乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

要約

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。

要約

生きた腫瘍微小環境内の多数の細胞型と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で動的な生理学的相互作用を視覚化する能力は、腫瘍の進行を調節するメカニズムを理解するための重要なステップである。これは、現在の生体内イメージング技術によって達成することができますが、組織の不均一な性質と実験観察内の空間的文脈の必要性のために、依然として困難です。この目的のために、我々は、コラーゲン第二高調波発生イメージング、代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光、および腫瘍微小環境を腫瘍巣、周囲の間質またはECM、および血管系の基本ドメインに非侵襲的に区画化する手段としての蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を組み合わせたイントラバイタルイメージングワークフローを開発しました。この非侵襲的プロトコルは、乳腺腫瘍モデルのタイムラプス画像の取得から後処理分析および画像セグメンテーションに至るまで、段階的なプロセスを詳述しています。このワークフローの主な利点は、代謝シグネチャを利用して、外因性蛍光標識を使用せずに動的に変化する生腫瘍微小環境をコンテキスト化することで、ヒト患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび外因性蛍光色素分子が容易に適用できない将来の臨床使用に有利になることである。

概要

腫瘍微小環境における細胞外マトリックス(ECM)は、疾患の進行をさらに促進するために、複数の細胞型によって動的に沈着および再構築されることが知られている¹、^2、3。これらのマトリックス変化は、細胞挙動を変化させる機械的および生物学的手がかりの両方を提供し、しばしばマトリックスリモデリングの継続的なサイクルをもたらす⁴。腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの間の動的で相互的な相互作用の調査は、しばしば三次元(3D)体外培養またはマイクロ流体系を用いて行われる。これらのボトムアップアプローチはECMリモデリング⁵、⁶、7、増殖の増加⁸、上皮から間葉への移行⁹、^10、11、12、および腫瘍細胞遊走および浸潤⁷、13、14、

プロトコル

記載されているすべての実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。すべての動物実験における幸福と疼痛管理は最優先事項です。したがって、動物が手順の各ステップで快適で手入れが行き届いていることを確認するためにあらゆる努力が払われます。

1. 乳房イメージングウィンドウ(MIW)の生成

1. 乳房イメージングウィンドウを構築するには、外科グレードのステンレス鋼から14mmリングを製造します。
2. 5%の洗浄洗剤の熱い溶液を使用して機械加工された窓枠を洗浄し、実行中の脱イオン水(DI)の下で10分間すすぎ、100%エタノールに10分間浸してから、ヒートランプの下で乾燥させる。乾燥したMIWフレームをオートクレーブし、後で使用するために保管します。
3. 次のようにMIWカバーガラスを準備します:#1.5 12 mm丸カバーガラスを100%エタノールに10分間浸し、ヒートランプの下で乾燥させた後、シアノアクリレート接着剤を使用して金属MIWフレームに固定します。接着剤を一晩硬化させる。
4. アセトン浸漬綿棒を用いて余分な接着剤の組み立てられたMIWを洗浄し、70%エタノールに10分間浸漬して洗浄する。清掃した窓を乾かします。MIWを事前に準備し、外科的移植の前に滅菌ペトリ皿に保管してください。

結果

MIWのインストールと基本的な実験計画は、このプロセスの最初のステップです。この特定のMIW設計およびプロトコルは、縦断的研究¹⁹ により適しており、直立顕微鏡および倒立顕微鏡の両方で首尾よく利用されている。この場合、倒立顕微鏡は、より少ない呼吸アーチファクトで乳腺のより大きな画像安定性をもたらしたので、使用された。 図1Aでは?.......

ディスカッション

4Dイントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の空間的および時間的コンテキスト内の動的な生理学的相互作用を調査するための強力なツールです。この原稿は、第2高調波発生またはNAD(P)H自己蛍光からの内因性信号のみを使用して、腫瘍塊、隣接する間質、または血管網に近接した範囲内の動的細胞相互作用を区画化するための非常に基本的で適応可能な運用フレームワー.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF