תרשימים אוטומטיים של המרחב החזותי של העיניים המורכבות של Housefly

Summary

הפרוטוקול כאן מתאר את מדידת הארגון המרחבי של הצירים החזותיים של עיני הבית, הממופים על ידי מכשיר אוטומטי, באמצעות תופעת הפסאודו-פופיל ומנגנון האישון של תאי הפוטורצפטור.

Abstract

מאמר זה מתאר את המדידה האוטומטית של הארגון המרחבי של הצירים החזותיים של עיניים מורכבות חרקים, המורכבות מכמה אלפי יחידות חזותיות הנקראות אומטידיה. כל אומטידיום מדגים את המידע האופטי מזווית מוצקה קטנה, עם רגישות משוערת של גאוס התפלגות (חצי רוחב בסדר גודל של 1°) שבמרכזה ציר ראייה. יחד, האומטידיה אוספת את המידע החזותי משדה ראייה כמעט פנורמי. ההתפלגות המרחבית של הצירים החזותיים קובעת אפוא את הרזולוציה המרחבית של העין. הידע על הארגון האופטי של עין מורכבת וחדות הראייה שלה הוא חיוני למחקרים כמותיים של עיבוד עצבי של המידע החזותי. כאן אנו מציגים הליך אוטומטי למיפוי צירי הראייה של עין מורכבת, תוך שימוש בתופעה אופטית פנימית, in vivo , הפסאודו-פופיל, ומנגנון האישון של תאי הפוטורצפטור. אנו מתווים את המערך האופטומכני לסריקת עיני החרקים ומשתמשים בתוצאות ניסיוניות המתקבלות מ-housefly, Musca domestica, כדי להמחיש את השלבים בהליך המדידה.

Introduction

הקומפקטיות של מערכות הראייה של חרקים והזריזות של בעליהן, המדגימות עיבוד מידע חזותי מפותח מאוד, סיקרנו אנשים מרקע מדעי ולא מדעי כאחד. עיניים מורכבות חרקים זוהו כמכשירים אופטיים רבי עוצמה המאפשרים יכולות ראייה חריפות ורב-תכליתיות ^1,2. זבובים, למשל, ידועים בתגובות המהירות שלהם לעצמים נעים, והדבורים מפורסמות בכך שהן בעלות ראיית צבעים וראיית קיטוב².

העיניים המורכבות של פרוקי הרגליים מורכבות מיחידות דומות אנטומית רבות, האומטידיה, שכל אחת מהן מכוסה בעדשת פן. ב-Diptera (זבובים), הרכבה של עדשות פאה, הידועות באופן קולקטיבי כקרנית, קרובות לחצי כדור. כל אומטידיום מדגים אור תקרית מזווית מוצקה קטנה עם חצי רוחב בסדר גודל של 1°. האומטידיה של שתי העיניים יחד מדגימה בערך את מלוא הזווית המוצקה, אך הצירים החזותיים של האומטידיה אינם מופצים באופן שווה. באזורי עיניים מסוימים יש צפיפות גבוהה של צירי ראייה, מה שיוצר אזור של חדות מרחבית גבוהה, הנקרא באופן מילולי fovea. לחלק הנותר של העין יש אז רזולוציה מרחבית גסה יותר 3,4,5,6,6,7,8,9.

ניתוח כמותי של הארגון האופטי של העיניים המורכבות הוא חיוני למחקרים מפורטים של העיבוד העצבי של מידע חזותי. מחקרים על הרשתות העצביות של מוחו של חרק¹⁰ דורשים לעתים קרובות ידע על ההתפלגות המרחבית של הצירים האומטידיים. יתר על כן, עיניים מורכבות היוו השראה למספר חידושים טכניים. יוזמות רבות לייצור עיניים מלאכותיות בהשראה ביולוגית נבנו על מחקרים כמותיים קיימים של עיניים מורכבות אמיתיות 11,12,13. לדוגמה, חיישן מבוסס מוליכים למחצה עם רזולוציה מרחבית גבוהה תוכנן על סמך המודל של עיניים מורכבות חרקים 11,14,15,16,17. עם זאת, המכשירים שפותחו עד כה לא יישמו את המאפיינים האמיתיים של עיני החרקים הקיימות. ייצוגים מדויקים של עיניים מורכבות חרקים והארגון המרחבי שלהן ידרשו נתונים מפורטים ואמינים מעיניים טבעיות, שאינן זמינות באופן נרחב.

הסיבה העיקרית למחסור בנתונים היא המייגעות הקיצונית של ההליכים הזמינים לשרטוט המאפיינים המרחביים של העיניים. זה הניע ניסיונות להקים הליך מיפוי עיניים אוטומטי יותר. בניסיון ראשון לניתוח אוטומטי של עיניים מורכבות חרקים, דאגלס וולינג¹⁸ פיתחו הליך סריקה למיפוי גדלי פנים בקרנית והדגימו את היתכנותו עבור כמה מיני זבובים. כאן אנו מרחיבים את גישתם על ידי פיתוח שיטות לא רק לסריקת היבטי הקרנית אלא גם להערכת הצירים החזותיים של האומטידיה שאליהם שייכים ההיבטים. אנו מציגים את המקרה של housefly eyes כדי להדגים את ההליכים המעורבים.

המערך הניסיוני לסריקת עיני חרקים הוא: אופטי בחלקו, כלומר מיקרוסקופ עם מצלמה ואופטיקה של תאורה; מכני בחלקו, כלומר מערכת גוניומטר לסיבוב החרק הנחקר; וחישוב חלקי, כלומר שימוש במנהלי התקנים של תוכנה עבור המכשירים והתוכנות לביצוע מדידות וניתוחים. השיטות שפותחו כוללות מגוון של הליכים חישוביים, החל מלכידת תמונות, בחירת ערוצי מצלמה וקביעת ספי עיבוד תמונה וכלה בזיהוי מיקומי היבטים בודדים באמצעות נקודות אור בהירות המוחזרות מהמשטחים הקמורים שלהן. שיטות התמרת פורייה היו חיוניות בניתוח התמונה, הן לאיתור היבטים בודדים והן לניתוח דפוסי הפאות.

המאמר בנוי באופן הבא. תחילה אנו מציגים את מערך הניסוי ואת תופעת הפסאודו-פופיל - הסמן האופטי המשמש לזיהוי הצירים החזותיים של הפוטורצפטורים בעיניים חיות 19,20,21. לאחר מכן, האלגוריתמים המשמשים בהליך הסריקה ובניתוח התמונה מתוארים.

Protocol

הפרוטוקול הוא בהתאם להנחיות הטיפול בחרקים של האוניברסיטה.

1. הכנת בית, מוסקה בייתה

1. לאסוף את הזבוב מהאוכלוסייה שגודלה במעבדה. הניחו את הזבוב במחזיק הפליז (איור 1).
   1. חותכים 6 מ"מ מהחלק העליון של הצינור המרסן (ראו טבלת חומרים). לחלק העליון החדש של הצינור יש קוטר חיצוני של 4 מ"מ וקוטר פנימי של 2.5 מ"מ (איור 1A). מניחים את הזבוב החי בתוך הצינור, אוטמים את הצינור בכותנה כדי למנוע פגיעה בזבוב, ודוחפים את הזבוב כך שהראש בולט מהצינור וגופו מרוסן (איור 1B). שתקו את הראש בשעוות דבורים כך שהעיניים יישארו חשופות (איור 1C-E).
   2. חותכים את הצינור שוב כך שאורך הצינור הוא 10 מ"מ (איור 1C). מניחים את צינור הפלסטיק עם הזבוב במחזיק הפליז, כך שעין אחת של הזבוב מצביעה כלפי מעלה כאשר המחזיק מונח על שולחן (איור 1D,E).
2. התאימו את כיוון הצינור כך שכאשר גובה הגוניומטר יהיה ב-0° (כלומר, שלב האזימוט נמצא במצב אופקי), קרן ההארה האנכית של המיקרוסקופ תהיה בניצב למשטח העין באזור מרכזי, בין הגחון לגב, ובין הקצוות הקדמיים והאחוריים של העין, כך שניתן יהיה לסרוק את העין כולה בטווח האזימוט והגובה המותרים על ידי ההתקנה.

2. יישור ציר האזימוט המסתובב של הגוניומטר עם הציר האופטי של המיקרוסקופ

1. הרכיבו סיכת יישור על שלב הסיבוב של האזימוט כך שניתן יהיה להתאים את מיקום x-y של הקצה כך שיתאים לציר האזימוט על הבמה הממונעת. במהלך הצפייה במיקרוסקופ, המצויד במטרה של פי 5, התמקדו בקצה באמצעות הג'ויסטיק של ציר z (איור 2).
2. יישמו את כוונון x-y של ציר האזימוט עם הציר האופטי של המיקרוסקופ וודאו כי צירי הגובה והאזימוט הסיבוביים מיושרים מראש עם הסיכה הממורכזת, באמצעות הג'ויסטיקים של ציר x ו-y.
3. תמרנו את האזימוט ואת ג'ויסטיקי ההגבהה כדי לבדוק אם הסיכה ממורכזת ביחס לשתי דרגות החופש. כאשר הוא ממורכז היטב, קצה הסיכה נשאר, בערך, באותו מיקום במהלך אזימוט וסיבובי גובה.

3. יישור עין הזבוב עם השלבים הממונעים

1. כאשר שלב הגובה הוא 0°, הרכיבו את הזבוב ומחזיקו על שלב האזימוט. התבונן בעין הזבוב באמצעות המיקרוסקופ.
2. כאשר נורית התאורה דולקת, התאם את המיקום האופקי של הזבוב כך שמרכז הפסאודו-פופיל יתיישר עם המיקרוסקופ. התאם את המיקום האנכי של הזבוב באמצעות הבורג המסתובב של המחזיק (איור 1D), כך שהפסאודו-פופיל העמוק (DPP; איור 3) 19,20,21 מובא לפוקוס ברמת ציר הגובה.
3. יישרו את ה-DPP ביחס לצירי האזימוט וההגבהה על-ידי ריכוזו בשדה הראייה (ראו איור 2). השתמשו במגנטים המודבקים לתחתית מחזיק הזבובים כדי להצמיד אותו בחוזקה ללוח ברזל המותקן על שלב האזימוט, תוך מתן אפשרות להתאמות החלקה ידניות.
   1. העבר את התצוגה למצלמה הדיגיטלית המותקנת במיקרוסקופ. הפעל את אתחול התוכנה של מערכת GRACE, הכוללת אתחול בקרי המנוע ובקר ה-LED של Arduino (איור 4). לכן, פתח את MATLAB R2020a או גרסה גבוהה יותר. הפעל את Initialize_All_Systems הסקריפט של MATLAB (קובץ משלים 1).
4. ודא אם הפסאודו-פופיל של הזבוב (איור 3B,C) נמצא במרכז התמונה המוקרנת על מסך המחשב.

4. מיקוד אוטומטי ומרכז אוטומטי

1. הביאו את הפוקוס לרמה של פסאודו-פופיל הקרנית (CPP; איור 3B) 19,20,21 ידנית באמצעות הג'ויסטיק של ציר z.
2. הפעל את אלגוריתם המיקוד האוטומטי (קובץ משלים 1, מיקוד אוטומטי של סקריפט) כדי להשיג תמונה חדה ברמת הקרנית. בדוק על ידי החזרת המיקוד לרמת DPP על ידי התאמת שלב ציר ה- z הממונע. אחסן את המרחק בין ה- DPP ל- CPP (בשלבי המנוע).
3. כוונון עדין של מרכוז פסאודו-פופיל על-ידי הפעלת אלגוריתם המרכז האוטומטי (קובץ משלים 1, Script AC). החזירו את המיקוד לרמת CPP.
4. הפעל מחדש את אלגוריתם המיקוד האוטומטי. אפס את השלבים הממונעים במיקומם הנוכחי (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0,0), כאשר E הוא גובה ו-A הוא אזימוט.
5. הפעל את אלגוריתם הסריקה (קובץ משלים 1, סקריפט Scan_Begin), אשר מדגים תמונות עיניים לאורך מסלולים בצעדים של 5° , תוך ביצוע האלגוריתמים של מרכז אוטומטי ומיקוד אוטומטי.
6. בסיום הדגימה, כבה את בקר ה- LED ואת בקרי המנוע.
7. לעבד את התמונות על ידי החלת האלגוריתמים לעיבוד תמונה (קובץ משלים 1, סקריפט ImProcFacets).

תוצאות

בעלי חיים וגירוי אופטי
ניסויים מבוצעים על פלי בית (Musca domestica) המתקבלים מתרבות המתוחזקת על ידי המחלקה לגנטיקה אבולוציונית באוניברסיטת חרונינגן. לפני המדידות, זבוב משותק על ידי הדבקתו בשעווה בעלת נקודת התכה נמוכה בצינור מתאים היטב. הזבוב מותקן לאחר מכן על הבמה של גוניומטר ממו...

Discussion

ניתן לשרטט את ההתפלגות המרחבית של הצירים החזותיים של עיני הבית באמצעות תופעת הפסאודו-פופיל של עיניים מורכבות ושינויי ההשתקפות הנגרמים על ידי מנגנון האישון התלוי באור. לכן, זבוב נחקר מותקן במערכת גוניומטרית, המאפשרת בדיקה של תבנית הפאה המקומית עם מערך מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית, הכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms