Creazione automatica di grafici dello spazio visivo degli occhi composti di Housefly

Riepilogo

Il protocollo qui descrive la misurazione dell'organizzazione spaziale degli assi visivi degli occhi delle mosche domestiche, mappati da un dispositivo automatico, utilizzando il fenomeno pseudopupil e il meccanismo pupillare delle cellule fotorecettori.

Abstract

Questo documento descrive la misurazione automatica dell'organizzazione spaziale degli assi visivi degli occhi composti di insetti, che consistono in diverse migliaia di unità visive chiamate ommatidi. Ogni ommatidio campiona le informazioni ottiche da un piccolo angolo solido, con una sensibilità approssimativa distribuita gaussiana (mezza larghezza dell'ordine di 1°) centrata attorno a un asse visivo. Insieme, gli ommatidi raccolgono le informazioni visive da un campo visivo quasi panoramico. La distribuzione spaziale degli assi visivi determina quindi la risoluzione spaziale dell'occhio. La conoscenza dell'organizzazione ottica di un occhio composto e della sua acuità visiva è cruciale per gli studi quantitativi di elaborazione neurale dell'informazione visiva. Qui presentiamo una procedura automatizzata per mappare gli assi visivi di un occhio composto, utilizzando un fenomeno ottico intrinseco in vivo , lo pseudopupil e il meccanismo pupillare delle cellule fotorecettrici. Descriviamo la configurazione optomeccanica per la scansione degli occhi degli insetti e utilizziamo i risultati sperimentali ottenuti da una mosca domestica, Musca domestica, per illustrare le fasi della procedura di misurazione.

Introduzione

La compattezza dei sistemi visivi degli insetti e l'agilità dei loro proprietari, dimostrando un'elaborazione delle informazioni visive altamente sviluppata, hanno incuriosito persone provenienti da background sia scientifici che non scientifici. Gli occhi composti di insetti sono stati riconosciuti come potenti dispositivi ottici che consentono capacità visive acute e versatili ^1,2. Le mosche, ad esempio, sono ben note per le loro risposte rapide agli oggetti in movimento e le api sono famose per possedere la visione dei colori e la visione polarizzazione².

Gli occhi composti degli artropodi sono costituiti da numerose unità anatomicamente simili, gli ommatidi, ognuno dei quali è coperto da una lente sfaccettata. Nei Ditteri (mosche), l'assemblaggio di lenti sfaccettate, conosciute collettivamente come cornea, spesso si avvicina a un emisfero. Ogni ommatidium campiona la luce incidente da un piccolo angolo solido con mezza larghezza dell'ordine di 1°. L'ommatidi dei due occhi insieme campiona approssimativamente l'angolo solido completo, ma gli assi visivi dell'ommatidi non sono distribuiti uniformemente. Alcune aree degli occhi hanno un'alta densità di assi visivi, che crea una regione di elevata acuità spaziale, colloquialmente chiamata fovea. La restante parte dell'occhio ha quindi una risoluzione spaziale più grossolana 3,4,5,6,7,8,9.

Un'analisi quantitativa dell'organizzazione ottica degli occhi composti è cruciale per studi dettagliati dell'elaborazione neurale delle informazioni visive. Gli studi sulle reti neurali del cervello di un insetto¹⁰ spesso richiedono la conoscenza della distribuzione spaziale degli assi ommatidiali. Inoltre, gli occhi composti hanno ispirato diverse innovazioni tecniche. Molte iniziative per produrre occhi artificiali bio-ispirati sono state costruite su studi quantitativi esistenti di occhi composti reali 11,12,13. Ad esempio, un sensore a semiconduttore con alta risoluzione spaziale è stato progettato sulla base del modello di occhi composti di insetti 11,14,15,16,17. Tuttavia, i dispositivi sviluppati finora non hanno implementato le caratteristiche effettive degli occhi di insetto esistenti. Rappresentazioni accurate degli occhi composti di insetti e della loro organizzazione spaziale richiederanno dati dettagliati e affidabili da occhi naturali, che non sono ampiamente disponibili.

La ragione principale della scarsità di dati è l'estrema noiosità delle procedure disponibili per tracciare le caratteristiche spaziali degli occhi. Ciò ha motivato i tentativi di stabilire una procedura di mappatura oculare più automatizzata. In un primo tentativo di analisi automatizzate degli occhi composti degli insetti, Douglass e Wehling¹⁸ hanno sviluppato una procedura di scansione per mappare le dimensioni delle faccette nella cornea e hanno dimostrato la sua fattibilità per alcune specie di mosche. Qui estendiamo il loro approccio sviluppando metodi non solo per scansionare le sfaccettature della cornea, ma anche per valutare gli assi visivi dell'ommatidi a cui appartengono le faccette. Presentiamo il caso degli occhi di mosca domestica per esemplificare le procedure coinvolte.

La configurazione sperimentale per la scansione degli occhi degli insetti è: in parte ottica, cioè un microscopio con fotocamera e ottica di illuminazione; in parte meccanico, cioè un sistema goniometrico per la rotazione dell'insetto indagato; e parzialmente computazionale, cioè l'uso di driver software per gli strumenti e i programmi per l'esecuzione di misurazioni e analisi. I metodi sviluppati comprendono una serie di procedure computazionali, dall'acquisizione di immagini, alla scelta dei canali della telecamera e all'impostazione delle soglie di elaborazione delle immagini al riconoscimento delle singole posizioni delle sfaccettature tramite punti luminosi di luce riflessa dalle loro superfici convesse. I metodi di trasformazione di Fourier sono stati cruciali nell'analisi delle immagini, sia per rilevare le singole sfaccettature che per analizzare i modelli di sfaccettatura.

Il documento è strutturato come segue. Per prima cosa introduciamo la configurazione sperimentale e il fenomeno pseudopupil, il marcatore ottico utilizzato per identificare gli assi visivi dei fotorecettori negli occhi viventi 19,20,21. Successivamente, vengono delineati gli algoritmi utilizzati nella procedura di scansione e nell'analisi delle immagini.

Protocollo

Il protocollo è conforme alle linee guida per la cura degli insetti dell'Università.

1. Preparazione di una mosca domestica, Musca domestica

1. Raccogli la mosca dalla popolazione allevata in laboratorio. Posizionare la mosca nel supporto in ottone (Figura 1).
   1. Tagliare 6 mm dalla parte superiore del tubo di ritenuta (vedi Tabella dei materiali). La nuova parte superiore del tubo ha un diametro esterno di 4 mm e un diametro interno di 2,5 mm (Figura 1A). Posizionare la mosca viva all'interno del tubo, sigillare il tubo con cotone per evitare di danneggiare la mosca e spingere la mosca in modo tale che la testa sporga dal tubo e il suo corpo sia trattenuto (Figura 1B). Immobilizzare la testa con cera d'api in modo tale che gli occhi rimangano scoperti (Figura 1C-E).
   2. Tagliare nuovamente il tubo in modo che la lunghezza del tubo sia di 10 mm (Figura 1C). Posizionare il tubo di plastica con la mosca nel supporto in ottone, in modo tale che un occhio della mosca sia rivolto verso l'alto quando il supporto è appoggiato su un ripiano del tavolo (Figura 1D, E).
2. Regolare l'orientamento del tubo in modo tale che con l'elevazione del goniometro a 0 ° (cioè lo stadio azimutale sia in posizione orizzontale), il fascio di illuminazione verticale del microscopio sia perpendicolare alla superficie dell'occhio in una regione centrale, tra ventrale e dorsale, e tra i bordi anteriore e posteriore dell'occhio, in modo che l'intero occhio possa essere scansionato entro l'intervallo di azimut e l'elevazione consentiti dall'impostazione.

2. Allineamento dell'asse azimutale rotante del goniometro con l'asse ottico del microscopio

1. Montare un perno di allineamento sullo stadio di rotazione azimutale in modo che la posizione x-y della punta possa essere regolata in modo che coincida con l'asse azimutale sullo stadio motorizzato. Durante la visualizzazione con il microscopio, dotato di un obiettivo 5x, concentrarsi sulla punta utilizzando il joystick dell'asse z (Figura 2).
2. Allineare la regolazione x-y dell'asse azimutale con l'asse ottico del microscopio e assicurarsi che gli assi rotanti di elevazione e azimut siano preallineati con il perno centrato, utilizzando i joystick degli assi x e y.
3. Manipolare l'azimut e i joystick di elevazione per verificare se il perno è centrato rispetto a entrambi i gradi di libertà. Quando è ben centrata, la punta del perno rimane, approssimativamente, nella stessa posizione durante le rotazioni azimutali e di elevazione.

3. Allineamento dell'occhio di mosca con gli stadi motorizzati

1. Con lo stadio di elevazione a 0°, montare la mosca e il suo supporto sullo stadio azimutale. Osserva l'occhio della mosca con il microscopio.
2. Con il LED di illuminazione acceso, regolare la posizione orizzontale della mosca in modo che il centro dello pseudopupil sia allineato con il microscopio. Regolare la posizione verticale della mosca utilizzando la vite rotante del supporto (Figura 1D), in modo che lo pseudopupil profondo (DPP; Figura 3) 19,20,21 viene messo a fuoco a livello dell'asse di elevazione.
3. Allineare il DPP rispetto agli assi azimut e di elevazione centrandolo nel campo visivo (vedere la Figura 2). Utilizzare i magneti incollati sul fondo del portamonete per fissarlo saldamente a una piastra di ferro montata sullo stadio azimutale, consentendo al contempo regolazioni manuali dello scorrimento.
   1. Passare la vista alla fotocamera digitale montata al microscopio. Eseguire l'inizializzazione del software del sistema GRACE, che include l'inizializzazione dei controller del motore e del controller LED Arduino (Figura 4). Pertanto, apri MATLAB R2020a o versione successiva. Esegui lo script MATLAB Initialize_All_Systems (File supplementare 1).
4. Confermare se lo pseudopupil della mosca (Figura 3B,C) è al centro dell'immagine proiettata sullo schermo del computer.

4. Messa a fuoco automatica e autocentrazione

1. Portare l'attenzione a livello dello pseudopupil corneale (CPP; Figura 3B) 19,20,21 manualmente utilizzando il joystick dell'asse Z.
2. Esegui l'algoritmo di messa a fuoco automatica (File supplementare 1, script AF) per ottenere un'immagine nitida a livello di cornea. Controllare riportando la messa a fuoco al livello DPP regolando lo stadio motorizzato dell'asse Z. Memorizzare la distanza tra il DPP e il CPP (in fasi del motore).
3. Ottimizza la centratura pseudopupil eseguendo l'algoritmo di autocentering (File supplementare 1, script AC). Riportare l'attenzione al livello CPP.
4. Eseguire nuovamente l'algoritmo di messa a fuoco automatica. Azzerare gli stadi motorizzati nelle loro posizioni correnti (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), dove E è elevazione e A è azimut.
5. Esegui l'algoritmo di scansione (File supplementare 1, script Scan_Begin), che campiona le immagini oculari lungo le traiettorie in passi di 5 °, mentre esegui gli algoritmi di autocentrazione e messa a fuoco automatica.
6. Al termine del campionamento, spegnere il controller LED e i controller del motore.
7. Elaborare le immagini applicando gli algoritmi di elaborazione delle immagini (file supplementare 1, script ImProcFacets).

Risultati

Animali e stimolazione ottica
Gli esperimenti vengono eseguiti su mosche domestiche (Musca domestica) ottenute da una coltura mantenuta dal Dipartimento di Genetica Evoluzionistica dell'Università di Groningen. Prima delle misurazioni, una mosca viene immobilizzata incollandola con una cera a basso punto di fusione in un tubo ben aderente. La mosca viene successivamente montata sul palco di un goniometro motorizzato. Il centro dei due stadi rotanti coincide con il punto focale di una configu...

Discussione

La distribuzione spaziale degli assi visivi degli occhi delle mosche domestiche può essere tracciata utilizzando il fenomeno pseudopupil degli occhi composti e i cambiamenti di riflessione causati dal meccanismo della pupilla dipendente dalla luce. Pertanto, una mosca studiata è montata in un sistema goniometrico, che consente l'ispezione del modello di sfaccettatura locale con una configurazione del microscopio dotata di una fotocamera digitale, il tutto sotto il controllo del computer. L'analisi delle immagini produc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Camera	PointGrey	BFLY-U3-23S6C-C	Acquision of amplified images and digital communication with PC
High power star LED	Velleman	LH3WW	Light source for observation and imaging the compound eye
Holder for the investigated fly	University of Groningen		Different designs were manufactured by the university workshop
Linear motor	ELERO	ELERO Junior 1, version C	Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A)
Low temperature melting wax	various		The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder
Microscope	Zeiss		Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x
Motor and LED Controller	University of Groningen	Z-o1	Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies.
Motorized Stage	Standa (Vilnius, Lithuania)	8MT175-50XYZ-8MR191-28	A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom.
Optical components	LINUS		Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002)
PC running MATLAB	University of Groningen		The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system
Power Supply (36V, 3.34A)	Standa (Vilnius, Lithuania)	PUP120-17	Dedicated power supply for the STANDA motor controllers
Soldering iron	various		Used for melting the wax
Stepper and DC Motor Controller	Standa (Vilnius, Lithuania)	8SMC4-USB-B9-B9	Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB
Finntip-61	Finnpipette Ky, Helsinki	FINNTIP-61, 200-1000μL	PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool	Max Wax		The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly
MATLAB	Mathworks, Natick, MA, USA	main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes.	Programming language used to implement the algorithms