Cartographie automatisée de l’espace visuel des yeux composés de mouches domestiques

Résumé

Le protocole décrit ici la mesure de l’organisation spatiale des axes visuels des yeux des mouches domestiques, cartographiés par un dispositif automatique, en utilisant le phénomène pseudopieux et le mécanisme pupillaire des cellules photoréceptrices.

Résumé

Cet article décrit la mesure automatique de l’organisation spatiale des axes visuels des yeux composés d’insectes, qui se composent de plusieurs milliers d’unités visuelles appelées ommatidies. Chaque ommatidium échantillonne l’information optique à partir d’un petit angle solide, avec une sensibilité approximative distribuée par Gauss (demi-largeur de l’ordre de 1°) centrée autour d’un axe visuel. Ensemble, les ommatidies recueillent les informations visuelles à partir d’un champ de vision presque panoramique. La distribution spatiale des axes visuels détermine ainsi la résolution spatiale de l’œil. La connaissance de l’organisation optique d’un œil composé et de son acuité visuelle est cruciale pour les études quantitatives du traitement neuronal de l’information visuelle. Nous présentons ici une procédure automatisée pour cartographier les axes visuels d’un œil composé, en utilisant un phénomène optique intrinsèque in vivo , le pseudopôle, et le mécanisme pupillaire des cellules photoréceptrices. Nous décrivons la configuration optomécanique pour scanner les yeux des insectes et utilisons les résultats expérimentaux obtenus à partir d’une mouche domestique, Musca domestica, pour illustrer les étapes de la procédure de mesure.

Introduction

La compacité des systèmes visuels d’insectes et l’agilité de leurs propriétaires, démontrant un traitement de l’information visuelle très développé, ont intrigué des personnes de milieux scientifiques et non scientifiques. Les yeux composés d’insectes ont été reconnus comme de puissants dispositifs optiques permettant des capacités visuelles aiguës et polyvalentes ^1,2. Les mouches, par exemple, sont bien connues pour leurs réponses rapides aux objets en mouvement, et les abeilles sont célèbres pour posséder une vision des couleurs et une vision de polarisation².

Les yeux composés des arthropodes se composent de nombreuses unités anatomiquement similaires, les ommatidies, dont chacune est coiffée d’une lentille à facettes. Chez les diptères (mouches), l’assemblage de lentilles à facettes, connues collectivement sous le nom de cornée, se rapproche souvent d’un hémisphère. Chaque ommatidium échantillonne la lumière incidente à partir d’un petit angle solide avec une demi-largeur de l’ordre de 1°. Les ommatidies des deux yeux ensemble échantillonnent approximativement l’angle solide complet, mais les axes visuels des ommatidies ne sont pas répartis uniformément. Certaines zones oculaires ont une forte densité d’axes visuels, ce qui crée une région de haute acuité spatiale, familièrement appelée fovéa. La partie restante de l’œil a alors une résolution spatiale plus grossière 3,4,5,6,7,8,9.

Une analyse quantitative de l’organisation optique des yeux composés est cruciale pour des études détaillées du traitement neuronal de l’information visuelle. L’étude des réseaux neuronaux du cerveau d’un insecte¹⁰ nécessite souvent une connaissance de la distribution spatiale des axes ommatidiens. De plus, les yeux composés ont inspiré plusieurs innovations techniques. De nombreuses initiatives visant à produire des yeux artificiels bio-inspirés ont été construites sur des études quantitatives existantes d’yeux composés réels ^11,12,13. Par exemple, un capteur à base de semi-conducteurs avec une résolution spatiale élevée a été conçu sur la base du modèle d’yeux composés ^d’insectes 11,14,15,16,17. Cependant, les dispositifs développés jusqu’à présent n’ont pas mis en œuvre les caractéristiques réelles des yeux d’insectes existants. Des représentations précises des yeux composés d’insectes et de leur organisation spatiale nécessiteront des données détaillées et fiables provenant des yeux naturels, qui ne sont pas largement disponibles.

La principale raison de la rareté des données est l’extrême pénibilité des procédures disponibles pour cartographier les caractéristiques spatiales des yeux. Cela a motivé les tentatives d’établir une procédure de cartographie oculaire plus automatisée. Lors d’une première tentative d’analyse automatisée des yeux composés d’insectes, Douglass et Wehling¹⁸ ont mis au point une procédure de balayage pour cartographier la taille des facettes dans la cornée et ont démontré sa faisabilité pour quelques espèces de mouches. Ici, nous étendons leur approche en développant des méthodes non seulement pour scanner les facettes de la cornée, mais aussi pour évaluer les axes visuels des ommatidies auxquelles appartiennent les facettes. Nous présentons le cas des yeux de mouche domestique pour illustrer les procédures impliquées.

La configuration expérimentale pour scanner les yeux des insectes est: partiellement optique, c’est-à-dire un microscope avec caméra et optique d’éclairage; partiellement mécanique, c’est-à-dire un système de goniomètre pour faire tourner l’insecte étudié; et partiellement informatique, c’est-à-dire l’utilisation de pilotes logiciels pour les instruments et les programmes d’exécution des mesures et des analyses. Les méthodes développées englobent une gamme de procédures de calcul, allant de la capture d’images, au choix des canaux de caméra et à la définition de seuils de traitement d’image à la reconnaissance des emplacements de facettes individuelles via des points lumineux de lumière réfléchis par leurs surfaces convexes. Les méthodes de transformation de Fourier étaient cruciales dans l’analyse d’images, à la fois pour détecter des facettes individuelles et pour analyser les modèles de facettes.

Le document est structuré comme suit. Nous introduisons d’abord la configuration expérimentale et le phénomène des pseudopieux - le marqueur optique utilisé pour identifier les axes visuels des photorécepteurs dans les yeux vivants 19,20,21. Par la suite, les algorithmes utilisés dans la procédure de numérisation et l’analyse d’images sont décrits.

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Protocole

Le protocole est conforme aux lignes directrices de l’Université en matière de soins aux insectes.

1. Préparation d’une mouche domestique, Musca domestica

1. Recueillez la mouche dans la population élevée en laboratoire. Placez la mouche dans le porte-laiton (Figure 1).
   1. Couper à 6 mm de la partie supérieure du tube de retenue (voir Tableau des matériaux). La nouvelle partie supérieure du tube a un diamètre extérieur de 4 mm et un diamètre intérieur de 2,5 mm (Figure 1A). Placez la mouche vivante à l’intérieur du tube, scellez le tube avec du coton pour éviter d’endommager la mouche et poussez la mouche de telle sorte que la tête dépasse du tube et que son corps soit retenu (Figure 1B). Immobiliser la tête avec de la cire d’abeille de manière à ce que les yeux restent à découvert (Figure 1C-E).
   2. Coupez à nouveau le tube de telle sorte que la longueur du tube soit de 10 mm (Figure 1C). Placez le tube en plastique avec la mouche dans le support en laiton, de sorte qu’un œil de la mouche pointe vers le haut lorsque le support repose sur une table (Figure 1D, E).
2. Ajustez l’orientation du tube de telle sorte qu’avec l’élévation du goniomètre à 0° (c’est-à-dire que l’étage azimutal est en position horizontale), le faisceau d’éclairage vertical du microscope soit perpendiculaire à la surface de l’œil dans une région centrale, entre le ventral et le dorsal, et entre les bords antérieur et postérieur de l’œil, de sorte que l’œil entier puisse être scanné dans la plage d’azimut et d’élévation autorisée par la configuration.

2. Alignement de l’axe azimutal rotatif du goniomètre avec l’axe optique du microscope

1. Montez une broche d’alignement sur l’étage de rotation azimutal afin que la position x-y de la pointe puisse être ajustée pour coïncider avec l’axe azimutal sur l’étage motorisé. Lors de la visualisation avec le microscope, équipé d’un objectif 5x, concentrez-vous sur la pointe à l’aide du joystick de l’axe Z (Figure 2).
2. Alignez le réglage x-y de l’axe azimutal avec l’axe optique du microscope et assurez-vous que les axes rotatifs d’élévation et d’azimut sont pré-alignés avec la broche centrée, à l’aide des joysticks des axes x et y.
3. Manipulez les joysticks d’azimut et d’élévation pour vérifier si la broche est centrée par rapport aux deux degrés de liberté. Lorsqu’elle est bien centrée, la pointe de la broche reste approximativement dans la même position pendant les rotations d’azimut et d’élévation.

3. Alignement de l’œil de mouche avec les étages motorisés

1. Avec l’étage d’élévation à 0°, montez la mouche et son support sur l’étage azimutal. Observez l’œil de la mouche avec le microscope.
2. Avec la LED d’éclairage activée, ajustez la position horizontale de la mouche de sorte que le centre du pseudopieux soit aligné avec le microscope. Ajuster la position verticale de la mouche à l’aide de la vis rotative du support (Figure 1D), de sorte que le pseudopieux profond (DPP; Graphique 3) 19,20,21 est mis au point au niveau de l’axe d’élévation.
3. Alignez le DPP par rapport aux axes d’azimut et d’élévation en le centrant dans le champ de vision (voir Figure 2). Utilisez les aimants collés au bas du porte-mouches pour l’apposer fermement sur une plaque de fer montée sur l’étage azimutal, tout en permettant des réglages manuels de glissement.
   1. Basculez la vue sur l’appareil photo numérique monté au microscope. Exécutez l’initialisation logicielle du système GRACE, qui inclut l’initialisation des contrôleurs de moteur et du contrôleur LED Arduino (Figure 4). Par conséquent, ouvrez MATLAB R2020a ou une version ultérieure. Exécutez le script MATLAB Initialize_All_Systems (fichier supplémentaire 1).
4. Vérifiez si le pseudopêle de la mouche (Figure 3B,C) est au centre de l’image projetée sur l’écran de l’ordinateur.

4. Mise au point automatique et autocentrage

1. Mettre l’accent sur le niveau du pseudopôle cornéen (CPP; Figure 3B) 19,20,21 manuellement à l’aide du joystick de l’axe z.
2. Exécutez l’algorithme de mise au point automatique (fichier supplémentaire 1, script AF) pour obtenir une image nette au niveau de la cornée. Vérifiez en ramenant la mise au point au niveau DPP en ajustant l’étage motorisé de l’axe Z. Stockez la distance entre le DPP et le CPP (par étapes du moteur).
3. Affinez le centrage du pseudopôle en exécutant l’algorithme de centrage automatique (fichier supplémentaire 1, script AC). Ramenez l’accent sur le RPC.
4. Réexécutez l’algorithme de mise au point automatique. Mettez à zéro les étages motorisés à leur position actuelle (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), où E est élévation et A est azimut.
5. Exécutez l’algorithme de numérisation (fichier supplémentaire 1, script Scan_Begin), qui échantillonne les images oculaires le long des trajectoires par étapes de 5°, tout en exécutant les algorithmes d’autocentrage et de mise au point automatique.
6. À la fin de l’échantillonnage, éteignez le contrôleur LED et les contrôleurs de moteur.
7. Traitez les images en appliquant les algorithmes de traitement d’image (fichier supplémentaire 1, script ImProcFacets).

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Résultats

Animaux et stimulation optique
Les expériences sont réalisées sur des mouches domestiques (Musca domestica) obtenues à partir d’une culture maintenue par le Département de génétique évolutive de l’Université de Groningue. Avant les mesures, une mouche est immobilisée en la collant avec une cire à faible point de fusion dans un tube bien ajusté. La mouche est ensuite montée sur la scène d’un goniomètre motorisé. Le centre des deux étages rotatifs coïncide avec le point ...

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Discussion

La distribution spatiale des axes visuels des yeux de mouche domestique peut être cartographiée à l’aide du phénomène pseudopieux des yeux composés et des changements de réflexion causés par le mécanisme de pupille dépendant de la lumière. Par conséquent, une mouche étudiée est montée dans un système goniométrique, ce qui permet d’inspecter le motif de facettes locales avec une configuration de microscope équipée d’un appareil photo numérique, le tout sous contrôle informatique. L’analyse d?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms