אפיון סלמונלה טיפימוריום המושרה על ידי דלקת צפק ספטית בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של אלח דם מונובקטריאלי גראם שלילי במערכת מודל עכבר. המודל שימושי בחקירת תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות במהלך אלח דם.

Abstract

אלח דם הוא תגובה חיסונית של פונדקאי לא מווסת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים באתר מרוחק מזה של הזיהום או הנזק. נכון לעכשיו, המודלים הנפוצים של עכברים של אלח דם כוללים אנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), קשירת צקל וניקוב (CLP) ומערכות מודל לזיהום חד-בקטריאלי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקור את תגובות המארח במהלך דלקת הצפק הספיגה הנגרמת על ידי זיהום סלמונלה טיפימוריום בעכברים. ב. טיפימוריום, פתוגן תוך-תאי גראם-שלילי, גורם למחלה דמוית טיפוס בעכברים.

פרוטוקול זה מפרט את הכנת התרבית, אינדוקציה של דלקת צפק ספטית בעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית, ושיטות לחקר תגובות פונדקאיות סיסטמיות. יתר על כן, מוצגת הערכת נטל החיידקים באיברים שונים והניתוח הציטומטרי של הזרימה של מספרי נויטרופילים מוגברים בשטף הצפק. סלמונלה אלח דם הנגרם על ידי טיפימוריום בעכברים מוביל לעלייה בציטוקינים פרו-דלקתיים ולחדירה מהירה של נויטרופילים בחלל הצפק, מה שמוביל להישרדות נמוכה יותר.

כל שלב בפרוטוקול זה עבר אופטימיזציה, וכתוצאה מכך שכפול גבוה של הפתוגנזה של דלקת הצפק הספיגה. מודל זה שימושי לחקר תגובות אימונולוגיות במהלך אלח דם חיידקי, את התפקידים של גנים שונים בהתקדמות המחלה, ואת ההשפעות של תרופות כדי להחליש אלח דם.

Introduction

אלח דם מוגדר כתגובה דלקתית מערכתית ומערכתית לא מווסתת לפלישה מיקרוביאלית או נזק לרקמות, מה שמוביל לפגיעה באיברים המרוחקים ממקום ההדבקה או הנזק. הלם ספטי הוא תת-קבוצה של אלח דם המאופיינת בלחץ דם הנמשך במהלך החייאה נפחית, עם סיכון מוגבר באופן משמעותי לתמותה¹. הציבור הרחב נעשה מודע יותר להפרעה זו במהלך מגיפת COVID-19. למרות התמותה הגבוהה הקשורה אליו, נתונים אפידמיולוגיים מקיפים על הנטל העולמי של אלח דם חסרים בגלל המורכבות של האבחנה שלו. בשנת 2017 היו 48.9 מיליון מקרי מקרים של אלח דם ו-11 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם, המהווים 19.7% מכלל מקרי המוות בעולם². יתר על כן, מחקר על השכיחות המורחבת של זיהום ואלח דם קשור בחולי יחידות טיפול נמרץ מצא כי 62% מהבודדים החיוביים מהחולים היו אורגניזמים גראם שליליים³.

בתחילה, החקירות על אלח דם התמקדו בתיחום פתוגנזה מיקרוביאלית. עם זאת, הבנת "השערת הסכנה", המכתיבה כיצד המארח מבחין בין העצמי ללא-עצמי, הובילה להטיית מאזן חקר אלח הדם לעבר הבנת תגובת המארח לפתוגן פולש. המודלים הנפוצים של אלח דם בעכברים כוללים את מודל האנדוטוקסמיה המושרה על ידי ליפופוליסכריד (LPS), מודלים של אלח דם פולימיקרוביאלי, קשירת cecal ונקב (CLP) ומודלים של דלקת צפק מסוג stent scendens (CASP) של המעי הגס ומודלים של זיהום חד-בקטריאלי⁴.

תיקנו מערכת מודל עכבר על ידי גרימת אלח דם פריטוניאלי באמצעות סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כי סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי המחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה היא מערכתית, עם 100% תמותה בתוך 96 שעות לאחר ההדבקה. לכן, מודל זה מסייע בחקר תגובות הפונדקאי הדלקתיות והקטלניות. במודל זה, אלח דם מושרה על ידי הזרקה תוך-צפקית של 0.5 מיליון יחידות יוצרות מושבה (CFU) של סלמונלה טיפימוריום לתוך עכבר C57BL/6 בן 8-10 שבועות. זיהום סיסטמי יכול להיות מאושר על ידי הערכת נטל חיידקי איברים ~ 16 שעות לאחר ההדבקה. מאמר זה מדגים אלח דם של דלקת הצפק הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום בעכברים, מאפיין את השינויים הנובעים מכך בהרכב תאי הצפק, ומכמת את עומס החיידקים באיברים שונים.

Protocol

כל הניסויים באמצעות סלמונלה טיפימוריום נערכו במתקני ביו בטיחות ברמה 2 (BSL-2). יש להקפיד על שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE), להבטיח בטיחות ולעקוב אחר שיטות סילוק ביו-האזרד סטנדרטיות של BSL-2. כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים, IISc. עכברים גודלו והוחזקו במתקן המרכזי לבעלי חיים של IISc (מספר רישום: 48/1999/CPCSEA, מיום 1/3/1999), שאושר על ידי המשרד לאיכות הסביבה והיער, ממשלת הודו. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה למטרה ובקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים עם מספר ההיתר המאושר CAF/Ethics/797/2020.

הגדרת BSL2: דירוג BSL2 מייצג כי הסוכנים הביו-האזרדיים מהווים איום מתון על הסביבה ועל צוות המעבדה⁵.

1. הכנת תרבות של סלמונלה טיפימוריום         

1. הוסף 100 μL של סלמונלה טיפימוריום NCTC 12023 מלאי גליצרול ל 3 מ"ל של מרק לוריא ברטאני (LB). הדגירו את התרבות ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. פזרו 50 μL מתרבית הלילה שגדלה בציר LB על צלחת אגר סלמונלה שיגלה (SS) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-12 שעות. אחסנו את צלחת האגר של SS עם מושבות החיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים לפני ניסוי הזיהום in vivo .
3. בחרו מושבה בודדת מתוך צלחת האגר של האס-אס המפוספסת באמצעות מיקרוטיפ. פלטו את המיקרו-טייפ ל-3 מ"ל של מרק ותרבית LB ב-160 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס בלילה.
4. הוסיפו 0.1 מ"ל מתרבית החיידקים ל-50 מ"ל של ציר LB ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר ב-160 סל"ד למשך 3-4 שעות כדי להגיע לשלב הלוגריתמי של הצמיחה. דיללו את התרבות בפקטור של 2 באמצעות ציר LB.
   הערה: במהלך השלב הלוגריתמי, תאי החיידקים נמצאים במצב בריאותי הטוב ביותר שלהם והם מתחלקים באופן פעיל.
5. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבית באורך גל של 600 ננומטר של אור בספקטרופוטומטר או בקורא מיקרו-לוחיות. ברגע שה-OD מגיע ל-1.0, הכינו שני אליקוטים של 1 מ"ל של תרבית בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.
6. צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור עם 1 מ"ל של 1x PBS 2x. צנטריפוגה הצינורות ב 7,750 × גרם במשך 15 דקות.
7. בצעו החייאה של הכדור ב-0.5 מ"ל של 1x PBS בשני צינורות מיקרו-פוג' שונים של 1.5 מ"ל. שלב את המתלים משני הצינורות לצינור אחד של 1.5 מ"ל המכיל כעת כ-2 × 10⁸ יחידות יוצרות מושבה (CFU)/mL.
8. הכינו תרחיף של תאי חיידקים של 1 × 10⁶ CFU/mL על ידי דילול תמיסת מלאי זו.
   אזהרה: מטב את ה- CFU המתאים ל- OD בתנאי מעבדה ספציפיים כדי לקבוע את ה- CFU עבור OD 1.0 לפני תחילת הניסויים.

2. עכברים וזיהומים

1. ביתו זכר בן 8-10 שבועות C57BL/6 עכברים במשקל של כ-20 גרם בחדר האוויר הנקי של מתקן החיות במשך מספר ימים לצורך התאקלמות.
2. ביום ההדבקה, החזיקו את העכבר ביד אחת, נגבו את עור הבטן ב-70% אתנול ופרשו את הרגליים האחוריות לנגישות טובה יותר של דופן הבטן.
3. הזריקו 0.5 מ"ל של 1 × 10⁶ CFU/mL תרחיף חיידקי תוך-צפק בעזרת מזרק של 1 מ"ל. לכן, כל עכבר מקבל 5 × 10⁵ CFU. שליטה, עכברים לא נגועים מקבלים 0.5 מ"ל של PBS בלבד. לאחר ההדבקה, צלחת את התרבית כדי לבדוק את ה- CFU בפועל מוזרק, אשר עשוי לנוע בין 0.2-0.8 מיליון CFU / 0.5 מ"ל.
4. החזירו את העכברים לכלובים כפי שהוקצו.
5. הקרב את העכברים באמצעות חנק CO₂ ~ 12-18 שעות לאחר ההדבקה לקבלת התגובה הטובה ביותר. בדרך כלל, כל העכברים הנגועים מתים תוך 96 שעות. תחת כמה התערבויות ניסיוניות, חלק מהעכברים עשויים לשרוד. המתת עכברים אלה לאחר 96 שעות. כמו כן, המתת כל עכבר עם טמפרטורת גוף מתחת ל -33.2 מעלות צלזיוס ומצוקה חריפה בשעה 96 כנקודת קצה הומאנית.
   הערה: במודל זה, חלק מהעכברים עלולים להתחיל למות לאחר 12 שעות של הזרקת סלמונלה . לכן, תכננו ניסויים בצורה נכונה הכוללים מספר נקודות זמן.

3. הערכת CFU של איברים

1. להקריב את העכבר הנגוע על ידי חנק CO₂ , ולנגב את הבטן עם חתיכת כותנה טבולה ב 70% אתנול. חותכים את עור הבטן. עיין במאמר של ריי ודיטל לקבלת פרוטוקול וידאו כיצד לאסוף נוזל שטיפה פריטוניאלי⁶. חותכים לפתוח את חלל הצפק ולאסוף את האיברים המעניינים בצינורות מיקרופוגה. בנוסף, מכיוון שהדם בעכברים עם אלח דם נקרע במהירות והכמויות נמוכות, אספו אותו במהירות לאחר ההקרבה.
   הערה: סרטון זה מדגים את הספירה של CFU של איברים מהכבד כאשר הכבד עובר נזק היסטופתולוגי נרחב במודל זה של אלח דם.
2. חותכים חתיכה קטנה מהכבד ומניחים אותה בצינור מיקרופוגה.
   הערה: ניתן לאחסן זאת על קרח למשך 2-3 שעות לכל היותר לפני שתמשיך לשלב הבא.
3. שוקלים ומעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה. רצוי לחתוך חתיכות במשקל של כ-10-15 מ"ג להומוגניזציה נכונה. השתמש באיברים שלמים במקרה של קטנים יותר כגון בלוטות הלימפה המזנטריות (MLNs) או תימוס.
4. הוסיפו 0.5 מ"ל של 1x PBS לצינור והומוגניזציה של האיברים באמצעות הומוגנייזר ידני. ודא כי האיברים הם הומוגניים לחלוטין. התאם את עוצמת הקול ל- 1 מ"ל על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1x PBS.
5. צנטריפוגה את הצינורות ב 200 × g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
6. אספו את ה-supernatant לצינורות מיקרו-פוג'ים טריים והכינו דילולים של 1 × ¹⁰⁻¹ ו-10⁻² בצלחת של 96 בארות.
7. מורחים 50 μL של מדולל על צלחות אגר SS טריות ודגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
8. ספרו את מספר המושבות המופיעות בכל מצב ונרמלו את הנתונים עם משקל האיבר באמצעות משוואה (1):
   CFU/mg = (1)
   הערה: המספר 20 משמש בנוסחה להמרת המושבות לכל לוח ל- CFU / mL. מספר זה מגיע על ידי חלוקת 1 מ"ל בסכום של נפח נתון של התרבית המצופה - במקרה זה, 50 μL.
   לדוגמה, אם 100 מושבות נמצאות בצלחת אגר SS, שבה מתפשט 50 μL של 1 × ^10-1 דילול של איבר הומוגני במשקל 10 מ"ג, אז
   CFU/mg =

4. ניתוח ציטומטרי של זרימה של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בהפרשה פריטוניאלית

1. אסוף את תאי הצפק כפי שתוארו קודם לכן על ידי ריי ודיטל⁶.
2. יש להחיות את גלולת התאים מנוזל שטיפת הצפק ב-1 מ"ל של RPMI בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). ציין את מספרי התאים הכוללים בשטיפת הצפק באמצעות המוציטומטר. התאם את מספר התא כך שכל צינור יקבל 0.2-0.5 מיליון תאים.
   הערה: שטיפת פריטונאל בעכברים עם אלח דם עשויה להכיל RBCs, אשר כנראה מופיעים עקב דימום. הקפידו לא לכלול RBCs בעת ספירת תאי הצפק. במיקרוסקופ הבהיר, RBCs נראים קטנים בהרבה מתאי החיסון. אלה מופיעים כדיסקים שטוחים או סופגניות, עגולים, עם כניסה במרכז, אך לא חלולים. ניתן להוסיף שלב ל-LYSE RBCs⁷.
3. סובבו את התאים כלפי מטה ב-200 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים פי 1 עם 1x PBS קר. צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
4. חסום את קולטני ה-Fc ב-PECs באמצעות חוסם FcR (דילול של 1:400), שהוכן במאגר חסימה המורכב מ-5% FBS ו-0.02% נתרן אזיד ב-PBS. דגירה על קרח במשך 15 דקות.
5. צנטריפוגה התאים ב 200 × גרם ב 4 °C (64 °F) במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט. דיללו את הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום בעלי עניין בחסימת מאגר. השתמש בדילול של 1:500 של LY6G נגד עכברים כדי להכתים את הנויטרופילים.
   הערה: ניתן לזהות אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון גם באמצעות, לדוגמה, B220 נגד עכברים עבור תאי B, CD3 נגד עכבר עבור תאי T, ו- F4/80 נגד עכברים עבור מקרופאגים.
6. הדגירה של כ-0.2 מיליון תאים ב-200 μL של התמיסות המדוללות של נוגדנים בצינורות נפרדים. כבקרה שלילית, הניחו בצד צינור אחד בכל סוג פלואורואורוכרום עבור הבקרה הלא מוכתמת כדי לדגום את התאים עם 200 μL של חיץ חוסם ללא נוגדנים.
7. דגירו את הדגימות על הקרח במשך 45 דקות עם הקשה לסירוגין כל 15 דקות.
8. צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנאטנט. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך ~ 15 דקות בטמפרטורת החדר אם הם צריכים להיות מאוחסנים במשך מספר ימים. עם זאת, עדיף להשיג נתונים מדגימות מוכתמות טריות בציטומטר זרימה.
9. בצעו החייאה של התאים ב-200 μL של מאגר צביעת FACS (2% FBS ב-PBS). רכוש את הנתונים בציטומטר זרימה.

תוצאות

אפיון מפורט של התגובה החיסונית של המארח באמצעות מודל מסוים זה מוצג בפרסומים קודמים ^8,9. כמה תוצאות מייצגות של הפרוטוקול המתואר מתוארות בסעיף זה. מודל זה נועד לגרום לזיהום מערכתי של S. טיפימוריום על ידי הזרקה תוך-צפקית של תרבית החיידקים כדי לגרום לאלח דם. ?...

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה של גרימת צורה חמורה של אלח דם חיידקי על ידי הזרקה תוך צפקית של סלמונלה טיפימוריום. מודל זה הוא יתרון על פני אחרים כמו סלמונלה Typhimurium הוא פתוגן תוך תאי, ולכן, פתוגני מאוד, מחקה את המצב הרלוונטי מבחינה קלינית של אלח דם גראם שלילי. התוצאה של אלח דם של דלקת הצפק במודל זה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle	Beckton Dickinson, Singapore	303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Tarsons, USA	500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle	Beckton Dickinson, Spain	307758
50 mL Conical Flask	Tarsons, USA	441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube	Tarsons, USA	546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube	Tarsons, USA	546021
Cell spreader	VWR, USA	VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	HiMedia, Mumbai, India	TS1006
Ethanol	Merck	100983
FcR blocker	BD Biosciences	553142
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551460
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hand based Homogenizer	-	-
Hemocytometer (Neubauer counting chamber)	Rohem, India	I.S. 10269
Luria Bertani Broth	HiMedia, Mumbai, India	M1245
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petriplates	Tarsons, USA	460091
RPMI	Himedia, Mumbai, India	AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar	HiMedia, Mumbai, India	M108
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Equipments
Centrifuge	Kubota
Flow cytometer	BD FACSverse
Incubator	N-biotek
Spectrophotometer	Shimadzu
Weighing machine	Sartorius