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要約

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。

要約

生きた腫瘍微小環境内の多数の細胞型と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で動的な生理学的相互作用を視覚化する能力は、腫瘍の進行を調節するメカニズムを理解するための重要なステップである。これは、現在の生体内イメージング技術によって達成することができますが、組織の不均一な性質と実験観察内の空間的文脈の必要性のために、依然として困難です。この目的のために、我々は、コラーゲン第二高調波発生イメージング、代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光、および腫瘍微小環境を腫瘍巣、周囲の間質またはECM、および血管系の基本ドメインに非侵襲的に区画化する手段としての蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を組み合わせたイントラバイタルイメージングワークフローを開発しました。この非侵襲的プロトコルは、乳腺腫瘍モデルのタイムラプス画像の取得から後処理分析および画像セグメンテーションに至るまで、段階的なプロセスを詳述しています。このワークフローの主な利点は、代謝シグネチャを利用して、外因性蛍光標識を使用せずに動的に変化する生腫瘍微小環境をコンテキスト化することで、ヒト患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび外因性蛍光色素分子が容易に適用できない将来の臨床使用に有利になることである。

概要

腫瘍微小環境における細胞外マトリックス(ECM)は、疾患の進行をさらに促進するために、複数の細胞型によって動的に沈着および再構築されることが知られている1、2、3。これらのマトリックス変化は、細胞挙動を変化させる機械的および生物学的手がかりの両方を提供し、しばしばマトリックスリモデリングの継続的なサイクルをもたらす4。腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの間の動的で相互的な相互作用の調査は、しばしば三次元(3D)体外培養またはマイクロ流体系を用いて行われる。これらのボトムアップアプローチはECMリモデリング5、6、7、増殖の増加8、上皮から間葉への移行9、10、11、12、および腫瘍細胞遊走および浸潤7、13、14、15、16のメカニズムを実証している。それらの焦点は、生理学的組織内に存在する相互作用の多様性および不均一性と比較して、均質な3Dマトリックス内のいくつかの細胞型(例えば、腫瘍細胞または線維芽細胞)に主に焦点を当ててきた。インビトロ系に加えて、エキソビボ腫瘍組織学はまた、これらの細胞間および細胞−ECM相互作用に関するいくつかの洞察を提供することができる17。免疫組織化学は、ECMの空間的に不均一な組成およびアーキテクチャに関して複数の細胞型を分析できるという利点を有するが、固定組織の静的エンドポイントは、細胞と微小環境との間の相互作用の動的性質を捕捉しない。イントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の生理学的文脈における多様で動的な相互作用を調査する扉を開きました。

生体内腫瘍イメージングの能力は急速に進歩しています。画像化窓の設計および窓を移植するための外科的技術の改善により、様々な解剖学的位置(すなわち、原発性腫瘍、リンパ節、転移部位)における長期縦断的腫瘍画像化が可能になった18、19、20。さらに、複数の次元(スペクトル、空間蛍光強度、および寿命)で、高解像度および速度(ビデオレート)でデータを視覚化および収集する光学機器の能力は、広くアクセス可能になりつつある。改良された技術は、生理学的環境における細胞シグナル伝達および表現型ダイナミクスの急速な変化を探求する機会を提供する。最後に、光遺伝学的ツールの拡大および広範囲の遺伝的蛍光構築物は、特定の細胞型のタグ付けを可能にし、発生または疾患進行中の腫瘍微小環境または細胞系譜トレースにおける細胞遊走を捕捉する21、22。これらのツールをCRISPR/Cas9技術と組み合わせて使用することで、研究者はユニークな動物モデルをタイムリーに生成することができます。

これらすべての進歩により、生体内イメージングは動的および生理学的細胞相互作用を探求するためのますます強力な方法となっていますが、これらの生物学的相互作用に組織レベルで空間的、時間的、および構造的文脈を提供する戦略を開発することが依然として重要です。現在、多くの生体内イメージング研究は、血管系に蛍光色素を注入するか、または外因的に蛍光タンパク質を発現して身体的特徴を描写するマウスモデルを使用することによって、血管などの視覚的ランドマークの欠如を補っている。注射可能な色素および蛍光デキストランのような基質は、生体内コレクション19、 23、 24において血管系を首尾よく標識するために広く利用されている。ただし、このアプローチには制限がないわけではありません。1つは、追加のマウス操作が必要であり、その有用性は短期的な実験に限定されています。縦断的研究の場合、蛍光デキストランは、貪食細胞におけるデキストランの蓄積または経時的な周囲の組織への拡散を観察するにつれて問題となり得る25。マウスモデルへの外因性蛍光タンパク質の取り込みは、蛍光デキストランの代替として提示されているが、それ自体の限界を提示している。マウスモデル内の外因性蛍光色素の入手可能性と多様性は、依然として限られており、作成にコストがかかります。さらに、PDXモデルなどの特定のモデルでは、遺伝子操作は望ましくなく、不可能です。また、細胞内の蛍光または生物発光タンパク質の存在は、マウス内で、および免疫担当マウスモデル内で異物として認識され、これは宿主免疫系の応答に起因する転移の量を減少させることも示されている26、27。最後に、空間的文脈または後続のデータをセグメント化するために使用される外因性蛍光タンパク質または蛍光色素は、しばしば、目的の生理学的相互作用を調査するために使用され得る光スペクトルのプライム範囲を占める。

ECMからの固有のシグナルまたは組織内の細胞からの内因性蛍光の使用は、より詳細な細胞および空間分析のためにバイタル内データをセグメント化する潜在的な普遍的なラベルフリー手段を表す。第2高調波発生(SHG)は、ECM28を視覚化するために長い間使用されてきた。繊維組織29、30、31の特性評価を支援するための重要なツールのその後の開発により、局所ECM構造に対する細胞挙動を特徴付けることができる。さらに、内因性代謝産物であるNAD(P)Hからの自家蛍光は、インビボで腫瘍微小環境を区画化するための別の標識のないツールを提供する。NAD(P)Hは腫瘍細胞内で明るく蛍光を発し、成長している腫瘍巣の境界を周囲の間質から区別するために使用することができる21,32。最後に、血管系は、腫瘍微小環境および重要な細胞型特異的相互作用の部位において重要な生理学的構造である33、34、35。赤血球(RBC)または血漿の励起は、腫瘍血管系を視覚化するために使用され、2光子または3光子励起(2P;)を使用して、血流速度の測定が可能であることが示されている36。しかし、大きな血管は内因性の蛍光シグネチャによって容易に識別できますが、微妙で可変で蛍光性の低い小さな血管の同定には、より多くの専門知識が必要です。これらの固有の困難は、最適な画像セグメンテーションを妨げます。幸いなことに、これらの内因性蛍光源(すなわち、赤血球および血漿)は、血管系のユニークな光物理的特性を利用し、成長する生命内ツールボックスへの有用な付加物を表す蛍光寿命画像化37によっても測定することができる。

このプロトコルでは、内因性蛍光やSHGなどの固有のシグナルを使用して、4次元(4D)イントラバイタルイメージングのセグメンテーションを明示的に行うためのワークフローが、取得から解析まで記述されています。このプロトコルは、PDXモデルの場合のように、外因性蛍光が実用的または不可能である可能性がある乳房イメージングウィンドウを介した縦断的研究に特に適切である。しかし、ここで概説したセグメンテーションの原則は、腫瘍生物学、組織発生、さらには正常な組織生理学を調査する生体内ユーザーに広く適用できます。報告された一連の分析アプローチにより、ユーザーは、整列またはランダムなコラーゲン線維構成の領域間で細胞挙動を区別し、腫瘍微小環境の特定の領域に存在する細胞の数または挙動を比較し、ラベルフリーまたは内因性シグナルのみを使用して血管系を腫瘍微小環境にマッピングすることができる。これらの方法を組み合わせることで、乳腺の4Dイントラバイタルイメージングから得られる情報の深さを最大化し、追加の外因性ラベルの必要性を最小限に抑えるための運用フレームワークが作成されます。

プロトコル

記載されているすべての実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。すべての動物実験における幸福と疼痛管理は最優先事項です。したがって、動物が手順の各ステップで快適で手入れが行き届いていることを確認するためにあらゆる努力が払われます。

1. 乳房イメージングウィンドウ(MIW)の生成

  1. 乳房イメージングウィンドウを構築するには、外科グレードのステンレス鋼から14mmリングを製造します。
  2. 5%の洗浄洗剤の熱い溶液を使用して機械加工された窓枠を洗浄し、実行中の脱イオン水(DI)の下で10分間すすぎ、100%エタノールに10分間浸してから、ヒートランプの下で乾燥させる。乾燥したMIWフレームをオートクレーブし、後で使用するために保管します。
  3. 次のようにMIWカバーガラスを準備します:#1.5 12 mm丸カバーガラスを100%エタノールに10分間浸し、ヒートランプの下で乾燥させた後、シアノアクリレート接着剤を使用して金属MIWフレームに固定します。接着剤を一晩硬化させる。
  4. アセトン浸漬綿棒を用いて余分な接着剤の組み立てられたMIWを洗浄し、70%エタノールに10分間浸漬して洗浄する。清掃した窓を乾かします。MIWを事前に準備し、外科的移植の前に滅菌ペトリ皿に保管してください。

2. MIWの外科的移植

  1. オートクレーブ手術器具を手術し、窓移植のための手術を開始する前に、70%エタノールで表面を消毒する。
  2. 滅菌フィールドで覆われた温暖化毛布を使用して、消毒された卓上で手術を行います。滅菌フィールドの上部で測定された温度が40°Cになるように加温ブランケットをセットします。
  3. 補助的な冷光を使用して、組織の乾燥を防ぎます。外科的処置を容易にするために虫眼鏡を使用してください。無菌の使い捨てのラボコート、手術用スリーブ、手袋、目の保護具、および外科的ベストプラクティスで推奨されているフェイスマスクで構成されるPPEを着用してください。
  4. イソフルラン設定が2.0%、酸素流量が2.0 L/minの麻酔気化器装置を使用してマウスを麻酔します。鎮痛剤(10mg / kgメロキシカム)を皮下注射で投与する。
    注:最初の24時間以内に、好ましくは手術後最初の2日間は8〜12時間ごとに追加の用量を提供する。
  5. 麻酔をかけたら(つま先のピンチに反応しないことで確認)、目の乾燥を防ぐために保湿アイジェルを塗布します。脱毛クリームを使用して手術部位(4番目の 鼠径乳腺)で毛皮を除去し、続いて滅菌水浸しガーゼですすいでください。
  6. 脱毛した手術部位を手術用に準備するには、3つの交互のベタジンとエタノールスクラブで皮膚表面を消毒します。
  7. 手術を開始するには、鉗子を使用して4番目の乳腺番号4の上で皮膚を優しく持ち上げます。皮膚が体壁から引き離されたら、外科用マイクロハサミで鉗子の先端にある真皮層の〜1mmの部分を取り除く。出血が発生した場合は、出血が止まるまで滅菌ガーゼで穏やかな圧力をかけてください。
    注:一般に、大きな腫瘍は、小さな腫瘍または正常組織よりも出血する可能性が大きい。
  8. 外科的開口部で鉗子を穏やかに動かして、下層の腺を切断しないように乳腺を真皮層から剥離する。
  9. 10mmの切開部を作成し、乳腺を周囲の真皮層から解放して、乳腺を貫通することなく縫合糸を配置できるようにします。PBSを加えて、露出した腺/腫瘍を覆い、乾燥を防ぎます。
  10. 5-0シルク編組縫合糸を使用して開口部の周囲に沿って財布紐縫合糸を作成します。真皮層がMIWの受容ノッチに係合するようにMIWの縁を挿入します。
  11. MIWの反対側で上皮を静かに伸ばし、真皮層がMIW円周全体の周りに受容ノッチを完全に噛み合うように金属MIWを所定の位置に押し込みます。財布の紐をしっかりと締めて真皮層を切り込みに引き込み、MIWを完全に固定するために結び付けます。
  12. MIWの真皮層に局所抗生物質を加え、胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを継続的に監視する。MIW移植マウスをケージに入れた柔らかい寝具の上に別々に収容し、マウスがイメージングする前に48時間回復できるようにします。

3. イメージングのための顕微鏡ステージ上のマウスの位置決めとメンテナンス

  1. 顕微鏡ステージに加熱室を設置する。30 °C に設定した強制空気システムまたはその他の同様のシステムを使用してください。zフォーカスのドリフトを避けるために、客観的なヒーターを使用してください。イメージングの前に、システムが少なくとも 1 時間平衡状態になるのを待ちます。
    注:麻酔を受けたマウスは体温を適切に維持することができないため、タイムラプス取得のために加熱された環境が必要です。対物ヒータは、対物レンズと撮像される組織が熱平衡に達するにつれてz焦点のドリフトを引き起こす現象である熱膨張の影響と戦うのに役立ちます。
  2. 顕微鏡の加熱チャンバが30°Cで安定したら、2%イソフルランの麻酔装置設定と2L/minの酸素流量でレシピエントマウスを麻酔します。
  3. マウスを鎮静させた後(つま先のピンチに反応しないことで確認)、綿アプリケーターとガラスクリーナーでMIWガラスの外側をきれいにし、乾燥を防ぐために眼軟膏を加え、必要に応じて尾静脈カテーテルを挿入します。
  4. 適切な水分補給を維持するために、0.5 mL PBSの初期皮下または尾静脈カテーテルを通して100 μLの初期注射を与える。イメージングセッションの間、2時間ごとに繰り返します。
  5. マウスが適切に準備されたら、顕微鏡をイメージング用にセットアップします。タイムラプス測定中の蒸発を減らすには、浸漬媒体に水の代わりに水性ゲルを使用してください。これは、ステージ上にマウスを置く前に行う必要があります。光学部品の詳細については、材料表をご覧ください。
  6. マウスを顕微鏡ステージの上に置き、イソフルランホースをはめ込み、MIWの襟をステージインサートの14mmの受け穴に押し込んで画像を安定させます。顕微鏡の眼球を使用してイメージングフィールドを焦点を合わせ、明視野照明を使用して血流で血管系を観察します。
  7. 視野の安定性を確認します。呼吸運動アーチファクトが存在する場合は、小さなフォームブロックとチンキのような粘着テープで腺の裏側に穏やかな圧縮を適用します。圧縮を適用した後、視野全体で血流が維持されていることを確認します。
  8. イメージングセッション中にイソフルランレベルを0.25%刻みで定期的に調整し、動物の呼吸を手動でカウントして適切な鎮静レベルを維持します。
  9. 動物の寿命と光学イメージングを改善するために、毎分(rpm)36〜40呼吸の速度を維持します。呼吸数が低いとマウスが実験を生き延びられなくなる可能性がありますが、60rpmを超える呼吸数は鎮静状態が悪くなり、画像データ内の呼吸および運動アーチファクトが増加する可能性があります。

4. 動的細胞挙動の4D、強度ベース、ラベルフリーのインバイタルイメージング用にセットアップ

  1. マウスを鎮静させ、倒立顕微鏡ステージ上にしっかりと配置したら、関心領域の位置決めを開始します。
  2. MIWに向けられた光源を使用して、顕微鏡の眼球を使用して、調査の可能性のある領域を特定する。ソフトウェアに x、y の位置を追加して保存し、これらの位置に戻ります。
    注:このタイプの照明では、腫瘍の細かい部分は容易には見えません。目標は、単にさらなる調査のために地域を特定することです。焦点は血管系と血流を見ることです。
  3. ソフトウェアにいくつかの位置を保存した後、890nm励起とFAD/SHGフィルタキューブを使用して、選択した視野をプレビューします。4μsの最大ドウェル時間を使用し、低消費電力でPMTを高く設定してください。目標は、組織を過度のレーザー光に過度にさらすことなく視野をプレビューすることです。
  4. 適切な電力レベルを設定したら、Z スタックを設定します。MIWのガラス表面下の20〜50μmに豊富なコラーゲン線維(SHG)の外観を観察します。コラーゲンは、顕微鏡が腫瘍の奥深くまで切片化するにつれて、り普及しなくなります(図1B)。SHG内の空隙は、腫瘍塊の位置を明らかにする。
  5. 最初のコラーゲン線維が〜50〜100μmで現れる孤立細胞の層の下に、上部のzスライスをセットする。下部の Z スライスを約 250 μm に設定し、ファイバーがフェードアウトし、信号不良が支配的になります。保存されたすべての x-y 位置について、これを繰り返します。
  6. zスタック範囲を設定したら、ドウェルタイムを長く(最大8μs)、電力と検出器の設定を最適化します。必要に応じてパワーレベルを最適化し、各実験で組織を励起します。対物レンズの背面開口部で750nmで90mWまたは890nmで70mWまでの電力を使用することは許容範囲内です。
    注:イメージングの深さ、組織内の散乱量、客観的な特性、および検出器の感度はすべて、画像を取得するために必要な電力量に大きく影響します。
  7. 実験目標に従って時間間隔を調整します。ほとんどの重要域内移行ムービーの収集ポイント間の 10 分間隔から開始します。
  8. 2P励起は細胞や組織に優しいですが、細胞のブロビングや急速に増加する自家蛍光、過度のフォトブリーチングなどの光毒性の兆候を認識してください。条件が示すように、レーザー出力を減らすか、タイムラプス間隔を長くします。

5. NAD(P)Hの蛍光寿命イメージング(FLIM)

  1. タイムラプス取得からのx-y位置を維持しながら、FLIMスタックを収集するように顕微鏡を設定します。GaAsP検出器の前のフィルタホルダーに440/80フィルタを挿入し、ソフトウェアでGaAsP検出器の電圧を800に設定します。検出器がオンのときは、部屋の照明を消します。
  2. ソフトウェアで、ガルバノメータベースの強度イメージングからFLIMイメージングモードに切り替えます。
  3. 血管系を識別してマスキングする目的で、解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。相補的な代謝情報を収集するには、解像度を 256 x 256 ピクセルに設定して、ライフタイム シグネチャの時間分解能を上げます。ドウェル時間を4μsに設定し、レーザーを750nmにチューニングします。
  4. プレビュースキャンを開始し、レーザー出力の調整を開始します。定分率弁別器(CFD)の読み出しが1 x105 から1 x106の間になるまでレーザー出力を調整します。1 x 106 を超えると、光子が蓄積され、全体的な結果が低下するため、使用しないでください。
  5. 電力レベルを設定したら、積分時間を90秒~120秒に設定し、FLIMコレクションを開始します。割り当てられた時間の間、視野から光子を取得します。
  6. オプション: 必要な収集がすべて行われ、マウスがステージから取り外されたら、計測器応答関数 (IRF) を収集します。市販の尿素結晶の表面をガラス底皿に同じパラメータで撮像してIRFを測定し、組織のイメージングに用いたセットアップを行った。
    メモ: IRF は、電子的または光学的なセットアップによる遅延や反射を考慮します。IRFはすべてのFLIM集録で畳み込まれており、データからIRFを逆畳み込むことで、計算された蛍光減衰曲線の精度を向上させることができます。そうは言っても、計算されたIRFは、しばしば、測定されたIRFからの蛍光減衰曲線の品質を合理的に複製することができる。計算された IRF が減衰曲線の等価適合度をもたらし、測定された IRF の結果を適切に近似すると判断されるまで、IRF を測定することをお勧めします。

6. NADHライフタイム画像の解析

  1. FLIM ソフトウェアを開き、データセットから NAD(P)H ライフタイム イメージをインポートします。ソフトウェアの適切な使用方法の詳細については、蛍光寿命ハンドブック(材料表を参照)を参照してください。
  2. まず、ソフトウェアでモデルパラメータを定義します。メニューバーで、「 モデル>オプション」をクリックします。「 設定」>「多指数減衰」、「MLE >の適合方法」、「空間ビニング>平方」、「しきい値」>「ピーク」、および 「イメージを計算する前にシフトを修正」にチェックを入れます。
  3. メニューバーで、ドロップダウンメニューから 「色>A1% 」をクリックします。ウィンドウの右側で、3 成分適合として定義します。 ビンサイズを3>設定します。
  4. しきい値を ~10 >調整します。減衰行列が初めて計算された後にしきい値精度を再評価します。
  5. τ1 を 200 ps に固定します。これは赤血球の短い寿命を表しています。強度画像で見ることができる大きな血管の複数のスポットに最も一致する値を見つけるようにしてください。τ2 を 1200 ps に固定します。これは赤血球の長寿命を表しています。
    メモ: 設定された値は、あくまでも出発点にすぎません。血管系をより多く引き出すために、値を最適化する必要があります。ほとんどの場合、常にではありませんが、これらの値は減少します。
  6. メニュー バーの [計算 ] で、[ 減衰マトリックス] を選択します。これにより、血管系が高い値を持つ初期A1%の寿命画像が生成されます。カーソル(十字線)を使用して血管系の上にカーソルを置きます。体系的に一度に 1 つずつ、τ1 と τ2 をフロート ( [修正] ボックスのチェックを外します)。これらの値は、固定パラメーターの最適化に役立つため、記録しておきます。
    注:目標は、必ずしも画像内で最も正確な値を得ることではなく、血管系として識別される領域を劇的に減少させることなく、血管系と組織との間の差を最大化することである。
  7. τ1 と τ2 の適切なパラメータが特定されたら、メニュー バーでバッチ処理>計算を選択します。ほとんどの設定が Z スライス間で類似していることを確認します。
  8. 他の設定と大きく異なる設定がないことを確認してください。その場合は、最初にシフトを調整して、もう一度やり直してください。問題が解決しない場合は、新しいパラメータを使用して再設定してください。誤ったシフトは、適合値におけるノイズの大きな原因となり、隣接する腫瘍領域におけるA1%値を増加させる可能性がある。
  9. メニュータブで、ファイルを保存し、A1%ファイルをエクスポートします。これらのファイルを ImageJ にアップロードして、マスキングとセグメンテーションを行います。

7. 血管系の画像セグメンテーション

  1. ImageJ を開き、A1% 画像をテキスト画像としてートします。スタック内のすべての画像に対してこれを繰り返します。
  2. すべての A1% 画像を開いた状態で、[ Z プロジェクト> スタック>画像] を選択します。 最大強度投影 を使用して、画像を保存します。代表的な画像については、 補足データ 1 を参照してください。
  3. プラグイン>セグメンテーションに移動します。トレーニング可能な WEKA セグメンテーションプラグイン38 を選択します。
  4. WEKAウィンドウが開いたら、デフォルト設定を使用し、2つのクラスを作成し、血管系(高A1%領域)と非血管系(低A1%領域)の線をトレースして、ソフトウェアのトレーニングを開始します。
  5. ソフトウェアが血管系の高いA1%領域を一貫して識別し、バックグラウンドノイズのより高い領域を排除するまで、2つのクラスに新しいトレースを追加し続けます。代表的な分類子モデルについては、 補足モデル を参照してください。
  6. 分類された画像が生成されたら、[ 画像>タイプ>8ビット]をクリックします。イメージをしきい値に設定し、マスクを作成します。しきい値になったイメージをさらにクリーンアップする必要がある場合は、[ パーティクルの解析] 機能を使用します。
  7. しきい値が設定された画像の小さい領域と円形の領域が除外されるまで、サイズと円形度を調整します。血管系のみと非常に少ない背景を持つきれいなマスクが得られます。
  8. [ 選択範囲の編集] > [選択範囲の作成] >クリックします。ROI マネージャーの [> ツールの分析] をクリックして、選択を ROI マネージャー>転送します。
  9. 分類された画像を複製します。 >バイナリの処理に進みます。マスクを展開し、画像セグメンテーションに含まれる血管系からの距離を定義するには、[ 拡張] を選択します。マスクが目的の範囲に広がるまで繰り返します。この関心領域 (ROI) を ROI マネージャーに記録します。
    注:このステップの目的は、血管の特定の近接度(例えば、血管のXμm内に存在する細胞の数)内の量または挙動を定量化することである。必要な拡張の量は、科学的問題によって完全に決定されます。
  10. 制限領域内のセル数を定量化するには、目的のウィンドウ(画像/チャンネル)を選択します。これは、血管マスクと同じ視野を共有する任意のウィンドウであり得る。ドロップダウンメニューから XOR 関数を使用して両方のROIを適用します。
    注:この操作は、血管系自体を除いて、血管系から所望の距離内のアイテムを測定する。この組み合わせたROIアプローチを使用して、強度、細胞数、移動などの多数のパラメータを測定できます。

8. 腫瘍巣の画像セグメンテーション

  1. ImageJ の高解像度強度スキャンまたは FLIM コレクションから NADH イメージを開きます。
    メモ: これは、個々の Z スライス、フルスタック、またはいくつかのスライスの Z 投影に適用することができます。
  2. プラグイン>セグメンテーションに移動します。トレーニング可能な WEKA セグメンテーションプラグインを選択します。
  3. WEKA ウィンドウが開いたら、デフォルト設定を使用して、NADH 高領域と NADH 低領域の 2 つのクラスにソフトウェアのトレーニングを開始します。NADH高域は、核を持つ細胞の非常に識別可能なパターンを持ち、ソフトウェアはそれを容易に識別します。
  4. オーバーレイを前後に切り替えて、目によって決定された腫瘍のすべての領域と腫瘍形態に関する事前知識を認識するまで、追加のトレーニングでアルゴリズムを改良し続けます。これは反復的なプロセスです。
  5. アルゴリズムが腫瘍のすべての領域を認識したら、[ 結果の作成] ボタンを選択します。これにより、新しい画像が生成されます。この画像を複製します。
  6. 最初に複製された画像を選択し、[画像] [種類] > [8 ビット] を選択して 8 ビット画像>変換します。このイメージをしきい値にして、バイナリマスクを作成します。次に、選択範囲を作成し、ROI マネージャーに転送します。これらのROIは間質を定義します。
  7. 複製したイメージの 2 番目を選択し、8 ビット イメージに変換します。[画像] > [編集] > [反転] を選択してこの画像を反転し、この画像をしきい値にしてバイナリ マスクを作成します。もう一度選択を作成し、ROI マネージャーに転送します。このROIは腫瘍巣を定義する。

9. 繊維組織またはアライメントによる画像セグメンテーション

  1. まず、SHG 画像を開き、Z 投影を準備して、前処理の必要性を評価します。良好な結果を得るには、識別可能なファイバーと低ノイズの高品質画像が必要です。
  2. オプション: SHG チャンネルの信号対ノイズ(SNR)を増加させるために ImageJ で前処理を行うには、転がり球の減算を使用して背景を減算します。ほとんどのアプリケーションでは、20 ピクセルから 50 ピクセルの間の転がり球減算を使用します。次に、画像を滑らかにして保存します。
  3. OrientationJ プラグインを開き、処理パラメータを設定します。OrientationJ ウィンドウで、ローカルテンソルウィンドウのサイズを定義します。このファイバ密度の 20 倍の画像の場合は、開始点として 10 ピクセルを 15 ピクセルに設定します。
  4. グラデーションモデルとして 「立方体スプライン 」を選択し、「 カラーサーベイ」ボックスにチェックマークを付けます。カラー調査を定義します。 色相 と 彩度 の両方を コヒーレンシとして設定し、 明るさ を 元のイメージとして定義し、[ 実行]をクリックします。
  5. プラグインの出力ファイルはRGBカラーマップです。位置合わせされた領域が、目で決定されるように、青とマゼンタの色相で適切に強調表示されるまで、ローカルテンソルウィンドウの値を調整します。
  6. 出力画像が満足のいくものになったら、このRGB画像を3つのチャンネルに分けます。 画像>カラー>分割チャンネルを選択します。
  7. マスキングの目的で整列領域の外観を向上させるには、「イメージ計算機の処理」を選択してイメージ電卓 >使用します。この演算子を使用して、青色の画像から緑色の画像を減算します。より制限の厳しいマスクにするには、赤色の画像から緑色の画像を減算します。ランダムな領域の場合は、緑のチャンネルから青のチャンネルを減算します。
  8. モー メント アルゴリズムを使用して 、結果の画像をしきい値に設定します。ほとんどの場合、これ以上の調整は必要ありません。ただし、必要に応じて調整してください。これにより、バイナリイメージが生成されます。
  9. 2 値化イメージを作成したら、「 > 2 進数を処理」>「ファイバー間の穴を塗りつぶす」を選択して穴を埋め 、中央値フィルターを使用してマスクの境界を丸めます。中央値フィルター 10 が適切な開始点であり、データに合うように調整します。マスクの一致を手動で検査し、誤った ROI があれば削除します。
  10. マスクが満足のいくものになったら、「選択範囲を 編集」>「選択範囲を作成」>選択範囲を作成します。この選択をROIマネージャに転送します。

結果

MIWのインストールと基本的な実験計画は、このプロセスの最初のステップです。この特定のMIW設計およびプロトコルは、縦断的研究19 により適しており、直立顕微鏡および倒立顕微鏡の両方で首尾よく利用されている。この場合、倒立顕微鏡は、より少ない呼吸アーチファクトで乳腺のより大きな画像安定性をもたらしたので、使用された。 図1Aでは?...

ディスカッション

4Dイントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の空間的および時間的コンテキスト内の動的な生理学的相互作用を調査するための強力なツールです。この原稿は、第2高調波発生またはNAD(P)H自己蛍光からの内因性信号のみを使用して、腫瘍塊、隣接する間質、または血管網に近接した範囲内の動的細胞相互作用を区画化するための非常に基本的で適応可能な運用フレームワー...

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

著者らは、この研究に資金を提供したNCI R01 CA216248、CA206458、およびCA179556助成金に感謝したい。また、ケビン・エリセイリ博士と彼のイメージンググループが、私たちのイントラバイタルプログラムの早期開発における技術的専門知識に感謝したいと思います。我々はまた、ベン・コックス博士及びモーグリッジ研究所のエリセイリ・ファブリケーション・グループの他のメンバーに対し、MIWの初期段階における本質的な技術設計に感謝する。エレン・ドブソン博士は、ImageJ トレーニング可能な WEKA セグメンテーション ツールに関する有益な会話を支援しました。さらに、メリッサ・スカラ博士とアレクサ・バレス・ヒートン博士の顕微鏡のタイムリーな使用に感謝します。最後に、D.V.M.のBrigitte Raabe博士に、マウスの取り扱いとケアに関するすべての思慮深い議論とアドバイスに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 12mm round cover glassWarner Instruments# 64-0712MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injectionBD309659Syringe
20x objectiveZeiss421452-988Water immersion
27G needle for SQ injectionCovidien1188827012Needle
40x objectiveNikonMRD77410Water immersion
5-0 silk braided sutureEthiconK870Suture for MIW implantation
Artificial tears gelAkornNDC 59399-162-35Eye gel
Betadine solution, 5%Fisher ScientificNC1558063Surgery antiseptic
cotton-tipped applicatorFisher Scientific23-400-101
Cyanoacrylate adhesiveLoctite1365882MIW construction
fluorescent dextranSigmaT1287-50mgintravenous labelling of vasculature
forcepsMckesson.comMiltex #18-782stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tubeHamamatsu 
heating blanketCARA 72 heating pad 038056000729Temperature selectable
heating chamberhome built
Fluorescent lifetime handbookBecker and Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope baseNikon
IsofluraneAkornNDC 59399-106-01Anesthesia
Liqui-NoxFisher Scientific16-000-125MIW cleaning
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10Analgesic
Micro HoseScientific Commodities INC. BB31695-PE/1
multiphoton scan headBruker Ultima IIMultiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filterChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826Depilatory cream
objective heaterTokai HitSTRG-WELSX-SET
SHG/FAD filterChroma320740ET450/40m-2P
Sparkle glass cleanerAmazon.comB00814ME24Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting boardBecker and Hickl
surgical lightFAJB06XV1VQVZMagnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissorsExcelta366stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointmentActavis PharmaNDC 0472-0179-34Antibiotic
TV catheterCustomBD 30G needle: 305106Catheter for TV injection
Two photon filterChroma320282ET585/65m-2P
two-photon laserCoherent charmeleonTunable multiphoton laser
ultrasound gelParkerPKR-03-02Water immersion gel
Urea crystalsSigmaU5128-5GOptional: FLIM IRF

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