולוגית., בנוסף למערכות in vitro, היסטולוגיה של גידולי ex vivo יכולה גם לספק כמה תובנות לגבי האינטראקציות האלה בין תאים לתאים ותאים-ECM¹⁷. לאימונוהיסטוכימיה יש יתרון בכך שהיא מסוגלת לנתח סוגי תאים מרובים ביחס להרכב ההטרוגני המרחבי ולארכיטקטורה של ה-ECM, אך נקודות הקצה הסטטיות של רקמות קבועות אינן לוכדות את האופי הדינמי של אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה. הדמיה תוך-ורידית פתחה את הדלת לחקור אינטראקציות מגוונות ודינמיות בהקשר הפיזיולוגי של המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול.

היכולות של הדמיית גידולים תוך-ורידיים מתקדמות במהירות. שיפורים בתכנון חלונות הדמיה וטכניקות כירורגיות להשתלת החלונות אפשרו הדמיה ארוכת טווח של גידולים אורכיים במגוון מקומות אנטומיים (כלומר, גידול ראשוני, בלוטות לימפה, אתרים גרורתיים 18,19,20). יתר על כן, היכולת של מכשור אופטי להמחיש ולאסוף נתונים בממדים מרובים (כלומר, ספקטרלי, עוצמת פלואורסצנציה מרחבית ואורך חיים), וברזולוציה ובמהירות גבוהה (קצב וידאו) הופכת לנגישה באופן נרחב. הטכנולוגיה המשופרת מספקת הזדמנות לחקור שינויים מהירים באיתות תאי ובדינמיקה פנוטיפית בתוך סביבה פיזיולוגית. לבסוף, הרחבת הכלים האופטוגנטיים והמגוון הרחב של מבנים פלואורסצנטיים גנטיים מאפשרים תיוג של סוגי תאים ספציפיים כדי ללכוד את נדידת התאים במיקרו-סביבה של הגידול או במעקב אחר שושלת התאים במהלך ההתפתחות או התקדמות המחלה^21,22. השימוש בכלים אלה בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מספק לחוקרים את ההזדמנות ליצור מודלים ייחודיים של בעלי חיים בזמן.

בעוד שכל ההתקדמות הזו הופכת את ההדמיה התוך-לוויתנית לשיטה רבת עוצמה יותר ויותר לחקר אינטראקציות תאיות דינמיות ופיזיולוגיות, עדיין יש צורך חשוב לפתח אסטרטגיות המספקות הקשר מרחבי, זמני ומבנה ברמת הרקמה לאינטראקציות ביולוגיות אלה. נכון לעכשיו, מחקרי הדמיה תוך-ורידיים רבים מפצים על היעדר ציוני דרך חזותיים כגון כלי דם על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לתוך כלי הדם או שימוש במודלים של עכברים המבטאים באופן אקסוגני חלבונים פלואורסצנטיים כדי להגדיר תכונות פיזיות. צבעים ומצעים הניתנים להזרקה כמו דקסטרנים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לתייג בהצלחה את כלי הדם באוספים תוך-ויטליים^{19, 23, 24}. עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. ראשית, היא דורשת מניפולציות נוספות בעכברים והתועלת שלה מוגבלת לניסויים קצרי טווח. עבור מחקרי אורך, דקסטרן פלואורסצנטי יכול להיות בעייתי כאשר אנו צופים בהצטברות של דקסטרן בתאים פאגוציטיים או דיפוזיה לתוך הרקמה הסובבת לאורך זמן²⁵. שילוב חלבון פלואורסצנטי אקסוגני במודל העכבר הוצג כחלופה לדקסטרנים פלואורסצנטיים, אך מציג מגבלות משלו. הזמינות והמגוון של פלואורופורים אקסוגניים בתוך דגמי עכברים עדיין מוגבלים ויקרים ליצירה. בנוסף, במודלים ספציפיים, כגון מודלים של PDX, מניפולציות גנטיות אינן רצויות או אפשריות. כמו כן, הוכח כי נוכחותם של חלבונים פלואורסצנטיים או ביולומינסצנטיים בתוך התאים מוכרת כזרה בתוך העכבר, ובתוך מודלים של עכברים מדוכאי חיסון, הדבר מפחית את כמות הגרורות עקב התגובה של מערכת החיסון המארחת^26,27. לבסוף, חלבונים פלואורסצנטיים אקסוגניים או צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להקשר מרחבי או לפלח נתונים מאוחרים יותר תופסים לעתים קרובות טווחים ראשוניים של ספקטרום האור, שאחרת ניתן היה להשתמש בהם כדי לחקור את האינטראקציות הפיזיולוגיות המעניינות.

השימוש באות הפנימי מה-ECM או פלואורסצנציה אנדוגנית מתאים בתוך הרקמה מייצג אמצעי אוניברסלי פוטנציאלי ללא תוויות לפלח נתונים תוך-תאיים לצורך ניתוח תאי ומרחבי מעמיק יותר. הדור ההרמוני השני (SHG) שימש זה מכבר להדמיית ה-ECM²⁸. עם התפתחותם של כלים חשובים שיסייעו באפיון ארגון הסיבים 29,30,31, ניתן לאפיין את התנהגות התא ביחס למבנה ECM המקומי. בנוסף, אוטופלואורסצנציה מהמטבוליט האנדוגני, NAD(P)H, מספקת כלי נוסף ללא תווית למידור המיקרו-סביבה של הגידול in vivo. NAD(P)H פלואורסצנטי בבהירות בתאי הגידול וניתן להשתמש בו כדי להבחין בין גבולות קן הגידול הגדל לבין הסטרומה הסובבת אותו^21,32. לבסוף, כלי הדם הוא מבנה פיזיולוגי חשוב במיקרו-סביבה של הגידול ובאתר של אינטראקציות מפתח ספציפיות לסוג התא 33,34,35. עירור של תאי דם אדומים (RBC) או פלזמת דם שימש כדי לדמיין את כלי הדם של הגידול, ובאמצעות עירור של שניים או שלושה פוטונים (2P; 3P) מדידת קצב זרימת הדם הוכחה כאפשרית³⁶. עם זאת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ניתנים לזיהוי בקלות על ידי חתימות הפלואורסצנטיות האנדוגניות שלהם, זיהוי של כלי דם קטנים עדינים, משתנים ופחות פלואורסצנטיים דורש מומחיות רבה יותר. קשיים מובנים אלה מעכבים פילוח תמונה אופטימלי. למרבה המזל, ניתן למדוד את המקורות הללו של פלואורסצנציה אנדוגנית (כלומר, תאי דם אדומים ופלסמה בדם) גם על ידי הדמיה פלואורסצנטית^{לכל החיים 37}, המנצלת את התכונות הפוטופיזיות הייחודיות של כלי הדם ומייצגת תוספת שימושית לארגז הכלים התוך-ורידי ההולך וגדל.

בפרוטוקול זה מתוארת זרימת עבודה לסגמנטציה של הדמיה תוך-לוויטלית ארבע-ממדית (4D) המשתמשת במפורש באותות פנימיים כמו פלואורסצנציה אנדוגנית ו-SHG מרכישה ועד ניתוח. פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד למחקרי אורך דרך חלון הדמיה של יונקים שבו פלואורסצנציה אקסוגנית עשויה להיות לא מעשית או אפשרית, כמו במקרה של מודלים של PDX. עם זאת, עקרונות הסגמנטציה המתוארים כאן ישימים באופן נרחב למשתמשים תוך-ורידיים החוקרים ביולוגיה של גידולים, התפתחות רקמות או אפילו פיזיולוגיה של רקמות תקינה. החבילה המדווחת של גישות הניתוח תאפשר למשתמשים להבדיל התנהגות תאית בין אזורים של תצורות סיבי קולגן מיושרות או אקראיות, להשוות מספרים או התנהגויות של תאים השוכנים באזורים ספציפיים של המיקרו-סביבה של הגידול, ולמפות את כלי הדם למיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אות נטול תוויות או פנימי בלבד. יחד, שיטות אלה יוצרות מסגרת תפעולית למקסום עומק המידע המתקבל מהדמיה תוך-ורידית 4D של בלוטת החלב תוך מזעור הצורך בתוויות אקסוגניות נוספות.

Protocol

כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. הרווחה וניהול הכאב בכל הניסויים בבעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה. לפיכך, נעשה כל מאמץ כדי לוודא שבעל החיים נוח ומטופל היטב בכל שלב של ההליך.

1. יצירת חלון הדמיה של יונקים (MIW)

1. כדי לבנות את חלון ההדמיה של החלב, יצרו טבעת 14 מ"מ מפלדת אל-חלד כירורגית.
2. נקו את מסגרת החלון הממוחשבת באמצעות תמיסה חמה של 5% חומר ניקוי, שטפו במשך 10 דקות תחת מים זורמים (DI), השרו ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן ייבשו מתחת למנורת חום. יש לאחסן באופן אוטומטי את מסגרת ה-MIW המיובשת ולאחסן אותה לשימוש מאוחר יותר.
3. הכן זכוכית כיסוי MIW כדלקמן: השרו את זכוכית הכיסוי העגולה #1.5 12 מ"מ ב-100% אתנול למשך 10 דקות, יבשו מתחת למנורת חום, ולאחר מכן הקפידו על מסגרת MIW המתכתית באמצעות דבק ציאנואקרילט. לרפא את הדבק למשך הלילה.
4. נקו את ה-MIW המורכב מעודף דבק באמצעות ספוגית אצטון, ונקו על ידי טבילתו ב-70% אתנול למשך 10 דקות. אפשרו לחלון המנוקה להתייבש. הכינו את ה-MIW מראש ואחסנו אותו בצלחת פטרי סטרילית לפני ההשתלה הניתוחית.

2. השתלה כירורגית של ה-MIW

1. כלים כירורגיים של Autoclave וחיטוי משטחים עם 70% אתנול לפני תחילת הניתוח להשתלת החלון.
2. בצע ניתוח על שולחן מחוטא באמצעות שמיכת חימום מכוסה בשדה סטרילי. הגדר את שמיכת החימום כך שהטמפרטורה הנמדדת על גבי השדה הסטרילי היא 40 מעלות צלזיוס.
3. השתמשו בתאורת עזר קרה כדי למנוע ייבוש רקמות. השתמש במשקפיים מגדילים כדי להקל על ההליך הכירורגי. לבשו PPE המורכב ממעיל מעבדה סטרילי וחד-פעמי, שרוולים כירורגיים, כפפות, הגנה על העיניים ומסכת פנים, כפי שהומלץ על ידי שיטות העבודה המומלצות הכירורגיות.
4. הרדמה את העכבר באמצעות מכונת אידוי הרדמה עם הגדרת איזופלורן של 2.0% וקצב זרימת חמצן של 2.0 ליטר לדקה. נהלו משכך כאבים (10 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם) בהזרקה תת עורית.
   הערה: ספקו מינונים נוספים בתוך 24 השעות הראשונות, רצוי כל 8-12 שעות ביומיים הראשונים לאחר הניתוח.
5. לאחר ההרדמה (אושרה על ידי אי תגובה לצביטת הבוהן), יש למרוח ג'ל לחות לעיניים כדי למנוע ייבוש של העיניים. השתמשו בקרם דפילטורי להסרת פרווה באתר הניתוח (בלוטת היונק המפשעה^{הרביעית} ) ולאחר מכן השטיפה עם גזה סטרילית ספוגת מים.
6. הכינו את האתר הכירורגי המדולדל לניתוח על ידי חיטוי משטח העור עם 3 קרצופי בטאדין ואתנול מתחלפים.
7. כדי להתחיל את הניתוח, להרים בעדינות את העור מעל בלוטת החלב 4 מספר 4 באמצעות מלקחיים. לאחר הסרת העור מדופן הגוף, יש להסיר חלק של כ-1 מ"מ של השכבה העורית בקצה המלקחיים באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים. אם מתרחש דימום, להפעיל לחץ עדין עם גזה סטרילית עד הדימום מפסיק.
   הערה: באופן כללי, לגידולים גדולים יותר יש פוטנציאל גדול יותר לדמם מאשר גידולים קטנים יותר או רקמות נורמליות.
8. נתקו את בלוטת החלב משכבת העור בתנועות עדינות של המלקחיים בפתח הניתוח כדי להימנע מחיתוך הבלוטה שמתחת.
9. צור חתך של 10 מ"מ ושחרר את בלוטת החלב משכבת העור בפריפריה, כך שניתן יהיה למקם תפרים מבלי לחדור לבלוטת החלב. הוסיפו PBS כדי לכסות את הבלוטה/הגידול שנחשף ולמנוע ייבוש.
10. צור תפר מיתר ארנק לאורך שולי הפתח באמצעות תפר קלוע משי 5-0. הכנס קצה של ה- MIW כך ששכבת העור תתחבר לחריץ המקבל של ה- MIW.
11. מתחו בעדינות את האפיתל בצד הנגדי של ה-MIW ודחפו את ה-MIW המתכתי למקומו כך שהשכבה העורית תפעיל באופן מלא את החריץ המקבל סביב כל היקף ה-MIW. כיווץ את מיתר הארנק בחוזקה כדי למשוך את השכבה העורית לתוך החריץ ולקשור אותה כדי לאבטח את ה-MIW באופן מלא.
12. הוסיפו אנטיביוטיקה מקומית לשכבת העור ב-MIW, ועקבו באופן רציף אחר העכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה. אחסנו את העכבר המושתל ב-MIW בנפרד על מצעים רכים עם איגלו שמונח בכלוב, ואפשרו לעכבר להתאושש במשך 48 שעות לפני ההדמיה.

3. מיקום ושמירה על העכבר על במת המיקרוסקופ להדמיה

1. הגדר את תא החימום על במת המיקרוסקופ. השתמש במערכת אוויר כפוי המוגדרת ל-30 °C (30 °F) או כל מערכת דומה אחרת. השתמש במחמם אובייקטיבי כדי למנוע סחף במיקוד z. אפשרו למערכת להגיע לשיווי משקל של לפחות שעה אחת לפני ההדמיה.
   הערה: עכברים מורדמים אינם מסוגלים לשמור כראוי על טמפרטורת הגוף שלהם, ולכן, יש צורך בסביבה מחוממת עבור כל רכישות קיטועי זמן . תנור החימום האובייקטיבי מסייע להילחם בהשפעות ההתפשטות התרמית, תופעה הגורמת לסחף בפוקוס z כאשר העדשה האובייקטיבית והרקמה המצולמת מגיעות לשיווי משקל תרמי.
2. לאחר שתא החימום במיקרוסקופ התייצב על 30 מעלות צלזיוס, הרדימו את העכבר המקבל עם הגדרות מכונת הרדמה של 2% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה.
3. לאחר שהעכבר מורדם (מאושר על ידי אי תגובה לצביטת הבוהן), נקו את החלק החיצוני של זכוכית MIW עם אפליקטור כותנה ומנקה זכוכית, הוסיפו משחה לעיניים למניעת ייבוש, והכניסו קטטר וריד זנב במידת הצורך.
4. כדי לשמור על הידרציה נכונה, תן זריקה ראשונית של 0.5 מ"ל PBS תת עורית או 100 μL דרך צנתר וריד הזנב. חזור על הפעולה כל 2 שעות למשך הפעלת ההדמיה.
5. לאחר שהעכבר הוכן כראוי, הגדר את המיקרוסקופ להדמיה. כדי להפחית את האידוי במהלך מדידות של קיטועי זמן, השתמשו בג'ל על בסיס מים במקום במים למדיית הטבילה. זה צריך להיעשות לפני הצבת העכבר על הבמה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הרכיבים האופטיים.
6. הניחו את העכבר על במת המיקרוסקופ, התאימו את צינור האיזופלורן ולחצו על צווארון ה-MIW לתוך חור קבלה של 14 מ"מ בתוסף הבמה כדי לייצב את התמונות. הביאו את שדה ההדמיה לפוקוס באמצעות עיני המיקרוסקופ והשתמשו בהארת שדה בהיר כדי לצפות בכלי הדם עם זרימת הדם.
7. בדוק את יציבות שדה הראייה. אם קיימים ממצאי תנועת נשימה, יש למרוח דחיסה עדינה על החלק האחורי של הבלוטה עם גוש קצף קטן ופיסת סרט דבק דמוית סיכה. לאחר הפעלת הדחיסה, ודא שזרימת הדם נשמרת בכל שדה הראייה.
8. התאם מעת לעת את רמות האיזופלורן במרווחים של 0.25% במהלך סשן ההדמיה כדי לשמור על רמה נכונה של הרגעה על ידי ספירה ידנית של הנשימה של בעלי חיים.
9. שמרו על קצב של 36-40 נשימות לדקה (סל"ד) כדי לשפר את תוחלת החיים ואת ההדמיה האופטית. קצבי נשימה נמוכים יותר יכולים לגרום לכך שהעכבר לא ישרוד את הניסוי, בעוד שקצבי נשימה מעל 60 סל"ד עלולים לגרום להרגעה לקויה, מה שעלול להגביר את הנשימה ואת תוצרי התנועה בנתוני התמונה.

4. הוקם עבור הדמיה תוך-ורידית דו-ממדית, מבוססת עוצמה ונטולת תוויות של התנהגות תאים דינמית

1. לאחר שהעכבר מורדם וממוקם בבטחה על שלב המיקרוסקופ ההפוך, התחל לאתר אזורי עניין.
2. באמצעות מקור אור המכוון ל-MIW, השתמשו בעיניים של המיקרוסקופ כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה. הוסף ושמור את מיקומי x, y בתוכנה כדי לחזור למיקומים אלה.
   הערה: הפרטים הקטנים של הגידול לא יהיו גלויים בקלות עם סוג זה של תאורה. המטרה היא פשוט לזהות אזורים להמשך חקירה. ההתמקדות היא בראיית כלי הדם וזרימת הדם.
3. לאחר שנשמרו מספר מיקומים בתוכנה, הצג בתצוגה מקדימה את שדות התצוגה שנבחרו באמצעות עירור של 890 ננומטר וקוביית המסנן FAD/SHG. השתמש בזמן שהייה מרבי של 4 μs עם הספק נמוך יותר והגדרת PMT גבוהה. המטרה היא להציג תצוגה מקדימה של שדות הראייה מבלי לחשוף יתר על המידה את הרקמה לאור לייזר מוגזם.
4. לאחר שהוגדרו רמות הספק מתאימות, הגדר את ערימות z. שימו לב למראה של סיבי קולגן שופעים (SHG) בטמפרטורה של 20-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הזכוכית של MIW. קולגן יהפוך לנפוץ פחות ככל שהמיקרוסקופ ישקע עמוק יותר לתוך הגידול (איור 1B). חללים ב- SHG חושפים את מיקומם של מסות הגידול.
5. הגדר את פרוסת z העליונה, מתחת לשכבת התאים הבודדים שבה סיבי הקולגן הראשונים מופיעים על ~ 50-100 מיקרומטר. הגדר את פרוסת z התחתונה על ~ 250 מיקרומטר, שם הסיבים דוהים החוצה והאות הלקוי שולט. חזור על פעולה זו עבור כל מיקומי x-y שנשמרו.
6. לאחר הגדרת טווח z-stack, הגדל את זמן השהייה (עד 8 μs) ובצע אופטימיזציה של הגדרות החשמל והגלאי. מטב את רמות ההספק לפי הצורך כדי להלהיב את הרקמה עבור כל ניסוי. שימוש בהספקים של עד 90 mW ב- 750 ננומטר או 70 mW ב- 890 ננומטר בפתח האחורי של המטרה הם בטווח מקובל.
   הערה: עומק ההדמיה, כמות הפיזור בתוך הרקמה, המאפיינים האובייקטיביים ורגישות הגלאי ישפיעו כולם באופן משמעותי על כמות הכוח הדרושה לקבלת תמונה.
7. התאם את מרווחי הזמן בהתאם למטרות הניסוי. התחילו במרווחים של 10 דקות בין נקודות איסוף עבור רוב סרטי ההעברה התוך-לוויראליים.
8. אף על פי שעירור 2P עדין על תאים ורקמות, היו מודעים לסימנים של פוטוטוקסיות, כמו הלבנת תאים או הגדלה מהירה של האוטו-פלואורסצנציה, והלבנת פוטו-אקונומיקה מוגזמת. הפחת את עוצמת הלייזר או הגדל את מרווחי הזמן כפי שהתנאים מציינים.

5. הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) של NAD(P)H

1. תוך שמירה על מיקומי ה-x-y מרכישות טווחי הזמן, הגדירו את המיקרוסקופ לאיסוף ערימת FLIM. הכנס מסנן 440/80 למחזיק מסנן מול גלאי GaAsP, והגדר את מתח גלאי GaAsP ל-800 בתוכנה. כבה את אורות החדר כאשר הגלאים דולקים.
2. בתוכנה, עברו מהדמיית עוצמה מבוססת גלוונומטר למצב הדמיית FLIM.
3. לצורך זיהוי ומיסוך כלי הדם, הגדר את הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים. לאיסוף מידע מטבולי משלים, הגדר את הרזולוציה ל- 256 x 256 פיקסלים כדי להגדיל את הרזולוציה הזמנית של חתימת החיים. הגדר את זמן השהייה ל- 4 μs וכוונן את הלייזר ל- 750 ננומטר.
4. התחל בסריקת תצוגה מקדימה והתחל לכוונן את עוצמת הלייזר. התאם את עוצמת הלייזר עד שהקריאה עבור מפלה השברים הקבוע (CFD) תהיה בין 1 x 10⁵ ל- 1 x 10⁶. אין לחרוג מ-1 x 10⁶ מכיוון שהדבר יגרום לערימת פוטונים ולתוצאות כלליות גרועות.
5. לאחר הגדרת רמת ההספק, הגדר את זמן האינטגרציה בין 90 שניות ל- 120 שניות והתחל את אוסף FLIM. הוא ירכוש פוטונים משדה הראייה למשך הזמן המוקצב.
6. אופציונלי: לאחר שכל האוספים הדרושים נעשו והעכבר הוסר מהבמה, אסוף פונקציית תגובה למכשיר (IRF). מדוד את ה- IRF על ידי הדמיית פני השטח של גבישי אוריאה הזמינים באופן מסחרי בצלחת תחתית זכוכית עם אותם פרמטרים והגדרה המשמשת להדמיית הרקמה.
   הערה: ה- IRF לוקח בחשבון עיכובים או השתקפויות כלשהם עקב ההתקנה האלקטרונית או האופטית. ה-IRF מעורב בכל רכישות ה-FLIM, וביטולו מהנתונים יכול לשפר את הדיוק של עקומות דעיכה פלואורסצנטיות מחושבות. עם זאת, ה-IRFs המחושבים יכולים לעתים קרובות לשכפל באופן סביר את איכות עקומות הדעיכה הפלואורסצנטיות מ-IRF שנמדדו. מומלץ למדוד את ה-IRF עד שייקבע כי ה-IRF המחושב יניב התאמות שוות ערך של עקומות הדעיכה ויעריך כראוי את התוצאות מה-IRF הנמדד.

6. ניתוח תמונות של NADH לכל החיים

1. פתח את תוכנת FLIM ויבא את תמונת החיים של NAD(P)H ממערך הנתונים. לקבלת פרטים נוספים על אופן השימוש הנכון בתוכנה, עיין בספרי ההדרכה לכל החיים הפלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים).
2. כדי להתחיל, הגדר את פרמטרי המודל בתוכנה. בשורת התפריטים, לחץ על אפשרויות > דגם. בחר את התיבות הבאות: הגדרות > דעיכה מרובת אקספוננציאליים, שיטת התאמה > MLE, ריבוע > של Binning מרחבי, שיא > סף וסמן את תיקון Shift לפני חישוב התמונה.
3. בשורת התפריטים, לחץ על צבע > A₁% מהתפריט הנפתח. בצד ימין של החלון, הגדר אותו כהתאמה של שלושה רכיבים. הגדר את גודל הפח > 3.
4. התאם את > הסף ~ 10. הערך מחדש את דיוק הסף לאחר שמטריצת הדעיכה חושבה בפעם הראשונה.
5. תקן את τ1 עד 200 ps. זה מייצג את אורך החיים הקצר של תאי הדם האדומים. נסו למצוא את הערך המתאים ביותר למספר כתמים בכלי הדם הגדול יותר, אותם ניתן לראות בתמונת העוצמה. תקן את τ2 עד 1200 ps. זה מייצג את אורך החיים הארוך של תאי הדם האדומים.
   הערה: הערכים המוגדרים הם רק נקודת ההתחלה. הערכים יצטרכו להיות מותאמים כדי להוציא את כלי הדם יותר. ברוב המקרים, אך לא תמיד, ערכים אלה יפחתו.
6. תחת חישוב בשורת התפריטים, בחר מטריצת דעיכה. פעולה זו תיצור תמונות ראשוניות של A₁% לכל החיים כאשר לכלי הדם יש ערכים גבוהים. השתמש בסמן (הכוונת) כדי לרחף מעל כלי הדם. באופן שיטתי ואחד בכל פעם, צף (בטל את סימון תיבת התיקון ) את τ1 ו- τ2. רשום ערכים אלה מכיוון שהם יעזרו למטב את הפרמטרים הקבועים.
   הערה: המטרה היא לא בהכרח לקבל את הערכים המדויקים ביותר בתמונה, אלא למקסם את הפער בין כלי הדם לרקמה מבלי להקטין באופן דרמטי את האזור שזוהה כ-vasculature.
7. לאחר שזוהו הפרמטרים המתאימים עבור τ1 ו- τ2, בשורת התפריטים בחר חשב > עיבוד אצווה. ודא שרוב ההגדרות דומות בין z-slices.
8. הקפידו לוודא שאין הגדרה אחת שונה בתכלית מהאחרות. אם כן, התאם תחילה את המשמרת ונסה שוב. אם הבעיה נמשכת, התאמה מחדש באמצעות פרמטרים חדשים. תזוזה שגויה יכולה להיות גורם גדול לרעש בהתקפים ויכולה להגדיל את_{ערכי A 1}% באזורי הגידול הסמוכים.
9. בכרטיסייה תפריט, שמור את הקבצים ולאחר מכן ייצא קבצים A₁%. העלה קבצים אלה ב- ImageJ לצורך מיסוך ופילוח.

7. פילוח תמונה של כלי הדם

1. פתח את ImageJ ויבא את התמונה A₁% כתמונת טקסט. חזור על פעולה זו עבור כל התמונות בתוך הערימה.
2. עם כל התמונות של A₁% פתוחות, בחר תמונה > Stack > Z-Project. השתמש בהקרנת העוצמה המרבית ושמור את התמונות. ראה נתונים משלימים 1 לקבלת תמונה מייצגת.
3. עבור אל תוספים > סגמנטציה. בחר את תוסף הסגמנטציה של WEKA^{הניתן לאימון 38}.
4. לאחר פתיחת חלון WEKA, השתמש בהגדרות ברירת המחדל והתחל לאמן את התוכנה על ידי יצירת שתי מחלקות וקווי מעקב מעל כלי הדם (אזורים גבוהים של A₁% ) ואזורים שאינם כלי דם (אזורים נמוכים של_{A 1}%).
5. המשך להוסיף עקבות חדשים לשתי המחלקות עד שהתוכנה תזהה באופן עקבי את אזורי A_{הגבוהים של 1}% של כלי הדם תוך ביטול אזורים גבוהים יותר של רעשי רקע. ראה מודל משלים עבור מודל מסווג מייצג.
6. לאחר הפקת התמונה המסווגת, לחץ על תמונה > הקלד > 8 סיביות. סף את התמונה וצור מסיכה. אם עדיין יש צורך לנקות עוד יותר את תמונת הסף, השתמש בפונקציה Analyze Particles .
7. התאם את הגודל והעגוליות עד שלא ייכללו אזורים קטנים ועגולים יותר של תמונת הסף. מתקבלת מסכה נקייה עם כלי הדם בלבד ומעט מאוד רקע.
8. לחץ על ערוך > בחירה > צור בחירה. העבר את הבחירה למנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על ניתוח כלי > > מנהל ההחזר על ההשקעה.
9. שכפל את התמונה המסווגת. המשך לעבד > בינארי. כדי להרחיב את המסכה ולהגדיר את המרחק מהכלוב שייכלל בפילוח התמונה, בחר הרחבה. חזרו על הפעולה עד שהמסיכה התרחבה לטווח הרצוי. הקלט אזור עניין זה (ROI) במנהל ההחזר על ההשקעה.
   הערה: המטרה של שלב זה היא לכמת את הכמות או ההתנהגות בתוך קרבה מסוימת של כלי הדם (לדוגמה, מספר התאים הקיימים בתוך X μm של כלי הדם). כמות ההתרחבות הנדרשת נקבעת כולה על ידי השאלה המדעית.
10. כדי לכמת את מספר התאים באזורים המגבילים, בחר את החלון (תמונה/ערוץ) המעניין. זה יכול להיות כל חלון שחולק את אותו שדה ראייה כמו מסכת כלי הדם. החל את שני החזרי ההשקעה באמצעות הפונקציה XOR מהתפריט הנפתח.
    הערה: פעולה זו תמדוד את הפריטים במרחק הרצוי ממאגר כלי הדם, למעט כלי הדם עצמו. לאחר מכן ניתן להשתמש בגישת ROI משולבת זו כדי למדוד מספר רב של פרמטרים, כגון עוצמה, מספר תא או העברה.

8. פילוח תמונה של קן הגידול

1. פתח את תמונת NADH מסריקה בעוצמה גבוהה או מאוסף FLIM ברזולוציה גבוהה ב- ImageJ.
   הערה: ניתן לעשות זאת על פרוסות z בודדות, ערימות מלאות, או להחיל על הקרנות z של כמה פרוסות.
2. עבור אל תוספים > סגמנטציה. בחר את תוסף הפילוח של WEKA הניתן לאימון.
3. לאחר פתיחת חלון WEKA, השתמש בהגדרות ברירת המחדל והתחל לאמן את התוכנה לשתי מחלקות של אזורים גבוהים של NADH ואזורים נמוכים של NADH. באזורים הגבוהים של NADH תהיה תבנית מאוד ברורה של תאים עם גרעינים והתוכנה תזהה אותה בקלות.
4. ממשיכים לעבור הלוך ושוב עם שכבת העל כדי לחדד את האלגוריתם עם הכשרה נוספת עד שהוא מזהה את כל אזורי הגידול כפי שנקבעו על ידי העין והידע המוקדם של המורפולוגיה של הגידול. זהו תהליך איטרטיבי.
5. לאחר שהאלגוריתם מזהה את כל האזורים של הגידול, בחר בלחצן צור תוצאה . זה יפיק תמונה חדשה. שכפל תמונה זו.
6. בחר את התמונה המשוכפלת הראשונה והמרה אותה לתמונה של 8 סיביות על-ידי בחירה באפשרות 'סוג > תמונה' > 8 סיביות. סף תמונה זו כדי ליצור מסיכה בינארית. לאחר מכן צור בחירה והעבר אותה למנהל ההחזר על ההשקעה. ROIs אלה יגדירו את הסטרומה.
7. בחר את השנייה של התמונה המשוכפלת והמר אותה לתמונה של 8 סיביות. הפוך תמונה זו על-ידי בחירת תמונה > ערוך > Invert ולאחר מכן סף תמונה זו כדי ליצור מסיכה בינארית. שוב ליצור בחירה ולהעביר אותה למנהל ההחזר על ההשקעה. החזר השקעה זה יגדיר את קן הגידול.

9. פילוח תמונה לפי ארגון סיבים או יישור

1. כדי להתחיל, פתח את תמונות SHG, הכן כל הקרנה z והערך את הצורך בכל עיבוד מקדים. לקבלת תוצאות טובות, נדרשות תמונות באיכות גבוהה עם סיבים הניתנים להבחנה ורעש נמוך.
2. אופציונלי: לעיבוד מקדים ב- ImageJ כדי להגביר את האות לרעש (SNR) של ערוץ SHG, הפחת את הרקע באמצעות חיסור כדור מתגלגל. עבור רוב היישומים, השתמש בחיסור כדור מתגלגל בין 20 פיקסלים ל-50 פיקסלים. לאחר מכן החליקו את התמונה ושמרו אותה.
3. פתח את התוסף OrientationJ והגדר את פרמטרי העיבוד. בחלון DirectionJ, הגדר את גודל חלון הטנזור המקומי. לקבלת תמונה של פי 20 מצפיפות סיבים זו, הגדר 10 פיקסלים עד 15 פיקסלים כנקודת התחלה.
4. בחר קו מעוקב Spline כמודל מעבר הצבע וסמן את תיבת סקר הצבעים. הגדר את סקר הצבעים. הגדר גם את הגוון וגם את הרוויה כקוהרנטיות, ולאחר מכן הגדר את הבהירות כתמונה מקורית, לחץ על Run.
5. קובץ הפלט של התוסף הוא מפת צבעים RGB. התאם את הערך של חלון הטנזור המקומי עד שאזורים מיושרים, כפי שנקבע על ידי העין, מודגשים כראוי בגווני כחול ומג'נטה.
6. לאחר שתמונת הפלט משביעת רצון, הפרד תמונת RGB זו לשלושה ערוצים. בחר תמונה > צבע > ערוץ מפוצל.
7. כדי לשפר את המראה של אזורים מיושרים לצורך מיסוך, השתמש במחשבון התמונה על-ידי בחירה במחשבון תמונה > תהליך. באמצעות אופרטור זה, הפחת את התמונה הירוקה מהתמונה הכחולה. לקבלת מסיכה מגבילה יותר, הפחת את התמונה הירוקה מהתמונה האדומה. עבור אזורים אקראיים, הפחת את הערוץ הכחול מהערוץ הירוק.
8. סף התמונה המתקבלת באמצעות אלגוריתם 'רגעים' . ברוב המקרים, זה לא צריך התאמות נוספות. עם זאת, התאם במידת הצורך. זה יפיק תמונה בינארית.
9. לאחר יצירת התמונה הבינארית, מלא את החורים על-ידי בחירה > תהליך > בינארי למלא חורים בין סיבים ולעגל את גבולות המסיכה באמצעות מסנן חציוני. מסנן חציוני של 10 הוא נקודת התחלה טובה, התאם אותו כך שיתאים לנתונים. בדוק ידנית את המסכה להסכם והסר את כל ה- ROIs השגויים.
10. לאחר שהמסיכה משביעת רצון, צור בחירה על-ידי בחירה באפשרות ערוך > > צור בחירה. העבר בחירה זו למנהל ההחזר על ההשקעה.

תוצאות

ההתקנה של MIW ותכנון ניסיוני בסיסי הם הצעדים הראשונים בתהליך זה. העיצוב והפרוטוקול הספציפיים האלה של MIW נוחים יותר למחקרי אורך¹⁹ , והם נוצלו בהצלחה עם מיקרוסקופים זקופים והפכים כאחד. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך מכיוון שהוא הביא ליציבות תמונה גבוהה יותר של בלוטת החלב עם ?...

Discussion

הדמיה תוך-ורידית 4D היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות דינמיות בהקשר המרחבי והזמני של המיקרו-סביבה של הגידול הטבעי. כתב יד זה מספק מסגרת תפעולית בסיסית מאוד וניתנת להתאמה כדי למדר אינטראקציות של תאים דינמיים בתוך מסת הגידול, הסטרומה הסמוכה, או בסמיכות לרשת כלי הדם באמצעות אותות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF