Une approche de segmentation sans étiquette pour l’imagerie intravitale du microenvironnement tumoral mammaire

Résumé

La méthode d’imagerie intravitale décrite ici utilise la deuxième génération harmonique de collagène et la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H pour segmenter de manière non invasive un microenvironnement tumoral non marqué en compartiments tumoral, stromal et vasculaire pour une analyse approfondie des images intravitales 4D.

Résumé

La capacité de visualiser des interactions physiologiques complexes et dynamiques entre de nombreux types de cellules et la matrice extracellulaire (ECM) dans un microenvironnement tumoral vivant est une étape importante vers la compréhension des mécanismes qui régulent la progression tumorale. Bien que cela puisse être accompli grâce aux techniques actuelles d’imagerie intravitale, cela reste difficile en raison de la nature hétérogène des tissus et de la nécessité d’un contexte spatial dans l’observation expérimentale. À cette fin, nous avons développé un flux de travail d’imagerie intravitale qui associe l’imagerie de deuxième génération harmonique de collagène, la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H et la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) comme moyen de compartimenter de manière non invasive le microenvironnement tumoral en domaines de base du nid tumoral, du stroma ou ECM environnant et du vascularisation. Ce protocole non invasif détaille le processus étape par étape allant de l’acquisition d’images time-lapse de modèles de tumeurs mammaires à l’analyse post-traitement et à la segmentation d’images. Le principal avantage de ce flux de travail est qu’il exploite les signatures métaboliques pour contextualiser le microenvironnement tumoral vivant en évolution dynamique sans l’utilisation d’étiquettes fluorescentes exogènes, ce qui le rend avantageux pour les modèles de xénogreffes dérivées du patient humain (PDX) et l’utilisation clinique future où les fluorophores extrinsèques ne sont pas facilement applicables.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) dans le microenvironnement tumoral est connue pour être déposée dynamiquement et remodelée par plusieurs types de cellules pour faciliter davantage la progression de la maladie ^1,2,3. Ces altérations de matrice fournissent des indices mécaniques et biologiques qui modifient le comportement cellulaire et entraînent souvent un cycle continu de remodelage de la matrice⁴. L’étude de l’interaction dynamique et réciproque entre les cellules tumorales et la matrice extracellulaire est souvent menée à l’aide de cultures in vitro tridimensionnelles (3D) ou de systèmes microfluidiques. Alors que ces approches ascendantes ont démontré des mécanismes de remodelage ECM ^5,6,7, une prolifération accrue⁸, une transition épithéliale à mésenchymateuse ^9,10,11,12 et une migration et une invasion des cellules ^{tumorales 7,13,14,15,16} , ils se sont principalement concentrés sur quelques types de cellules (par exemple, les cellules tumorales ou les fibroblastes) au sein d’une matrice 3D homogène par rapport à la diversité et à l’hétérogénéité des interactions présentes dans un tissu physiologique. En plus des systèmes in vitro, l’histologie tumorale ex vivo peut également fournir un aperçu de ces interactions cellule-cellule et cellule-ECM¹⁷. L’immunohistochimie a l’avantage de pouvoir analyser plusieurs types de cellules par rapport à la composition et à l’architecture spatialement hétérogènes de l’ECM, mais les paramètres statiques des tissus fixes ne capturent pas la nature dynamique des interactions entre les cellules et le microenvironnement. L’imagerie intravitale a ouvert la porte à l’interrogation d’interactions diverses et dynamiques dans le contexte physiologique du microenvironnement tumoral natif.

Les capacités de l’imagerie tumorale intravitale progressent rapidement. Les améliorations apportées à la conception des fenêtres d’imagerie et aux techniques chirurgicales d’implantation des fenêtres ont permis l’imagerie tumorale longitudinale à long terme à divers endroits anatomiques (c.-à-d. tumeur primaire, ganglions lymphatiques, sites métastatiques 18,19,20). De plus, la capacité de l’instrumentation optique à visualiser et à recueillir des données dans de multiples dimensions (c.-à-d. spectrale, intensité de fluorescence spatiale et durée de vie), ainsi qu’à haute résolution et vitesse (taux vidéo) devient largement accessible. La technologie améliorée offre l’occasion d’explorer les changements rapides dans la signalisation cellulaire et la dynamique phénotypique dans un environnement physiologique. Enfin, l’expansion des outils optogénétiques et le large éventail de constructions fluorescentes génétiques permettent le marquage de types cellulaires spécifiques pour capturer la migration cellulaire dans le microenvironnement tumoral ou le traçage de la lignée cellulaire au cours du développement ou de la progression de la maladie^21,22. L’utilisation de ces outils en combinaison avec la technologie CRISPR/Cas9 offre aux chercheurs la possibilité de générer des modèles animaux uniques en temps opportun.

Bien que toutes ces avancées fassent de l’imagerie intravitale une méthode de plus en plus puissante pour explorer les interactions cellulaires dynamiques et physiologiques, il existe encore un besoin important de développer des stratégies qui fournissent un contexte spatial, temporel et structurel au niveau tissulaire à ces interactions biologiques. Actuellement, de nombreuses études d’imagerie intravitale compensent le manque de repères visuels tels que les vaisseaux sanguins en injectant des colorants fluorescents dans le système vasculaire ou en utilisant des modèles murins qui expriment de manière exogène des protéines fluorescentes pour délimiter les caractéristiques physiques. Les colorants injectables et les substrats comme le dextrans fluorescent sont largement utilisés pour marquer avec succès le système vasculaire dans les collections intravitales^{19, 23, 24}. Cependant, cette approche n’est pas sans limites. D’une part, il nécessite des manipulations de souris supplémentaires et son utilité se limite à des expériences à court terme. Pour les études longitudinales, le dextran fluorescent peut être problématique car nous observons l’accumulation de dextran dans les cellules phagocytaires ou la diffusion dans les tissus environnants au fil du temps²⁵. L’incorporation de protéines fluorescentes exogènes dans le modèle murin a été présentée comme une alternative au dextrans fluorescent, mais présente ses propres limites. La disponibilité et la diversité des fluorophores exogènes dans les modèles murins sont encore limitées et coûteuses à créer. De plus, dans des modèles spécifiques, tels que les modèles PDX, les manipulations génétiques ne sont ni souhaitables ni possibles. Il a également été démontré que la présence de protéines fluorescentes ou bioluminescentes dans les cellules est reconnue comme étrangère chez la souris, et dans les modèles murins immunocompétents, cela réduit la quantité de métastases dues à la réponse du système immunitaire de l’hôte^26,27. Enfin, les protéines fluorescentes exogènes ou les colorants fluorescents utilisés pour le contexte spatial ou pour segmenter les données ultérieures occupent souvent des plages premières du spectre lumineux qui pourraient autrement être utilisées pour étudier les interactions physiologiques d’intérêt.

L’utilisation du signal intrinsèque de l’ECM ou de la fluorescence endogène des cellules à l’intérieur du tissu représente un moyen universel potentiel sans étiquette de segmenter les données intravitales pour une analyse cellulaire et spatiale plus approfondie. La deuxième génération harmonique (SHG) a longtemps été utilisée pour visualiser l’ECM²⁸. Avec le développement ultérieur d’outils importants pour aider à la caractérisation de l’organisation des fibres 29,30,31, il est possible de caractériser le comportement cellulaire par rapport à la structure ECM locale. De plus, l’autofluorescence du métabolite endogène, le NAD(P)H, fournit un autre outil sans étiquette pour compartimenter le microenvironnement tumoral in vivo. Le NAD(P)H fluoresce brillamment dans les cellules tumorales et peut être utilisé pour distinguer les limites du nid tumoral en croissance de son stroma^{environnant 21,32}. Enfin, le système vasculaire est une structure physiologique importante dans le microenvironnement tumoral et le site d’interactions clés spécifiques au type de cellule 33,34,35. L’excitation des globules rouges (RBC) ou du plasma sanguin a été utilisée pour visualiser le système vasculaire tumoral, et en utilisant l’excitation à deux ou trois photons (2P; 3P), la mesure des débits sanguins s’est avérée possible³⁶. Cependant, alors que les gros vaisseaux sanguins sont facilement identifiables par leurs signatures de fluorescence endogènes, l’identification de petits vaisseaux sanguins subtils, variables et moins fluorescents nécessite plus d’expertise. Ces difficultés inhérentes entravent une segmentation optimale de l’image. Heureusement, ces sources de fluorescence endogène (c’est-à-dire les globules rouges et le plasma sanguin) peuvent également être mesurées par l’imagerie de fluorescence^{à vie 37}, qui capitalise sur les propriétés photophysiques uniques du système vasculaire et représente un ajout utile à la boîte à outils intravitale en croissance.

Dans ce protocole, un flux de travail pour la segmentation de l’imagerie intravitale en quatre dimensions (4D) utilisant explicitement des signaux intrinsèques tels que la fluorescence endogène et le SHG est décrit de l’acquisition à l’analyse. Ce protocole est particulièrement pertinent pour les études longitudinales à travers une fenêtre d’imagerie mammaire où la fluorescence exogène peut ne pas être pratique ou possible, comme c’est le cas avec les modèles PDX. Les principes de segmentation décrits ici, cependant, sont largement applicables aux utilisateurs intravitaux qui étudient la biologie tumorale, le développement tissulaire ou même la physiologie tissulaire normale. La suite d’approches d’analyse rapportée permettra aux utilisateurs de différencier le comportement cellulaire entre les régions de configurations de fibres de collagène alignées ou aléatoires, de comparer les nombres ou les comportements des cellules résidant dans des régions spécifiques du microenvironnement tumoral et de cartographier le système vasculaire au microenvironnement tumoral en utilisant uniquement un signal intrinsèque ou sans étiquette. Ensemble, ces méthodes créent un cadre opérationnel pour maximiser la profondeur de l’information obtenue grâce à l’imagerie intravitale 4D de la glande mammaire tout en minimisant le besoin d’étiquettes exogènes supplémentaires.

Protocole

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison. Le bien-être et la gestion de la douleur dans toutes les expériences sur les animaux sont primordiaux. Ainsi, tous les efforts sont faits pour s’assurer que l’animal est à l’aise et bien soigné à chaque étape de la procédure.

1. Génération de la fenêtre d’imagerie mammaire (MIW)

1. Pour construire la fenêtre d’imagerie mammaire, fabriquez un anneau de 14 mm en acier inoxydable de qualité chirurgicale.
2. Nettoyez le cadre de fenêtre usiné à l’aide d’une solution chaude de détergent nettoyant à 5%, rincez pendant 10 minutes sous l’eau désionisée courante (DI), trempez dans de l’éthanol à 100% pendant 10 minutes, puis séchez sous une lampe chauffante. Autoclavez le cadre MIW séché et rangez-le pour une utilisation ultérieure.
3. Préparez le verre de couverture MIW comme suit: Faites tremper le verre de couverture ronde #1.5 de 12 mm dans de l’éthanol à 100% pendant 10 min, séchez sous une lampe chauffante, puis fixez-le au cadre MIW métallique à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate. Durcissez l’adhésif pendant la nuit.
4. Nettoyez le MIW assemblé de l’excès d’adhésif à l’aide d’un écouvillon imbibé d’acétone et nettoyez-le en le submergeant dans de l’éthanol à 70% pendant 10 min. Laissez sécher la fenêtre nettoyée. Préparez le MIW à l’avance et conservez-le dans une boîte de Petri stérile avant l’implantation chirurgicale.

2. Implantation chirurgicale du MIW

1. Autoclavez les outils chirurgicaux et désinfectez les surfaces avec 70% d’éthanol avant de commencer la chirurgie pour l’implantation de la fenêtre.
2. Effectuez une intervention chirurgicale sur une table désinfectée à l’aide d’une couverture chauffante recouverte d’un champ stérile. Réglez la couverture chauffante de telle sorte que la température mesurée au-dessus du champ stérile soit de 40 °C.
3. Utilisez un éclairage froid auxiliaire pour aider à prévenir le séchage des tissus. Utilisez des loupes pour faciliter l’intervention chirurgicale. Portez un EPI composé d’une blouse de laboratoire stérile à usage unique, de manches chirurgicales, de gants, d’une protection oculaire et d’un masque facial, comme le recommandent les meilleures pratiques chirurgicales.
4. Anesthésiez la souris à l’aide d’un vaporisateur d’anesthésie avec un réglage isoflurane de 2,0% et un débit d’oxygène de 2,0 L / min. Administrer un analgésique (10 mg/kg de méloxicam) par injection sous-cutanée.
   REMARQUE: Fournir des doses supplémentaires dans les 24 premières heures, de préférence toutes les 8-12 heures pendant les 2 premiers jours après la chirurgie.
5. Une fois anesthésié (confirmé par aucune réponse au pincement des orteils), appliquez un gel hydratant pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux. Utilisez une crème dépilatoire pour enlever la fourrure au site de la chirurgie (4^ème glande mammaire inguinale) suivie d’un rinçage avec de la gaze stérile imbibée d’eau.
6. Préparez le site chirurgical épilé pour la chirurgie en désinfectant la surface de la peau avec 3 gommages alternés à la bétadine et à l’éthanol.
7. Pour commencer la chirurgie, soulevez doucement la peau sur la 4ème glande mammaire numéro 4 à l’aide d’une pince. Une fois que la peau est retirée de la paroi corporelle, retirez une section d’environ 1 mm de la couche dermique à l’extrémité de la pince avec des micro-ciseaux chirurgicaux. En cas de saignement, appliquez une légère pression avec de la gaze stérile jusqu’à ce que le saignement cesse.
   REMARQUE: En général, les tumeurs plus grosses ont un plus grand potentiel de saignement que les tumeurs plus petites ou les tissus normaux.
8. Détachez la glande mammaire de la couche dermique avec des mouvements doux de la pince à l’ouverture chirurgicale pour éviter de couper la glande sous-jacente.
9. Créez une incision de 10 mm et libérez la glande mammaire de la couche dermique à la périphérie afin que les sutures puissent être placées sans pénétrer dans la glande mammaire. Ajouter pbS pour couvrir la glande / tumeur exposée et pour prévenir le dessèchement.
10. Créez une suture de cordon de bourse le long de la périphérie de l’ouverture à l’aide d’une suture tressée en soie 5-0. Insérez un bord du MIW de sorte que la couche dermique s’engage dans l’encoche de réception du MIW.
11. Étirez doucement l’épithélium du côté opposé du MIW et poussez le MIW métallique en place de sorte que la couche dermique engage pleinement l’encoche réceptrice autour de toute la circonférence MIW. Serrez fermement le cordon de la bourse pour attirer la couche dermique dans l’encoche et attachez-la pour sécuriser complètement le MIW.
12. Ajoutez un antibiotique topique à la couche dermique au MIW et surveillez continuellement la souris jusqu’à ce qu’elle ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale. Hébergez la souris implantée MIW séparément sur une litière souple avec un igloo placé dans la cage et laissez la souris récupérer pendant 48 h avant l’imagerie.

3. Positionnement et maintien de la souris sur l’étage du microscope pour l’imagerie

1. Installez la chambre de chauffage sur l’étage du microscope. Utilisez un système à air pulsé réglé sur 30 °C ou tout autre système similaire. Utilisez un réchauffeur d’objectif pour éviter la dérive dans la mise au point z. Laisser le système s’équilibrer pendant au moins 1 h avant l’imagerie.
   REMARQUE: Les souris anesthésiées sont incapables de maintenir correctement leur température corporelle et, par conséquent, il est nécessaire d’avoir un environnement chauffé pour toute acquisition en accéléré. Le réchauffeur d’objectif aide à lutter contre les effets de la dilatation thermique, un phénomène qui provoque une dérive de la mise au point z lorsque la lentille de l’objectif et le tissu photographié atteignent l’équilibre thermique.
2. Une fois que la chambre chauffante du microscope s’est stabilisée à 30 °C, anesthésiez la souris receveuse avec des réglages de l’appareil d’anesthésie de 2% d’isoflurane et un débit d’oxygène de 2 L / min.
3. Une fois la souris sous sédation (confirmée par une absence de réponse au pincement des orteils), nettoyez l’extérieur du verre MIW avec un applicateur de coton et un nettoyant pour vitres, ajoutez une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement et insérez un cathéter de la veine caudale si nécessaire.
4. Pour maintenir une bonne hydratation, administrer une injection initiale de 0,5 mL de PBS par voie sous-cutanée ou de 100 μL par le cathéter de la veine caudale. Répétez toutes les 2 h pendant toute la durée de la séance d’imagerie.
5. Une fois que la souris a été correctement préparée, configurez le microscope pour l’imagerie. Pour réduire l’évaporation pendant les mesures en accéléré, utilisez un gel à base d’eau au lieu d’eau pour le milieu d’immersion. Cela devrait être fait avant de placer la souris sur la scène. Veuillez consulter le tableau des matériaux pour plus de détails sur les composants optiques.
6. Posez la souris sur l’étage du microscope, installez le tuyau d’isoflurane et appuyez sur le collier du MIW dans un trou de réception de 14 mm dans l’insert de la scène pour stabiliser les images. Mettez le champ d’imagerie au point à l’aide des oculaires du microscope et utilisez l’éclairage en champ lumineux pour observer le flux vasculaire avec le flux sanguin.
7. Vérifiez la stabilité du champ de vision. Si des artefacts de mouvement respiratoire sont présents, appliquez une compression douce à l’arrière de la glande avec un petit bloc de mousse et un morceau de ruban adhésif ressemblant à de la teinture. Après l’application de la compression, vérifiez que le flux sanguin est maintenu dans tout le champ de vision.
8. Ajuster périodiquement les niveaux d’isoflurane par incréments de 0,25% pendant la séance d’imagerie pour maintenir un niveau approprié de sédation en comptant manuellement la respiration animale.
9. Maintenir un taux de 36 à 40 respirations par minute (tr/min) pour améliorer la longévité des animaux et l’imagerie optique. Des taux de respiration plus faibles peuvent empêcher la souris de survivre à l’expérience, tandis que des taux de respiration supérieurs à 60 tr / min peuvent entraîner une mauvaise sédation, ce qui peut augmenter la respiration et les artefacts de mouvement dans les données d’image.

4. Configuration pour l’imagerie intravitale 4D, basée sur l’intensité et sans étiquette, du comportement dynamique des cellules

1. Une fois que la souris est sous sédation et solidement positionnée sur l’étage du microscope inversé, commencez à localiser les régions d’intérêt.
2. À l’aide d’une source lumineuse dirigée vers le MIW, utilisez les oculaires du microscope pour identifier les zones potentielles d’investigation. Ajoutez et enregistrez les positions x, y dans le logiciel pour revenir à ces positions.
   REMARQUE: Les détails fins de la tumeur ne seront pas facilement visibles avec ce type d’éclairage. L’objectif est simplement d’identifier les régions pour une enquête plus approfondie. L’accent est mis sur la vision du système vasculaire et du flux sanguin.
3. Une fois que plusieurs positions ont été enregistrées dans le logiciel, prévisualisez les champs de vision choisis à l’aide d’une excitation de 890 nm et du cube de filtre FAD/SHG. Utilisez un temps de séjour maximal de 4 μs avec une puissance inférieure et un réglage PMT élevé. L’objectif est de prévisualiser les champs de vision sans surexposer le tissu à une lumière laser excessive.
4. Une fois que les niveaux de puissance appropriés ont été définis, configurez les piles z. Observez l’apparition de fibres de collagène abondantes (SHG) à 20-50 μm sous la surface vitrée du MIW. Le collagène deviendra moins répandu à mesure que le microscope s’enfoncera plus profondément dans la tumeur (Figure 1B). Les vides dans le SHG révèlent l’emplacement des masses tumorales.
5. Placez la tranche z supérieure, sous la couche de cellules solitaires où les premières fibres de collagène apparaissent à ~50-100 μm. Réglez la tranche z inférieure à ~ 250 μm, où les fibres s’estompent et le mauvais signal domine. Répétez cette opération pour toutes les positions x-y enregistrées.
6. Une fois la plage z-stack définie, augmentez le temps de séjour (jusqu’à 8 μs) et optimisez la puissance et les paramètres du détecteur. Optimisez les niveaux de puissance au besoin pour exciter le tissu pour chaque expérience. L’utilisation de puissances allant jusqu’à 90 mW à 750 nm ou 70 mW à 890 nm à l’ouverture arrière de l’objectif se situe dans une plage acceptable.
   REMARQUE: La profondeur d’imagerie, la quantité de diffusion dans le tissu, les caractéristiques objectives et la sensibilité du détecteur auront tous un impact significatif sur la quantité d’énergie nécessaire pour obtenir une image.
7. Ajustez les intervalles de temps en fonction des objectifs expérimentaux. Commencez par des intervalles de 10 minutes entre les points de collecte pour la plupart des films de migration intravitale.
8. Même si l’excitation 2P est douce pour les cellules et les tissus, soyez conscient des signes de phototoxicité, comme le saignement cellulaire ou l’augmentation rapide de l’autofluorescence, et le photoblanchiment excessif. Réduisez la puissance du laser ou augmentez les intervalles de timelapse selon les conditions.

5. Imagerie à vie de fluorescence (FLIM) du NAD(P)H

1. Tout en préservant les positions x-y des acquisitions timelapse, configurez le microscope pour collecter une pile FLIM. Insérez un filtre 440/80 dans un porte-filtre devant le détecteur GaAsP et réglez la tension du détecteur GaAsP sur 800 dans le logiciel. Éteignez les lumières de la pièce lorsque les détecteurs sont allumés.
2. Dans le logiciel, passez de l’imagerie d’intensité basée sur le galvanomètre à un mode d’imagerie FLIM.
3. Dans le but d’identifier et de masquer le système vasculaire, réglez la résolution sur 512 x 512 pixels. Pour collecter des informations métaboliques complémentaires, définissez la résolution sur 256 x 256 pixels pour augmenter la résolution temporelle de la signature à vie. Réglez le temps de séjour à 4 μs et réglez le laser à 750 nm.
4. Lancez la numérisation de prévisualisation et commencez à ajuster la puissance du laser. Réglez la puissance du laser jusqu’à ce que la lecture du discriminateur de fraction constante (CFD) soit comprise entre 1 x 10⁵ et 1 x 10⁶. Ne dépassez pas 1 x 10⁶ car cela entraînera un empilement de photons et de mauvais résultats globaux.
5. Une fois le niveau de puissance réglé, réglez le temps d’intégration entre 90 s et 120 s et démarrez la collection FLIM. Il acquerra des photons du champ de vision pendant le temps imparti.
6. Facultatif : Une fois que toutes les collections nécessaires ont été effectuées et que la souris a été retirée de la scène, collectez une fonction de réponse de l’instrument (IRF). Mesurez l’IRF en imageant la surface des cristaux d’urée disponibles dans le commerce dans un plat à fond de verre avec les mêmes paramètres et la même configuration que ceux utilisés pour l’imagerie du tissu.
   REMARQUE: L’IRF tient compte de tout retard ou réflexion dû à la configuration électronique ou optique. L’IRF est convolu dans toutes les acquisitions FLIM, et le déconvolution des données peut améliorer la précision des courbes de désintégration de fluorescence calculées. Cela dit, les IRF calculés peuvent souvent reproduire raisonnablement la qualité des courbes de désintégration de fluorescence à partir de l’IRF mesuré. Il est recommandé de mesurer l’IRF jusqu’à ce qu’il ait été déterminé que l’IRF calculé produira des ajustements équivalents des courbes de désintégration et approximera de manière adéquate les résultats de l’IRF mesuré.

6. Analyse des images de la durée de vie du NADH

1. Ouvrez le logiciel FLIM et importez l’image de durée de vie NAD(P)H à partir du jeu de données. Pour plus de détails sur la façon d’utiliser correctement le logiciel, veuillez consulter les manuels sur la durée de vie des fluorescents (voir le tableau des matériaux).
2. Pour commencer, définissez les paramètres du modèle dans le logiciel. Dans la barre de menus, cliquez sur Options > Modèle. Cochez les cases suivantes : Paramètres > Désintégration multinentielle, Méthode d’ajustement > MLE, > carré, Seuil > Pic, et cochez Corriger le décalage avant de calculer l’image.
3. Dans la barre de menus, cliquez sur Couleur >_{A 1} % dans le menu déroulant. Sur le côté droit de la fenêtre, définissez-le comme un ajustement à trois composants. Définissez la taille du bac > 3.
4. Ajustez le seuil > ~10. Réévaluez la précision du seuil après le calcul de la matrice de désintégration pour la première fois.
5. Corrigez le τ1 à 200 ps. Cela représente la courte durée de vie des globules rouges. Essayez de trouver la valeur qui correspond le mieux à plusieurs taches dans le plus grand vaisseau sanguin, ce qui peut être vu dans l’image d’intensité. Corrigez le τ2 à 1200 ps. Cela représente la longue durée de vie des globules rouges.
   REMARQUE : Les valeurs définies ne sont que le point de départ. Les valeurs devront être optimisées pour faire ressortir davantage le système vasculaire. Dans la plupart des cas, mais pas toujours, ces valeurs diminueront.
6. Sous Calculer dans la barre de menus, sélectionnez Matrice de désintégration. Cela générera une première durée de vie A₁% d’images avec la vascularisation ayant des valeurs élevées. Utilisez le curseur (réticule) pour survoler le système vasculaire. Systématiquement et un à la fois, faites flotter ( décochez la case Fixer) les τ1 et τ2. Enregistrez ces valeurs car elles aideront à optimiser les paramètres fixes.
   REMARQUE: L’objectif n’est pas nécessairement d’obtenir les valeurs les plus précises de l’image, mais plutôt de maximiser la disparité entre le système vasculaire et le tissu sans diminuer considérablement la zone identifiée comme vascularisation.
7. Une fois que les paramètres appropriés pour τ1 et τ2 ont été identifiés, dans la barre de menus, sélectionnez Calculer > traitement par lots. Assurez-vous que la plupart des paramètres sont similaires entre les tranches z.
8. Assurez-vous de vérifier qu’il n’y a pas un paramètre très différent des autres. Si c’est le cas, ajustez d’abord le quart de travail et réessayez. Si le problème persiste, réajustez-le à l’aide de nouveaux paramètres. Un décalage incorrect peut être une grande cause de bruit dans les crises et peut augmenter les valeurs A_{de 1}% dans les régions tumorales adjacentes.
9. Dans l’onglet de menu, enregistrez les fichiers, puis exportez les fichiers A₁%. Téléchargez ces fichiers dans ImageJ pour le masquage et la segmentation.

7. Segmentation de l’image du système vasculaire

1. Ouvrez ImageJ et importez l’image A₁ % en tant qu’image texte. Répétez cette opération pour toutes les images de la pile.
2. Avec toutes les images A₁% ouvertes, sélectionnez Image > Stack > Z-Project. Utilisez la projection d’intensité maximale et enregistrez les images. Voir Données supplémentaires 1 pour une image représentative.
3. Accédez à Plugins > Segmentation. Sélectionnez le plugin de segmentation WEKA entraînable³⁸.
4. Une fois la fenêtre WEKA ouverte, utilisez les paramètres par défaut et commencez à entraîner le logiciel en créant deux classes et en traçant des lignes sur la vascularisation (régions A_{élevées 1}%) et non vascularières (régions faibles A₁%).
5. Continuez à ajouter de nouvelles traces aux deux classes jusqu’à ce que le logiciel identifie systématiquement les régions A₁% élevées du système vasculaire tout en éliminant toute région plus élevée de bruit de fond. Voir Modèle supplémentaire pour le modèle de classificateur représentatif.
6. Une fois l’image classée produite, cliquez sur Image > Type > 8 Bit. Seuilz l’image et créez un masque. Si l’image seuillée doit encore être nettoyée, utilisez la fonction Analyser les particules .
7. Ajustez la taille et la circularité jusqu’à ce que les régions plus petites et circulaires de l’image en seuil soient exclues. Un masque propre avec seulement la vascularisation et très peu de fond est obtenu.
8. Cliquez sur Modifier > sélection > Créer une sélection. Transférez la sélection au gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser les outils > > gestionnaire de retour sur investissement.
9. Dupliquez l’image classifiée. Passez à Process > Binary. Pour développer le masque et définir la distance par rapport à la vascularisation qui sera incluse dans la segmentation de l’image, sélectionnez Dilater. Répétez l’opération jusqu’à ce que le masque soit étendu à la plage souhaitée. Enregistrez cette région d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de RETOUR SUR INVESTISSEMENT.
   REMARQUE: Le but de cette étape est de quantifier la quantité ou le comportement dans une certaine proximité du vaisseau sanguin (par exemple, le nombre de cellules présentes dans X μm des vaisseaux sanguins). La quantité de dilatation requise est entièrement déterminée par la question scientifique.
10. Pour quantifier le nombre de cellules dans les régions restrictives, sélectionnez la fenêtre (image/couche) qui vous intéresse. Il peut s’agir de n’importe quelle fenêtre qui partage le même champ de vision que le masque vasculaire. Appliquez les deux rois à l’aide de la fonction XOR du menu déroulant.
    REMARQUE: Cette opération mesurera les éléments à la distance souhaitée du système vasculaire, à l’exclusion du système vasculaire lui-même. Cette approche combinée du retour sur investissement peut ensuite être utilisée pour mesurer une multitude de paramètres, tels que l’intensité, le nombre de cellules ou la migration.

8. Segmentation d’image du nid tumoral

1. Ouvrez l’image NADH à partir d’un balayage d’intensité haute résolution ou d’une collection FLIM dans ImageJ.
   REMARQUE : Cela peut être fait sur des tranches z individuelles, des piles complètes ou appliqué à des projections z de quelques tranches.
2. Accédez à Plugins > Segmentation. Sélectionnez le plugin de segmentation WEKA entraînable.
3. Une fois la fenêtre WEKA ouverte, utilisez les paramètres par défaut et commencez à entraîner le logiciel en deux classes de régions élevées NADH et de régions faibles NADH. Les régions riches en NADH auront un modèle très discernable de cellules avec des noyaux et le logiciel l’identifiera facilement.
4. Continuez à basculer d’avant en arrière avec la superposition pour affiner l’algorithme avec un entraînement supplémentaire jusqu’à ce qu’il reconnaisse toutes les régions de la tumeur telles que déterminées par l’œil et la connaissance préalable de la morphologie tumorale. Il s’agit d’un processus itératif.
5. Une fois que l’algorithme reconnaît toutes les régions de la tumeur, sélectionnez le bouton Créer un résultat . Cela produira une nouvelle image. Dupliquez cette image.
6. Sélectionnez la première image dupliquée et convertissez-la en image 8 bits en sélectionnant Image > Type > 8 bits. Seuilz cette image pour créer un masque binaire. Créez ensuite une sélection et transférez-la au gestionnaire de retour sur investissement. Ces ROI définiront le stroma.
7. Sélectionnez la seconde de l’image dupliquée et convertissez-la en une image 8 bits. Inversez cette image en sélectionnant Image > Modifier > Inverser, puis seuilz cette image pour créer un masque binaire. Une fois de plus, créez une sélection et transférez-la au gestionnaire de retour sur investissement. Ce ROI définira le nid tumoral.

9. Segmentation de l’image par organisation ou alignement de la fibre

1. Pour commencer, ouvrez les images SHG, préparez toute projection z et évaluez la nécessité de tout prétraitement. Pour de bons résultats, des images de haute qualité avec des fibres discernables et un faible bruit sont nécessaires.
2. Facultatif : Pour le prétraitement dans ImageJ afin d’augmenter le rapport signal-bruit (SNR) du canal SHG, soustrayez l’arrière-plan à l’aide d’une soustraction de billes roulantes. Pour la plupart des applications, utilisez une soustraction de boule roulante comprise entre 20 pixels et 50 pixels. Ensuite, lissez l’image et enregistrez-la.
3. Ouvrez le plugin OrientationJ et définissez les paramètres de traitement. Dans la fenêtre OrientationJ, définissez la taille de la fenêtre tensorielle locale. Pour une image 20x de cette densité de fibres, définissez 10 pixels sur 15 pixels comme point de départ.
4. Sélectionnez Spline cubique comme modèle de dégradé et cochez la case Relevé des couleurs. Définissez l’enquête sur les couleurs. Définissez à la fois la teinte et la saturation comme cohérence, puis définissez la luminosité comme image d’origine, appuyez sur Exécuter.
5. Le fichier de sortie du plugin est RGB colormap. Ajustez la valeur de la fenêtre tensorielle locale jusqu’à ce que les régions alignées, déterminées par l’œil, soient correctement mises en évidence avec des teintes bleues et magenta.
6. Une fois que l’image de sortie est satisfaisante, séparez cette image RVB en 3 canaux. Sélectionnez Image > Couleur > Canal fractionné.
7. Pour améliorer l’apparence des régions alignées à des fins de masquage, utilisez la calculatrice d’image en sélectionnant Traiter > Calculatrice d’image. À l’aide de cet opérateur, soustrayez l’image verte de l’image bleue. Pour un masque plus restrictif, soustrayez l’image verte de l’image rouge. Pour les régions aléatoires, soustrayez le canal bleu du canal vert.
8. Seuilz l’image résultante à l’aide de l’algorithme Moments . Dans la plupart des cas, cela ne devrait pas nécessiter d’autres ajustements. Cependant, ajustez si nécessaire. Cela produira une image binaire.
9. Une fois l’image binaire créée, remplissez les trous en sélectionnant Process > Binary > Fill Holes entre les fibres et arrondissez les limites du masque à l’aide d’un filtre médian. Un filtre médian de 10 est un bon point de départ, ajustez-le pour qu’il corresponde bien aux données. Inspectez manuellement le masque pour vérifier l’accord et supprimez tous les retours sur investissement erronés.
10. Une fois le masque satisfaisant, créez une sélection en sélectionnant Modifier > Sélection > Créer une sélection. Transférez cette sélection au gestionnaire de retour sur investissement.

Résultats

L’installation du MIW et la planification expérimentale de base sont les premières étapes de ce processus. Cette conception et ce protocole MIW particuliers se prêtent mieux aux études longitudinales¹⁹ et ont été utilisés avec succès avec des microscopes verticaux et inversés. Dans ce cas, un microscope inversé a été utilisé car il a entraîné une plus grande stabilité de l’image de la glande mammaire avec moins d’artefacts respiratoires. Dans la figure 1...

Discussion

L’imagerie intravitale 4D est un outil puissant pour étudier les interactions physiologiques dynamiques dans le contexte spatial et temporel du microenvironnement tumoral natif. Ce manuscrit fournit un cadre opérationnel très basique et adaptable pour compartimenter les interactions cellulaires dynamiques dans la masse tumorale, le stroma adjacent ou à proximité du réseau vasculaire en utilisant uniquement des signaux endogènes de deuxième génération harmonique ou d’autofluorescence NAD(P)H. Ce protocole fo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF