Автоматизированное картографирование визуального пространства составных глаз комнатной мухи

Резюме

Протокол здесь описывает измерение пространственной организации зрительных осей глаз комнатной мухи, нанесенных на карту автоматическим устройством, с использованием явления псевдопупила и механизма зрачка фоторецепторных клеток.

Аннотация

В данной работе описывается автоматическое измерение пространственной организации зрительных осей глаз насекомых, которые состоят из нескольких тысяч зрительных единиц, называемых омматидиями. Каждый омматидий отбирает оптическую информацию под небольшим сплошным углом, с приблизительной гауссовской распределенной чувствительностью (половина ширины порядка 1°), центрированной вокруг визуальной оси. Вместе омматидии собирают визуальную информацию из почти панорамного поля зрения. Пространственное распределение визуальных осей, таким образом, определяет пространственное разрешение глаза. Знание оптической организации сложного глаза и его остроты зрения имеет решающее значение для количественных исследований нейронной обработки визуальной информации. Здесь мы представляем автоматизированную процедуру картирования зрительных осей сложного глаза, используя внутреннее, in vivo оптическое явление, псевдопупил, и механизм зрачка фоторецепторных клеток. Мы описываем оптомеханическую установку для сканирования глаз насекомых и используем экспериментальные результаты, полученные от комнатной мухи Musca domestica, чтобы проиллюстрировать этапы процедуры измерения.

Введение

Компактность зрительных систем насекомых и ловкость их владельцев, демонстрирующая высокоразвитую обработку визуальной информации, заинтриговали людей как из научных, так и из ненаучных слоев. Составные глаза насекомых были признаны мощными оптическими устройствами, обеспечивающими острые и универсальные зрительные способности ^1,2. Мухи, например, хорошо известны своей быстрой реакцией на движущиеся объекты, а пчелы славятся тем, что обладают цветовым зрением и поляризационным зрением².

Составные глаза членистоногих состоят из многочисленных анатомически сходных единиц, омматидий, каждая из которых увенчана фасеточной линзой. У Двукрылых (мух) сборка фасетных линз, известных в совокупности как роговица, часто приближается к полушарию. Каждый омматидий пробы падающего света с небольшого сплошного угла половинной ширины порядка 1°. Омматидии двух глаз вместе отбирают примерно полный сплошной угол, но зрительные оси омматидий распределены неравномерно. Некоторые области глаз имеют высокую плотность зрительных осей, что создает область высокой пространственной остроты, в просторечии называемую ямкой. Оставшаяся часть глаза имеет более грубое пространственное разрешение 3,4,5,6,7,8,9.

Количественный анализ оптической организации сложных глаз имеет решающее значение для детальных исследований нейронной обработки визуальной информации. Исследования нейронных сетей мозга насекомого¹⁰ часто требуют знания пространственного распределения омматидиальных осей. Кроме того, сложные глаза вдохновили несколько технических инноваций. Многие инициативы по созданию био-вдохновленных искусственных глаз были построены на существующих количественных исследованиях реальных сложных глаз 11,12,13. Например, полупроводниковый датчик с высоким пространственным разрешением был разработан на основе модели глаз насекомых 11,14,15,16,17. Однако разработанные до сих пор устройства не реализовали фактические характеристики существующих глаз насекомых. Точное представление о сложных глазах насекомых и их пространственной организации потребует подробных и надежных данных от естественных глаз, которые не являются широко доступными.

Основной причиной скудости данных является крайняя утомительность имеющихся процедур построения графиков пространственных характеристик глаз. Это мотивировало попытки создать более автоматизированную процедуру картирования глаз. В первой попытке автоматизированного анализа глаз насекомых Дуглас и Велинг¹⁸ разработали процедуру сканирования для картирования размеров фасеток в роговице и продемонстрировали ее осуществимость для нескольких видов мух. Здесь мы расширяем их подход, разрабатывая методы не только сканирования граней роговицы, но и оценки визуальных осей омматидий, к которым принадлежат фасетки. Мы представляем случай с глазами комнатной мухи, чтобы проиллюстрировать соответствующие процедуры.

Экспериментальная установка для сканирования глаз насекомых является: частично оптической, т.е. микроскопом с камерой и оптикой освещения; частично механическая, т.е. гониометрическая система для вращения исследуемого насекомого; и частично вычислительное, т.е. использование программных драйверов для приборов и программ для выполнения измерений и анализов. Разработанные методы охватывают целый ряд вычислительных процедур, от захвата изображений, выбора каналов камеры и установки пороговых значений обработки изображений до распознавания отдельных фасетных местоположений с помощью ярких пятен света, отраженных от их выпуклых поверхностей. Методы преобразования Фурье имели решающее значение в анализе изображений, как для обнаружения отдельных граней, так и для анализа фасетных паттернов.

Документ структурирован следующим образом. Сначала мы представляем экспериментальную установку и феномен псевдопупила — оптический маркер, используемый для идентификации зрительных осей фоторецепторов в живых глазах 19,20,21. Далее излагаются алгоритмы, используемые в процедуре сканирования и анализе изображений.

протокол

Протокол соответствует руководящим принципам Университета по уходу за насекомыми.

1. Приготовление комнатной мухи, Musca domestica

1. Соберите муху из лабораторно выращенной популяции. Поместите муху в латунный держатель (рисунок 1).
   1. Отрежьте 6 мм от верхней части удерживающей трубки (см. Таблицу материалов). Новая верхняя часть трубы имеет внешний диаметр 4 мм и внутренний диаметр 2,5 мм (рисунок 1А). Поместите живую муху внутрь трубки, запечатайте трубку хлопком, чтобы предотвратить повреждение мухи, и толкните муху так, чтобы голова выступала из трубки, а ее тело удерживалось (рисунок 1B). Обездвижьте голову пчелиным воском так, чтобы глаза оставались непокрытыми (рисунок 1С-Е).
   2. Снова отрежьте трубку так, чтобы длина трубки составляла 10 мм (рисунок 1С). Поместите пластиковую трубку с мухой в латунный держатель таким образом, чтобы один глаз мухи указывал вверх, когда держатель опирается на столешницу (рисунок 1D, E).
2. Отрегулируйте ориентацию трубки таким образом, чтобы при возвышении гониометра на 0° (т.е. азимутальная ступень находится в горизонтальном положении) вертикальный пучок освещения микроскопа был перпендикулярен поверхности глаза в центральной области, между вентральным и дорсальным, а также между передним и задним краями глаза, чтобы весь глаз можно было сканировать в пределах диапазона азимута и высоты, разрешенных установкой.

2. Выравнивание оси вращения азимута гониометра с оптической осью микроскопа

1. Установите штифт выравнивания на азимутальной ступени вращения таким образом, чтобы положение x-y наконечника можно было отрегулировать в соответствии с осью азимута на моторизованной ступени. Во время просмотра с помощью микроскопа, оснащенного 5-кратным объективом, сосредоточьтесь на наконечнике с помощью джойстика оси Z (рисунок 2).
2. Совместите регулировку x-y оси азимута с оптической осью микроскопа и убедитесь, что оси возвышения и азимута вращающегося оси предварительно выровнены с центрированным штифтом с помощью джойстиков осей x и y.
3. Манипулируйте джойстиками азимута и высоты, чтобы проверить, центрирован ли штифт относительно обеих степеней свободы. При хорошем центрировании кончик штифта остается примерно в том же положении во время вращения по азимуту и высоте.

3. Выравнивание глаз мухи с моторизованными ступенями

1. При подъеме ступени на 0° установите муху и ее держатель на азимутальную ступень. Понаблюдайте за глазом мухи с помощью микроскопа.
2. Когда светодиод подсветки включен, отрегулируйте горизонтальное положение мухи так, чтобы центр псевдопупила был выровнен с микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение мухи с помощью вращающегося винта держателя (рисунок 1D), так, чтобы глубокий псевдопупил (DPP; Рисунок 3) 19,20,21 выводится в фокус на уровне оси возвышения.
3. Выровняйте DPP по отношению к осям азимута и высоты, центрировав его в поле зрения (см. рисунок 2). Используйте магниты, приклеенные к нижней части держателя мухи, чтобы прочно прикрепить его к железной пластине, установленной на азимутальной ступени, позволяя при этом ручную регулировку скольжения.
   1. Переключите вид на цифровую камеру, установленную на микроскопе. Запустите программную инициализацию системы GRACE, которая включает в себя инициализацию контроллеров двигателя и контроллера Arduino LED (рисунок 4). Поэтому откройте MATLAB R2020a или более позднюю версию. Запустите сценарий MATLAB Initialize_All_Systems (дополнительный файл 1).
4. Проверьте, находится ли псевдопупил мухи (рисунок 3B, C) в центре проецируемого изображения на экране компьютера.

4. Автофокусировка и автоцентрирование

1. Довести фокус до уровня псевдопупила роговицы (CPP; Рисунок 3B) 19,20,21 вручную с помощью джойстика оси Z.
2. Запустите алгоритм автофокусировки (дополнительный файл 1, автофокусировка скрипта), чтобы получить четкое изображение на уровне роговицы. Проверьте, вернув фокус на уровень DPP, отрегулировав моторизованный каскад оси Z. Сохраняйте расстояние между DPP и CPP (в шагах двигателя).
3. Тонкая настройка центрирования псевдопупила путем запуска алгоритма автоцентрирования (дополнительный файл 1, сценарий AC). Верните фокус на уровень CPP.
4. Повторно запустите алгоритм автофокусировки. Обнулите моторизованные ступени в их текущих положениях (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), где E - высота, а A - азимут.
5. Запустите алгоритм сканирования (дополнительный файл 1, скрипт Scan_Begin), который сэмплирует изображения глаз по траекториям с шагом 5°, выполняя алгоритмы автоцентрирования и автофокусировки.
6. По завершении отбора проб выключите светодиодный контроллер и контроллеры двигателя.
7. Обработайте изображения, применив алгоритмы обработки изображений (Дополнительный файл 1, скрипт ImProcFacets).

Результаты

Животные и оптическая стимуляция
Эксперименты проводятся на комнатных мухах (Musca domestica), полученных из культуры, поддерживаемой департаментом эволюционной генетики в Университете Гронингена. Перед измерениями муху обездвиживают, склеивая ее воском с низкой температур?...

Обсуждение

Пространственное распределение зрительных осей глаз комнатной мухи может быть построено с использованием псевдопупильского феномена сложных глаз и изменений отражения, вызванных светозависимым механизмом зрачка. Поэтому исследуемая муха устанавливается в гониометрическую систем?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms